海星皂苷對非酒精性脂肪肝大鼠肌肉胰島素信號通路的影響

陳 成，韓秀清，劉春花，李兆杰，薛長湖，王玉明

(1.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003； 2.中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院，廣東 深圳 518000)

海星皂苷對非酒精性脂肪肝大鼠肌肉胰島素信號通路的影響

陳 成1，韓秀清1，劉春花2，李兆杰1，薛長湖1，王玉明1

(1.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003； 2.中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院，廣東 深圳 518000)

目的 研究海星皂苷對乳清酸誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝大鼠肌肉胰島素信號通路的影響。方法 ♂ Wistar大鼠連續(xù)6周喂食1%乳清酸建立NAFLD(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)模型。將NAFLD模型大鼠隨機分為模型組(model group，Model)和海星皂苷組(starfish saponins group，Sfs)，分別喂食1%乳清酸飼料和添加含0.04%海星皂苷的1%乳清酸飼料。海星皂苷干預(yù)8周后，分別測定大鼠肝臟脂質(zhì)水平、肝功指標(biāo)以及肌肉胰島素信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)量。結(jié)果 海星皂苷明顯降低肝臟脂質(zhì)水平、改善肝功，并通過增強IRS-1/PI3K/Akt胰島素信號通路和上調(diào)GLUT4的表達(dá)來改善肌肉組織的胰島素抵抗，提高肌肉對葡萄糖的攝取。結(jié)論 海星皂苷能促進(jìn)肌肉組織胰島素信號通路的傳遞，從而改善乳清酸誘導(dǎo)NAFLD大鼠肌肉中胰島素信號傳遞受阻現(xiàn)象。

胰島素信號通路；肌肉；海星皂苷；葡萄糖；非酒精性脂肪肝；乳清酸

非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種常見的慢性肝臟疾病，與代謝綜合征密切相關(guān)[1]。研究表明乳清酸能夠通過擾亂脂質(zhì)代謝誘導(dǎo)大鼠形成脂肪肝[2]。胰島素抵抗(insulin resistance，IR)是指機體胰島素作用的靶器官(肝臟、骨骼肌、脂肪組織等)對胰島素作用的敏感性下降，即正常劑量的胰島素產(chǎn)生低于其正常生物學(xué)效應(yīng)的一種狀態(tài)。IR在NAFLD發(fā)展過程中有著關(guān)鍵作用，幾乎所有的NAFLD患者都存在胰島素抑制內(nèi)源性葡萄糖生成能力降低，全身葡萄糖利用減少45%～50%等現(xiàn)象[3]。絕大多數(shù)IR是胰島素和胰島素受體結(jié)合后信號傳導(dǎo)過程發(fā)生障礙的結(jié)果[4]。骨骼肌是利用血糖的重要外周組織，是IR發(fā)生的主要部位，在維持體內(nèi)葡萄糖動態(tài)平衡中具有重要作用。肌肉組織中胰島素信號傳導(dǎo)通路任一位點的異常都可能阻礙葡萄糖的轉(zhuǎn)運，從而引起IR。海星皂苷是一種甾體皂苷，具有廣泛生理和藥理活性。本實驗通過長期喂食乳清酸誘導(dǎo)大鼠形成NAFLD，研究海星皂苷對NAFLD大鼠肌肉胰島素信號通路的影響，并對其機制進(jìn)行初步探究。

1 材料與方法

1.1 動物 ♂清潔級Wistar大鼠，體質(zhì)量(180±10) g，購自北京維通利華實驗動物公司。

1.2 主要試劑 乳清酸(日本和光純藥工業(yè)株式會社)；AB-8型大孔樹脂(南開大學(xué)化工廠)；甘油三酯(triglyceride，TG)測定試劑盒、葡萄糖測定試劑盒(北京中生北控生物科技股份有限公司)；胰島素測定試劑盒(德國BD公司)；谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)測定試劑盒、谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(gamma-glutamyl transferase，GGT)測定試劑盒、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate transaminase，AST)測定試劑盒、糖原測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；RIPA 蛋白裂解液(碧云天研究所)；ECL 發(fā)光試劑(普利萊基因技術(shù)有限公司)；IRS1多克隆抗體、p-IRS1(Ser307)多克隆抗體、PI3K多克隆抗體、AKT多克隆抗體、p-AKT單克隆抗體、GLUT4單克隆抗體、GSK3單克隆抗體、p-GSK3單克隆抗體、β-actin 單克隆抗體、Na,K-ATPase單克隆抗體(Cell signaling technology 公司)；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3 儀器與設(shè)備 Model680型酶標(biāo)儀(美國Bio Rad公司)；UV-2550型分光光度計(日本島津公司)；ST-Ⅱ型半干轉(zhuǎn)移電泳槽(大連競邁生物科技有限公司)；CP100MX 型離心機(日本日立公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 海星皂苷的制備 參照張錚[5]的方法制備海星皂苷。具體步驟如下：稱取一定量的新鮮海星，加入體積分?jǐn)?shù)為0.95的乙醇浸提過夜得上清液，再加入體積分?jǐn)?shù)為0.60的乙醇溶液反復(fù)浸提2次，收集每次抽提所得上清液，減壓回收乙醇，得水溶液，然后過AB-8型大孔樹脂，依次用水和體積分?jǐn)?shù)為0.80的乙醇洗脫，收集體積分?jǐn)?shù)為0.80的乙醇洗脫液減壓濃縮，經(jīng)真空冷凍干燥后得海星皂苷。以海星皂苷純品作為標(biāo)準(zhǔn)對照，采用香草醛-硫酸法[6]測定所得海星皂苷的純度為80%。

Tab 1 Composition of experimental diet(g·kg-1)

1.4.2 實驗動物分組與喂養(yǎng) 適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后將Wistar大鼠按體重分為2組：正常對照組(Con，n=8)和乳清酸組(n=16)，分別喂食標(biāo)準(zhǔn)飼料和1%乳清酸飼料。6周后將乳清酸組隨機分為模型組(Model，n=8)和海星皂苷組(Sfs，n=8)，分別喂食1%乳清酸飼料和含有0.04%海星皂苷的1%乳清酸飼料，飼養(yǎng)8周。具體飼料配方見Tab 1。大鼠自由攝食及飲水，在室溫(23±2)℃、12 h/12 h明暗交替條件下喂養(yǎng)。飼料每日換新，并測定大鼠每日攝食量。于實驗結(jié)束前禁食12 h，自由飲水，經(jīng)乙醚麻醉后腹主動脈取血，取肝臟、肌肉等臟器組織稱重后于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 肝臟脂質(zhì)測定和血清理化指標(biāo)測定 參照Folch等[7]的方法，準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量肝臟，制成肝臟勻漿，按照試劑盒說明書測定肝臟TG含量。血液在室溫靜置30 min后，4℃下7 500 r·min-1離心15 min后取上層血清，按照試劑盒說明書測定AST、GGT和ALT。

1.4.4 葡萄糖耐受實驗 13周時，大鼠禁食不禁水10h后進(jìn)行葡萄糖耐受實驗，腹腔注射葡萄糖溶液(2 g·kg-1·bw)后0、0.5、1和2 h時進(jìn)行尾靜脈取血。血液于室溫靜置30 min后，4℃下7 500 r·min-1離心15min后取上清，按照試劑盒說明書測定血清葡萄糖水平。

1.4.5 空腹葡萄糖、胰島素、ISI測定 大鼠于實驗結(jié)束前禁食12h，自由飲水，經(jīng)乙醚麻醉后腹主動脈取血。血液在室溫靜置30 min后，4℃下7 500 r·min-1離心15min后取上層血清，按照試劑盒說明書測定葡萄糖和胰島素水平。并根據(jù)李光偉等[8]的方法，計算胰島素敏感指數(shù)(insulin sensitivity index，ISI)，分析時取其自然對數(shù)值。

1.4.6 肌糖原測定 實驗前根據(jù)組織重量計算堿液加入量，沸水浴30 min冷卻，加入蒸餾水制備成5%糖原檢測液。按照糖原試劑盒說明書操作。

1.4.7 蛋白表達(dá)量測定 取適量肌肉組織加入RIPA裂解液提取蛋白。蛋白濃度用BCA試劑盒測定。利用SDS-PAGE電泳對不同分子量蛋白進(jìn)行分離后通過半干轉(zhuǎn)膜的方法將蛋白樣品轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，并用BSA溶液進(jìn)行封閉。利用TBST對封閉后的PVDF膜進(jìn)行洗滌以去除多余封閉液。此后根據(jù)抗體說明書進(jìn)行一抗和經(jīng)HRP標(biāo)記的二抗孵育。最后，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯色，利用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照和灰度統(tǒng)計。

2 結(jié)果

2.1 大鼠攝食量、體重、臟器質(zhì)量變化 由Tab 2可知，各組大鼠在攝食期間的攝食量與體質(zhì)量增加量無明顯差異。模型組大鼠肝臟質(zhì)量明顯增加(P<0.01)。海星皂苷對大鼠肝臟質(zhì)量無明顯影響。

Tab 2 Chronic effects of starfish saponins on weight and liver weight in rats(n=8)

##P<0.01vscontrol

2.2 肝臟脂質(zhì)含量及肝功能酶學(xué)指標(biāo)變化 如Tab 3所示，模型組大鼠肝臟甘油三酯(TG)水平明顯升高(P<0.01)。與模型組相比，海星皂苷組大鼠肝臟TG水平降低41.20%(P<0.01)。模型組大鼠血清ALT、GGT、AST活性分別是對照組的2.92倍(P<0.01)、1.24倍(P<0.01)和4.13倍(P<0.05)，這表明模型組大鼠肝功能嚴(yán)重受損，實驗造模成功。海星皂苷明顯下調(diào)了血清ALT和GGT活性(P<0.05)，對AST活性無明顯調(diào)節(jié)作用。

2.3 葡萄糖耐受實驗 海星皂苷干預(yù)7周(喂食乳清酸13周)后，進(jìn)行葡萄糖耐受實驗。如Fig 1所示，腹腔注射葡萄糖1 h時，模型組大鼠血清葡萄糖水平明顯高于對照組(P<0.01)，表明了胰島素抵抗的存在。海星皂苷干預(yù)后，血清葡萄糖水平明顯下降(P<0.05)，與對照組大鼠的血清葡萄糖水平接近。

Tab 3 Chronic effects of starfish saponins on hepatic lipids and liver function indices in rats(n=8)

#P<0.05，##P<0.01vscontrol；*P<0.05，**P<0.01vsmodel

2.4 空腹葡萄糖、胰島素、ISI測定 如Tab 4所示，模型組大鼠的空腹血糖水平和空腹胰島素水平明顯高于正常組大鼠(P<0.05，P<0.01)，胰島素敏感指數(shù)明顯降低(P<0.01)，這進(jìn)一步表明模型組大鼠出現(xiàn)胰島素抵抗。海星皂苷干預(yù)后，胰島素敏感指數(shù)明顯上調(diào)(P<0.01)。

2.5 肌肉中胰島素通路相關(guān)蛋白表達(dá)量和肌糖原含量變化 胰島素受體底物(IRS1)是肌肉胰島素信號中關(guān)鍵轉(zhuǎn)導(dǎo)者。IRS1在Ser307的磷酸化程度增加會導(dǎo)致IRS1酪氨酸磷酸化和AKT磷酸化水平降低[9]?；罨蟮腎RS激活其下游的磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)-蛋白激酶B(PKB / AKT)，使葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4(GLUT4)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜上，增加葡萄糖的攝取。如Fig 2所示，模型組大鼠肌肉組織中PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)量明顯減少(P<0.01；P<0.05)，GLUT4轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜上的比例明顯降低(P<0.01)，這表明了模型組大鼠肌肉組織胰島素信號通路受損以及對葡萄糖的攝取減少。海星皂苷明顯下調(diào)p-IRS1(Ser307)的蛋白表達(dá)水平(P<0.01)，上調(diào)PI3K和p-AKT的蛋白表達(dá)水平(P<0.01；P<0.05)，并明顯增加GLUT4在細(xì)胞膜上的比例(P<0.05)。

Fig 1 Chronic effects of starfish saponins on IGTT in rats(n=8)

##P<0.01vscontrol;*P<0.05vsmodel

Tab 4 Chronic effects of starfish saponins on fasting plasma glucose,fasting insulin and insulin sensitivity index in rats(n=8)

#P<0.05，##P<0.01vscontrol；*P<0.05，**P<0.01vsmodel

Fig 2 Chronic effects of starfish saponins on muscle relevant protein expression and muscle glycogen content in rats(n=8)#P<0.05，##P<0.01vscontrol；*P<0.05，**P<0.01vsmodel

GSK-3β是胰島素作用的關(guān)鍵負(fù)性調(diào)節(jié)因子，它能夠磷酸化糖原合成酶進(jìn)而使其失活，使得血糖水平升高[10]。實驗結(jié)果表明喂食乳清酸14周后模型組大鼠GSK-3β磷酸化水平明顯增加(P<0.05)，海星皂苷的干預(yù)明顯下調(diào)GSK-3β的磷酸化水平(P<0.01)。但是如Fig 3所示，模型組與海星皂苷組的肌糖原含量無明顯變化。

Fig 3 Chronic effects of starfish saponins on muscle glycogen content in rats(n=8)

3 討論

IR是引起許多代謝疾病如2型糖尿病、脂肪肝、動脈粥樣硬化的共同生理病理基礎(chǔ)[11]。IR在NAFLD 的“二次打擊”學(xué)說中處于重要環(huán)節(jié)——機體發(fā)生IR時會使得肝臟中的脂肪過度蓄積，進(jìn)而發(fā)生脂肪肝[12]。肌肉組織通過對葡萄糖的攝取和糖原的分解來維持機體的糖代謝[13]，是外周胰島素抵抗發(fā)生的主要靶位。研究表明[14-15]，肌肉胰島素抵抗發(fā)生在代謝異常的早期階段，并對NAFLD的發(fā)展有重要作用。本實驗探究了海星皂苷對乳清酸誘導(dǎo)NAFLD大鼠肌肉胰島素信號通路的影響。實驗結(jié)果表明：海星皂苷可通過增強胰島素信號通路來改善肌肉組織的胰島素抵抗，同時降低NAFLD大鼠肝臟脂質(zhì)水平，改善肝功能。

由糖耐實驗結(jié)果可知，攝食乳清酸后，模型組大鼠血清中葡萄糖水平明顯升高?？崭寡呛涂崭挂葝u素的測定結(jié)果以及胰島素敏感指數(shù)進(jìn)一步表明模型組大鼠出現(xiàn)胰島素抵抗。胰島素信號通路受阻是發(fā)生胰島素抵抗的主要原因。胰島素受體與胰島素結(jié)合后引起胰島素受體底物(IRS)發(fā)生磷酸化，從而激活PI3K/AKT這一主要胰島素信號傳遞通路。GLUT4是肌肉組織中糖代謝最重要的葡萄糖轉(zhuǎn)運載體[16]，主要存在于細(xì)胞內(nèi)，在運動刺激或胰島素刺激下會轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜上，以增加對葡萄糖的攝取。從實驗結(jié)果可知，海星皂苷能夠改變IRS-1/PI3K/Akt信號通路中主要蛋白的表達(dá)來改善胰島素信號通路，并上調(diào)GLUT4的蛋白水平，增加葡萄糖的攝取。糖原合成是胰島素刺激葡萄糖代謝的重要途徑。GSK3β的磷酸化會使得糖原合成酶(GS)活性降低，糖原合成減少。從實驗結(jié)果可知，海星皂苷的干預(yù)下調(diào)肌肉中p-GSK3β蛋白水平，但是對于肌糖原含量沒有明顯的調(diào)控作用。這可能是因為調(diào)節(jié)肌糖原合成的關(guān)鍵酶——GS——的活性還受到變構(gòu)作用的調(diào)節(jié)[17]。

海星皂苷具有抗病毒、抗腫瘤、抗炎癥、降血壓等多種生物活性[5,18]，但是有關(guān)海星皂苷對NAFLD和IR影響方面的報道較少。本實驗探究了海星皂苷對乳清酸誘導(dǎo)的NAFLD大鼠肌肉組織中IR的改善作用。綜上所述，海星皂苷通過激活肌肉組織中IRS-1/PI3K/Akt信號通路以及上調(diào)GLUT4的表達(dá)改善了乳清酸誘導(dǎo)的NAFLD大鼠肌肉胰島素抵抗現(xiàn)象，為海星皂苷的開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

(致謝：本實驗于中國海洋大學(xué)食品學(xué)院人類健康實驗室完成，感謝實驗室所提供的幫助與支持。)

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Effects of starfish saponins on insulin signaling pathway in muscle of NAFLD rats

CHEN Cheng1, HAN Xiu-qing1,LIU Chun-hua2, LI Zhao-jie1,XUE Chang-hu1, WANG Yu-ming1

(1.CollegeofFoodScienceandEngineering,OceanUniversityofChina,QingdaoShandong266003,China；2.ShenzhenInstitutesofAdvancedTechnology,ChineseAcademyofSciences,Shenzhen518000,China)

Aim To investigate the effects of starfish saponins(Sfs) on insulin signaling pathway in orotic acid-induced NAFLD rats. Methods 1% orotic acid was used to establish NAFLD model in male Wistar rats for six weeks. The NAFLD rats were randomly divided into two groups(eight rats in each group) and then fed with the corresponding diets: Model group(1% orotic acid)and Sfs group(1% orotic acid containing 0.04% starfish saponins). After starfish saponins feeding for 8 weeks, hepatic lipids content, liver function indices and relevant protein expression in muscle insulin signaling pathway were measured.Results Compared with model group, starfish saponins reduced hepatic lipids content and improved liver functions. In addition, it effectively ameliorated insulin resistance by improving insulin signaling pathway and improved glucose uptake in muscle.Conclusion The amelioration effect of starfish saponins on impaired insulin signaling pathway in muscle is observed in orotic acid-induced NAFLD rats.

insulin signaling pathway; muscle; starfish saponins; glucose; nonalcoholic fatty liver disease; orotic acid

時間：2017-3-13 8:38

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170324.1247.026.html

2016-12-15,

2017-01-20

國家自然科學(xué)基金資助項目(No 31571771)；新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計劃(No NCET-13-0534)

陳 成(1993-)，女，碩士生，研究方向：海洋生物活性物質(zhì),E-mail：hscc1119@163.com； 王玉明(1973-)，男，博士，教授，研究方向：食品營養(yǎng)學(xué),通訊作者,E-mail：wangyuming@ouc.edu.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.04.013

A

1001-1978(2017)04-0512-05

R-332；R284.1；R322.47；R347.8；R575.5；R977.15