H3N2亞型禽流感病毒及豬流感病毒感染人肺腺癌細胞后增殖的差異性變化

崔夢一，梁 佳, 黃曉量，勞婷婷，王伊玲，王 晉，高靈茜，樊曉暉

(廣西醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室，廣西南寧 530021)

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H3N2亞型禽流感病毒及豬流感病毒感染人肺腺癌細胞后增殖的差異性變化

崔夢一，梁 佳, 黃曉量，勞婷婷，王伊玲，王 晉，高靈茜，樊曉暉*

(廣西醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室，廣西南寧 530021)

人肺腺癌細胞A549被H3N2亞型禽流感病毒和豬流感病毒感染后，探討不同毒株跨種屬感染人呼吸道組織的可能性和趨勢性。通過觀察病毒感染A549細胞后的細胞病變(CPE)、血凝試驗(HA)和50%組織細胞感染量(TCID50)來比較不同毒株感染細胞后的復(fù)制差異和毒力改變,發(fā)現(xiàn)同一亞型不同來源的流感病毒對A549細胞感染和復(fù)制能力有較大差異，哺乳動物來源的病毒更有感染人呼吸道細胞的趨勢，SW/GX/NS2783/2010有潛在的感染人細胞的能力。感染過程中的細胞因子變化和病毒基因組組成特點是進一步研究的方向，應(yīng)重點關(guān)注具有跨種屬感染趨勢的流感病毒及其特殊分子決定簇的組成和特點。

H3N2亞型流感病毒；豬流感病毒；禽流感病毒；人肺腺癌細胞

流行性感冒病毒又稱流感病毒，根據(jù)宿主和感染特性不同，又分為人流感病毒、禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)和豬流感病毒(Swine influenza virus,SIV)等。其中禽流感病毒和豬流感病毒跨種屬感染人的威脅越發(fā)明顯，遺傳進化分析表明，H3N2亞型流感病毒在水禽中存在時間較長，但是檢出率一直偏低，檢出的H3N2亞型禽流感病毒的基因序列是否形成了變異重組型毒株，其跨種屬感染人的可能性如何，至今都是研究熱點。同樣的，豬流感病毒跨種屬感染人的情況也不容樂觀，最近出現(xiàn)的一次流感大流行發(fā)生在2009年，由新甲型H1N1流感病毒(2009 pandemic H1N1 virus，pdm/09)引起。pdm/09是由人流感病毒、禽流感和豬流感病毒經(jīng)過重配后形成的病毒[1-2]，它不僅能感染人，而且在人群流行之后很快回傳至豬群，與SIV發(fā)生重組[3-4]。前期研究中篩查出的H3N2亞型豬流感病毒已經(jīng)開始出現(xiàn)了重組的趨勢，并開始重組pdm/09內(nèi)部基因片段[5-6]。通過遺傳進化分析，發(fā)現(xiàn)廣西病毒株(SW/GX/NS2783/2010，2783)可能來自越南，而且已具備了感染人的能力[7]。但是關(guān)于2783毒株對于人細胞的感染能力目前還未知。

A549細胞來源于人的肺泡癌細胞，相關(guān)文獻表明[8]，A549己經(jīng)在體外進行了連續(xù)多年的增殖培養(yǎng)(多于1 000代)，多用于研究人的呼吸道上皮細胞生態(tài)[7]。而且A549細胞有著Ⅱ型肺泡上皮細胞的特征性形態(tài)。有研究證實，該細胞系可以作為研究Ⅱ型肺泡上皮細胞的標(biāo)準(zhǔn)細胞模型[9]。A549細胞的分子結(jié)構(gòu)以及感染后細胞因子的分泌更接近活體感染試驗，可以成為替代模擬人呼吸道感染的良好模型，彌補流感病毒研究過程中缺乏人體真實模型的缺點。

綜上所述，選用人肺腺癌上皮細胞A549細胞作為模擬人體呼吸道的模型，將分離得到的H3N2亞型禽流感病毒和豬流感病毒毒株接種感染細胞，通過血細胞凝集試驗(HA)和50%組織細胞感染量(TCID50)來檢測不同流感病毒對于A549細胞的感染能力，以及病毒的復(fù)制能力，進而進一步觀察和討論這些病毒對人呼吸道感染的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株與細胞 5株H3N2亞型禽流感病毒及豬流感病毒株(表1)，本實驗室從2004年開始與香港大學(xué)合作開展的華南流感病毒監(jiān)測網(wǎng)中采集，所有毒株分離后接種7日齡～9日齡無特定病原體級雞胚(SPF級雞胚)和狗腎細胞(MDCK細胞)，測序分析確定其型別后保存于-80℃。A549細胞，香港大學(xué)饋贈，傳代至第9代，由廣西醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)實驗室保存。

表1 5株不同H3N2亞型流感病毒毒株原始滴度及TCID50(MDCK)

1.1.2 主要試劑 MEM細胞培養(yǎng)基、FBS胎牛血清和TPCK-胰酶，Gibco公司產(chǎn)品；雙抗(青霉素-鏈霉素)，Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 5株H3N2亞型流感病毒在A549細胞中連續(xù)傳代 按標(biāo)準(zhǔn)操作復(fù)蘇A549細胞，并將細胞接種6孔板，每孔接種細胞液1 mL～1.5 mL，細胞濃度大約1×105個/mL。37℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，40倍倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)，選取長滿約80%的A549細胞進行操作，棄去細胞生長液，并用PBS清洗細胞3次，將1 MOI的病毒500 μL接種到細胞上，每個病毒接種2個復(fù)孔，另設(shè)一孔加入PBS作為陰性對照，置37℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)吸附2 h后清洗細胞，再補加2.5 mL病毒維持液(含有1 μg/mLTPCK-胰酶和1 000 μg/mL雙抗的MEM培養(yǎng)基)繼續(xù)培養(yǎng)，每日觀察接毒細胞病變情況。當(dāng)細胞病變(變圓并脫落)達80%～90%時，停止培養(yǎng)，吸取病毒培養(yǎng)液，4℃、8 000 r/min離心，收取的上清即為此代病毒生長液，置-80℃保存?zhèn)溆?。病毒液?80℃凍融1次后繼續(xù)接種A549細胞，如此重復(fù)，在A549連續(xù)傳代5次，每代不同時間點(0、12、24、36、48、60、72 h)取病毒生長液分別做血凝試驗(HA)和TCID50試驗。

1.2.2 血凝試驗(HA) 按照《全國流感監(jiān)測技術(shù)指南》進行，采用96孔板法，紅細胞凝集滴度的判定以出現(xiàn)完全凝集的最高稀釋為終點，以其稀釋度得導(dǎo)數(shù)為病毒的紅細胞凝集滴度。

1.2.3 5株不同H3N2亞型流感病毒株A549細胞生長動力學(xué)檢測 半數(shù)組織感染量(TCID50):調(diào)整A549細胞濃度為1×105個/mL，100 μL/孔接種至96孔細胞培養(yǎng)板中，體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。約24 h后細胞長至單層，密度為80%～90%。將在A549細胞上連續(xù)傳代的不同毒株相應(yīng)的病毒生長液接種96孔細胞培養(yǎng)板，分別檢測其在A549細胞中的TCID50，具體方法見www.virapur.com，利用血凝活性試驗記錄試驗結(jié)果，并用Karber法計算病毒滴度。

2 結(jié)果

2.1 細胞病變效應(yīng)(CPE)

在不同毒株感染A549細胞后的各時間點(0、12、24、36、48、60、72 h)觀察細胞的狀態(tài)，感染后24 h開始出現(xiàn)細胞病變，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，各毒株引起的細胞病變更加明顯，其中毒株2442和2783的CPE大于75%，毒株6708和7250達到50%～70%，毒株493亦達到了大于25%。正常A549細胞呈現(xiàn)上皮細胞形態(tài)，細胞呈梭形或者紡錘形，貼壁生長，出現(xiàn)細胞病變時可見細胞間隙變大，細胞固縮。48 h時各毒株所引起的病變和死亡細胞明顯增多，其中毒株2442的CPE最明顯，呈現(xiàn)出典型的細胞病變形態(tài)(圖1)。從圖1可以看出，不同病毒感染A549細胞后致使細胞發(fā)生病變的時間點不同，同一時間上細胞病變的程度也有較大差異。

2.2 血凝試驗(HA)結(jié)果

病毒在第1次接種A549后不同時間血凝試驗HA結(jié)果見圖2。由圖2可知，毒株2442、493和7250血凝效價最高值出現(xiàn)在感染后48 h，與CPE結(jié)果成正相關(guān)。說明病毒此時對細胞的殺傷力最強，病毒數(shù)量最高(活病毒和死病毒的總數(shù))。6708毒株的血凝效價隨著感染時間的增加呈下降趨勢，但其細胞的CPE卻基本可以達到70%～75%，說明HA滴度的數(shù)值與CPE的出現(xiàn)及程度并不完全相關(guān)，即有CPE不一定出現(xiàn)HA滴度，且CPE與HA滴度并不成相關(guān)性增長，毒株2783在48 h才出現(xiàn)血凝現(xiàn)象，即出現(xiàn)HA滴度。在24 h與36 h時，HA結(jié)果均呈陰性，進一步驗證HA滴度與CPE的相關(guān)性不強。

2.3 半數(shù)組織感染(TCID50)結(jié)果

493.DK/ST/493/2008;2442.DK/ST/2442/2009;2783.SW/GX/NS2783/2010;6708.DK/ST/6708/2010;7250.DK/ST/7250/2008;Normal.正常細胞對照

圖2 5株流感病毒在A549細胞中不同時段的HA滴度

由圖3可見，毒株2422、6708和2783的TCID50隨著感染時間延長有遞減趨勢，而且與24 h組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果顯示，這3種毒株感染人肺腺癌細胞A549的毒力伴隨著時間增加而逐漸增強。此外，毒株7250感染的TCID50值則表現(xiàn)出另外一種情況，其結(jié)果伴隨時間增加而遞增，而且48 h組和72 h組與24 h組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。由圖4可知，病毒在A549細胞中的增殖過程中，毒株2442在感染24 h TCID50出現(xiàn)峰值，說明在此時其毒力最強，而毒株2783則是在感染48 h時出現(xiàn)峰值，可見不同病毒感染后毒力達到最強的時間不同。

圖3 病毒感染細胞后不同時段的TCID50

圖4 5株流感病毒分別感染A549細胞后不同時段的TCID50均值

2.4 493與2783感染A549的比較TCID50結(jié)果

感染試驗中發(fā)現(xiàn)，493和2783的感染情況出現(xiàn)特殊的變化，其中493的感染試驗中，發(fā)現(xiàn)其第1代的復(fù)制能力和感染能力都較強，但是第1代以后便失去了復(fù)制和感染能力(表2)。而2783則出現(xiàn)不同變化，前兩代均不能較好的復(fù)制增殖，但從第3代開始，出現(xiàn)了適應(yīng)性的感染變化，推測出現(xiàn)了有利于跨種屬感染的點突變。

3 討論

表2 493與2783兩株流感病毒陰性感染結(jié)果(HA和TCID50)比較

注：“-”表示結(jié)果為陰性。

Note："-"Means negative.

甲型流感病毒可從人類和各種動物(包括禽類、馬、豬、海洋哺乳動物海豹和鯨、貓科類動物貓和老虎等)中分離出[3,6,10-11]。但禽流感病毒在靈長類動物宿主增殖、復(fù)制效率極低，反之亦然。其主要原因為受體結(jié)合特異性限制，流感病毒通過其表面 HA與宿主細胞表面唾液酸受體特異性結(jié)合而感染宿主，禽流感病毒與唾液酸α-2，3半乳糖(Gal)受體結(jié)合，而人流感病毒與唾液酸α-2，6Gal受體結(jié)合[12-14]。一般認為，水禽類宿主腸道上皮僅存在唾液酸α-2，3Gal受體[14]，人氣管上皮僅存在唾液酸α-2，6Gal受體[15]，故禽流感病毒很難跨種屬傳遞直接傳染給人；反之，人流感病毒也不能直接感染禽類，禽流感病毒直接傳遞給人極其罕見。1997年，隨著H5N1亞型高致病禽流感病毒直接從禽類傳播給人，這種情況發(fā)生了變化。發(fā)生于1968年H3N2亞型的中國香港大流感，是由源自禽類HA和PB1基因節(jié)段和其他人流感病毒基因節(jié)段組成[8]，新表面抗原的獲得使這些病毒逃避了人的免疫反應(yīng)而形成大流行[10]。2009年由新甲型H1N1流感病毒引起的流感世界大流行，更是將新現(xiàn)重組流感病毒的跨種屬感染能力推向新的高峰，因此對于新現(xiàn)重組病毒跨種屬感染人呼吸道的能力和適應(yīng)性變化成為研究重點。本試驗主要采用觀察CPE及HA和TCID50的方法來觀察不同禽流感病毒及豬流感病毒的H3N2亞型對A549細胞的感染情況，并比較感染后復(fù)制能力的變化。這3種方法互相彌補，從細胞形態(tài)、蛋白功能、血清學(xué)等方面綜合評價病毒的感染能力。

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在5株不同的H3N2亞型流感病毒中，除毒株493外均能在A549細胞中增殖，毒株2442和7250在A549細胞上增殖的血凝效價逐漸增高，均達到64～128，而毒株6708則逐漸降低到1∶8，毒株2783的血凝效價出現(xiàn)較晚但有不斷升高的趨勢。比較明顯的顯示出不同流感病毒在A549細胞中的感染增殖能力有較大區(qū)別。有的病毒在逐步適應(yīng)該細胞，有適應(yīng)性感染人呼吸道細胞的趨勢；而一些病毒則表現(xiàn)出對該細胞的非適應(yīng)性感染，提示其感染人呼吸道的能力可能有限。毒株2442、7250、2783、6708在A549細胞中增殖過程中均產(chǎn)生明顯的CPE，其中毒株2442最明顯，而493未出現(xiàn)明顯的細胞病變，且血凝效價呈陰性(雖在72 h時出現(xiàn)了較低的HA滴度，但不排除為微量感染或者污染導(dǎo)致，結(jié)合HA相對粗放的檢測能力，基本不能認為其在A549細胞中存在有效的復(fù)制和感染)，說明其在A549細胞的復(fù)制和增殖能力較弱。復(fù)制能力的差異可能是與病毒識別特異性受體有關(guān)，不同病毒對于A549細胞的容量性感染能力有差異，可能與A549細胞中的唾液酸α-2，3Gal受體和唾液酸α-2，6Gal受體的分布及數(shù)量差別有關(guān)[16]。一般來講，由于A549細胞中的唾液酸α-2，3Gal受體數(shù)量要多于唾液酸α-2，6Gal受體，所以禽類病毒相對更容易感染A549細胞，但不同禽類病毒的感染能力也有差別(毒株493幾乎不能在A549細胞中復(fù)制增殖)，提示流感病毒跨種屬傳播不僅依賴于不同流感病毒(人流感病毒、禽流感病毒、豬流感病毒)的重組[17]，而且其自身在宿主內(nèi)復(fù)制過程中其潛在的變異也可能起了重要作用，如結(jié)構(gòu)蛋白氨基酸位點的突變、病毒與非特異性免疫機制的相互作用以及和宿主間的接觸方式和程度等等，但這仍需進一步試驗證實。值得注意的是豬流感病毒2783的HA滴度及TCID50均顯示其在A549細胞中復(fù)制擴增的病毒數(shù)量出現(xiàn)逐步適應(yīng)的過程，說明該病毒有傾向結(jié)合人呼吸道細胞分布較廣的唾液酸α-2，6Gal受體，出現(xiàn)進一步感染人的能力和趨勢。除此，流感病毒只有當(dāng)其血凝素(HA)為裂解狀態(tài)時，其病毒顆粒才具有感染性，HA能否被蛋白酶裂解為HA1和HA2是病毒感染細胞的必要條件，但是病毒自身并不具備裂解HA的蛋白酶，是在宿主細胞的蛋白酶的作用下裂解。因此宿主細胞A549是否有裂解5種不同H3N2亞型病毒株HA的蛋白酶以及其裂解的能力的強弱，又成了影響病毒復(fù)制增殖的一個原因。

毒株493和2783出現(xiàn)的不同感染情況，可能是由于原始毒株是在MDCK細胞中擴增的，而大量的研究證明，MDCK是流感病毒的易感細胞，所以毒株在MDCK細胞中的復(fù)制能力和感染能力均相對較好，故第1代毒株493仍保存著復(fù)制能力和感染能力，而在接下來的傳代中，推測A549細胞通過分泌一系列的細胞因子影響該毒株的復(fù)制和感染能力，導(dǎo)致第1代以后的HA和TCID50都呈現(xiàn)出陰性結(jié)果。而毒株2783的適應(yīng)性感染能力的增強，除了體現(xiàn)為不同病毒復(fù)制能力和復(fù)制峰值不同，更加確認病毒的復(fù)制和跨種屬感染能力可能與病毒的某些特殊分子位點有關(guān)，導(dǎo)致蛋白合成時間不同。而毒株2442雖能在A549細胞中有效的復(fù)制，但毒力卻呈下降趨勢，對A549的適應(yīng)能力較弱。毒株6708則在感染細胞的過程中保持相對穩(wěn)定的感染能力和復(fù)制能力。

綜上所述，同一亞型的不同流感病毒對人肺腺癌細胞A549的感染能力不同，其在細胞中的復(fù)制能力有顯著差異，提示不同病毒可能感染人呼吸道的能力也有很大不同，同一病毒感染后不同時段的毒力和產(chǎn)生活病毒的復(fù)制轉(zhuǎn)錄能力也有差別。A549細胞在作為臨床感染活體試驗的替代品有一定的意義，分析不同流感病毒對該細胞的感染能力和復(fù)制趨勢的不同除了細胞耐受和易感的因素之外，還需要關(guān)注病毒刺激細胞后一些細胞因子的變化，以及病毒本身基因組的組成和特殊分子位點復(fù)制表達的情況，這些研究方向?qū)⒊蔀榱鞲胁《究绶N屬感染的潛在熱點，以及基礎(chǔ)研究中病毒感染后免疫調(diào)節(jié)機制的重要組成部分。

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Replication Diversity of H3N2 Avian Influenza Virus and Swine Influenza Virus after Infecting A549 Cells

CUI Meng-yi,LIANG Jia,HUANG Xiao-liang,LAO Ting-ting,WANG Yi-ling,WANG Jin,GAO Ling-xi，F(xiàn)AN Xiao-hui

(DepartmentofMicrobiology,GuangxiMedicalUniversity,Nanning,Guangxi,530021,China)

To discuss the possibility and trend of the infection in human respiratory tissues with different strains of H3N2 influenza virus,CPE,HA and TCID50were compared after A549 cells were infected with the H3N2 avian influenza virus and swine influenza virus.The results showed that the infection and replication abilities of different sources of H3N2 viruses had more diversities.Mammal-origin viruses had more tendencies to infect the human respiratory tract cells,SW/GX/NS2783/2010 had the potential ability to infect humans.Further studies are needed to explore the characteristics and composition of viral genome and the changes of cytokines in the infection process,especially some special molecular determinants of influenza virus.

H3N2 influenza virus;Swine influenza virus;Avian influenza virus;A549 cell

2016-09-13

廣西研究生教育創(chuàng)新計劃項目(YCBZ2014027)；廣西醫(yī)科大學(xué)青年科學(xué)基金項目(GXMUYSF201525)

崔夢一(1990-)，女，陜西西安人，碩士，主要從事病毒分子生物學(xué)研究。

S852.659.5

A

1007-5038(2017)04-0035-06

*通訊作者