嗜肺軍團(tuán)菌分子檢測(cè)最新進(jìn)展

林韻，肖曉臻，肖賢聲，陸勇軍

1.中山大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275；2.廣州市金潤(rùn)環(huán)?？萍加邢薰?，廣東 廣州 510726

嗜肺軍團(tuán)菌分子檢測(cè)最新進(jìn)展

林韻1，肖曉臻2，肖賢聲2，陸勇軍1

1.中山大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275；2.廣州市金潤(rùn)環(huán)?？萍加邢薰?，廣東 廣州 510726

嗜肺軍團(tuán)菌是軍團(tuán)病最主要的致病原，在人工水體或空調(diào)冷卻系統(tǒng)中多有存在，是影響公眾健康的一大隱患。能否準(zhǔn)確高效地檢測(cè)嗜肺軍團(tuán)菌，對(duì)軍團(tuán)病的防控具有重要意義。分子生物學(xué)技術(shù)多具有快速、簡(jiǎn)便、特異、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，近年越來(lái)越多地應(yīng)用于嗜肺軍團(tuán)菌的檢測(cè)。本文簡(jiǎn)要綜述了嗜肺軍團(tuán)菌分子檢測(cè)的最新進(jìn)展，介紹了PCR及其衍生技術(shù)、核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、基因分型、探針雜交及其相關(guān)技術(shù)，以及新一代測(cè)序在嗜肺軍團(tuán)菌分子檢測(cè)中的應(yīng)用，并簡(jiǎn)單討論了嗜肺軍團(tuán)菌檢測(cè)存在的問(wèn)題，對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌分子檢測(cè)的前景進(jìn)行了展望。

嗜肺軍團(tuán)菌；分子檢測(cè)；核酸技術(shù)

軍團(tuán)菌屬細(xì)菌（Legionellasp.）是一類革蘭陰性菌，廣泛存在于天然淡水或人工水體中。該屬的許多種類一旦以氣溶膠的方式被易感人群吸入肺中，即有可能在肺泡中繁殖，并導(dǎo)致軍團(tuán)?。╨egionellosis或 Legionnaires'disease，LD）。軍團(tuán)病可分為龐蒂亞克熱（Pontiac fever）和軍團(tuán)菌肺炎（Legionnaires pneumonia），前者是一種自限性流感樣疾病，后者按嚴(yán)重程度從輕微咳嗽到快速致命的肺炎不等[1]。

嗜肺軍團(tuán)菌（L.pneumophila）是軍團(tuán)病最主要的致病原。1976年，美國(guó)費(fèi)城召開(kāi)的退伍軍人大會(huì)上暴發(fā)了一場(chǎng)大規(guī)模感染，221人出現(xiàn)非典型肺炎癥狀，34人死亡；次年分離出致病菌株，即嗜肺軍團(tuán)菌[2-3]。此后，軍團(tuán)菌病在世界各地時(shí)有暴發(fā)流行，我國(guó)也于1982年首次報(bào)道了軍團(tuán)菌病的臨床病例[4]。研究表明，軍團(tuán)菌肺炎暴發(fā)的首要風(fēng)險(xiǎn)來(lái)自中央空調(diào)冷卻塔和供水系統(tǒng)[1]。我國(guó)衛(wèi)生部于2012年發(fā)布的《公共場(chǎng)所集中空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)衛(wèi)生規(guī)范》中明確指出，集中空調(diào)系統(tǒng)冷卻水和冷凝水中不得檢出嗜肺軍團(tuán)菌[5]。隨著我國(guó)城市化水平的提高，空調(diào)及供水系統(tǒng)普及，嗜肺軍團(tuán)菌的檢測(cè)對(duì)預(yù)防軍團(tuán)菌病的暴發(fā)和流行無(wú)疑具有重要意義。

自軍團(tuán)菌病于1977被報(bào)道以來(lái)，環(huán)境中嗜肺軍團(tuán)菌的檢測(cè)就受到極大的重視，各種檢測(cè)方法也不斷出現(xiàn)。傳統(tǒng)的嗜肺軍團(tuán)菌檢測(cè)方法有分離培養(yǎng)、血清抗體檢測(cè)、尿抗原檢測(cè)等。細(xì)菌培養(yǎng)法是檢測(cè)嗜肺軍團(tuán)菌的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但其生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)豐富，耗時(shí)長(zhǎng)，檢測(cè)成本高且效率低下；血清學(xué)檢測(cè)則存在滯后性，缺乏早期診斷意義；尿抗原檢測(cè)對(duì)血清型1型（LP1）以外的嗜肺軍團(tuán)菌敏感性較低[6]。近年發(fā)展的分子生物學(xué)技術(shù)以其快速、簡(jiǎn)便、特異、敏感等優(yōu)點(diǎn)，已在嗜肺軍團(tuán)菌檢測(cè)及軍團(tuán)病快速診斷方面占有一席之地。

分子生物學(xué)針對(duì)生物大分子，如DNA、RNA、蛋白質(zhì)等進(jìn)行研究。應(yīng)用蛋白質(zhì)技術(shù)對(duì)病原微生物進(jìn)行檢測(cè)多與抗體相關(guān)，一般歸類于免疫學(xué)方法，在此不做贅述。隨著基因組學(xué)研究和高通量測(cè)序等技術(shù)的不斷進(jìn)步，嗜肺軍團(tuán)菌的核酸分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)也得到了長(zhǎng)足發(fā)展。現(xiàn)就分子生物學(xué)核酸技術(shù)在嗜肺軍團(tuán)菌檢測(cè)中應(yīng)用的最新進(jìn)展做一概述。

1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)及其衍生技術(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是一種由DNA聚合酶催化的特定序列體外擴(kuò)增技術(shù)。對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌來(lái)說(shuō)，常用的檢測(cè)靶標(biāo)為mip（macrophage infectivity potentiator，巨噬細(xì)胞感染力增強(qiáng)因子）基因和16S rRNA基因。前者為嗜肺軍團(tuán)菌所特有，后者可用于分辨軍團(tuán)菌屬。Yong等認(rèn)為，隨著科學(xué)家對(duì)軍團(tuán)菌基因組研究的加深，將會(huì)出現(xiàn)更多新的分子靶標(biāo)，使嗜肺軍團(tuán)菌的檢測(cè)更為精確[7]。

PCR作為一種常規(guī)、可靠的核酸擴(kuò)增技術(shù)，常與其他分子生物學(xué)技術(shù)手段結(jié)合使用，如基因分型（genotyping）、探針雜交（probe hybridization）等。PCR也發(fā)展出了一系列衍生技術(shù)，下面簡(jiǎn)述2類應(yīng)用較多的技術(shù)。

1.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。qPCR是除了細(xì)菌培養(yǎng)法外惟一一項(xiàng)寫(xiě)入ISO技術(shù)規(guī)范的軍團(tuán)菌屬和/或嗜肺軍團(tuán)菌檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)[8]。Omiccioli等以34株軍團(tuán)菌和16株非軍團(tuán)菌為材料進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)這一方法進(jìn)行了確認(rèn)；并認(rèn)為在軍團(tuán)菌檢測(cè)中，qPCR能夠取代培養(yǎng)法而不僅僅是作為替代選項(xiàng)[9]。

1.2 多重PCR

多重PCR（multiplex PCR）是指用多對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增不同的DNA序列，可同時(shí)檢測(cè)出多種病原微生物。Calvo等運(yùn)用多重PCR從阿米巴體內(nèi)同時(shí)檢測(cè)包括嗜肺軍團(tuán)菌在內(nèi)的5種病原菌[10]；Cao等以O(shè)抗原基因?yàn)榘袠?biāo)，運(yùn)用多重PCR成功分辨出嗜肺軍團(tuán)菌的6種血清型[11]。

2 核酸等溫?cái)U(kuò)增

核酸等溫?cái)U(kuò)增（isothermal nucleic acid ampli?fication）技術(shù)能在某一特定溫度下擴(kuò)增核酸，因而擺脫了對(duì)熱循環(huán)儀的依賴，具備臨床或現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)及基層推廣的潛力。核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的種類很多，如以RNA為模板的依賴于核酸序列的擴(kuò)增（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）、模擬DNA自然復(fù)制過(guò)程的依賴解旋酶的等溫?cái)U(kuò)增（helicase-dependent amplification，HDA）、模擬微生物環(huán)狀DNA復(fù)制過(guò)程的滾環(huán)擴(kuò)增（rolling circle amplification，RCA）、利用具有鏈置換活性的DNA聚合酶的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loopmediated isothermal amplification，LAMP）、利用限制性內(nèi)切酶的鏈替代擴(kuò)增（strand displacement amplification，SDA）等[12]。

核酸等溫?cái)U(kuò)增已被運(yùn)用到嗜肺軍團(tuán)菌的檢測(cè)中。Lu等運(yùn)用LAMP法快速檢測(cè)出嗜肺軍團(tuán)菌與非嗜肺軍團(tuán)菌[13]；筆者也成功地以IVB型分泌系統(tǒng)的基因?yàn)榘袠?biāo)，用LAMP法檢測(cè)了嗜肺軍團(tuán)菌（論文待發(fā)表）。市面上已存在專門的軍團(tuán)菌等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，如日本榮研化學(xué)株式會(huì)社的“朗報(bào)（LAMP）”軍團(tuán)菌核酸檢測(cè)試劑盒；國(guó)內(nèi)也有生物公司，如廣州華峰生物科技有限公司、廣州迪澳生物科技有限公司等開(kāi)發(fā)出類似產(chǎn)品。

3 基因分型

基因分型是指將待測(cè)個(gè)體的DNA序列經(jīng)生物學(xué)方法處理后，再與已知個(gè)體的基因型進(jìn)行對(duì)比分析的技術(shù)。基因分型常用于微生物領(lǐng)域，尤其是病原微生物的監(jiān)測(cè)。傳統(tǒng)的基因分型技術(shù)有隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（random amplified poly?morphic DNA，RAPD）、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）等，須通過(guò)觀察電泳圖譜判定結(jié)果，存在一定的主觀性。目前嗜肺軍團(tuán)菌基因分型的“金標(biāo)準(zhǔn)”是基于測(cè)序的分型法（se?quence-based typing，SBT）[14]，可直接做序列對(duì)比，避免了這一缺陷。Bianchi等運(yùn)用SBT分析了2003～2012年29個(gè)臨床和環(huán)境樣本分離得到的嗜肺軍團(tuán)菌，找到了樣本間的聯(lián)系，證明對(duì)環(huán)境株的定期采樣分析對(duì)軍團(tuán)病暴發(fā)流行的防控有重要作用[15]。

4 探針雜交及其相關(guān)技術(shù)

4.1 探針雜交

雜交探針（hybridization probe）是一小段帶有可檢測(cè)標(biāo)記的核酸片段，可檢測(cè)樣品中是否存在與之互補(bǔ)的靶序列。核酸分子探針易于合成和修飾，且具有較高的靈敏度和選擇性[16]，因此被廣泛用于病原微生物的檢測(cè)。Siegrist等運(yùn)用夾心雜交法（sandwich hybridization），用2種不同標(biāo)記的探針檢測(cè)軍團(tuán)菌的rRNA，39份軍團(tuán)菌陽(yáng)性水樣的分析結(jié)果與ISO 11731（GVPC和BCYE瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)）的測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著差異[17]。

4.2 DNA微陣列

將大量核酸探針按一定順序以點(diǎn)狀固定在固體支持物（玻片或尼龍膜）上，即為DNA微陣列（DNA microarray），也叫DNA芯片、基因芯片或生物芯片。這一方法快速、簡(jiǎn)便、精準(zhǔn)、經(jīng)濟(jì)，商業(yè)化潛力大[18]，目前已見(jiàn)于軍團(tuán)菌的檢測(cè)中。Z·ak等運(yùn)用小型DNA微陣列識(shí)別出嗜肺軍團(tuán)菌66個(gè)毒力基因，并用于環(huán)境株的分析[19]。

4.3 生物傳感器

生物傳感器（biosensor）是一種由生物敏感材料制成的識(shí)別元件（如探針）和物理化學(xué)檢測(cè)器組成的檢測(cè)裝置。這一系統(tǒng)特異、靈敏，可信度高，可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，操作簡(jiǎn)便[20]，廣泛應(yīng)用于環(huán)境、食品、醫(yī)療等領(lǐng)域。Rai等用以納米多孔氧化鋁薄膜為基礎(chǔ)的無(wú)標(biāo)記電化學(xué)DNA生物傳感器檢測(cè)出最低檢測(cè)限（LOD）為3.1×10-13mol/L的嗜肺軍團(tuán)菌，且能從中分辨出1個(gè)及3個(gè)堿基錯(cuò)配[21]。

5 新一代測(cè)序

新一代測(cè)序（next generation sequencing，NGS），也叫高通量測(cè)序（high-throughput sequenc?ing，HTS），能一次對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條核酸分子進(jìn)行序列測(cè)定，大大減少了測(cè)序所需的時(shí)間和費(fèi)用，使得將測(cè)序用于流行病實(shí)時(shí)監(jiān)控分析成為可能。在2013年澳大利亞一所大型醫(yī)院暴發(fā)的軍團(tuán)病中，SBT與毒力基因分析均無(wú)法分辨出致病菌株。Graham等運(yùn)用全基因組測(cè)序，從9株嗜肺軍團(tuán)菌血清型1型菌株中成功地找到了致病菌株，并發(fā)現(xiàn)了它與2011年同一所醫(yī)院的一個(gè)軍團(tuán)病病例的聯(lián)系[22]。除此之外，測(cè)序提供了大量高質(zhì)量的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)，使嗜肺軍團(tuán)菌的研究更為細(xì)致與深入。

6 結(jié)語(yǔ)

分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)適用性強(qiáng)，易于推廣，目前已應(yīng)用到多種病原微生物檢測(cè)中[23]。分子檢測(cè)多具有簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，在實(shí)時(shí)監(jiān)控和及時(shí)預(yù)警上具有很大的優(yōu)勢(shì)。因此，嗜肺軍團(tuán)菌分子檢測(cè)的發(fā)展與應(yīng)用對(duì)軍團(tuán)病的防控具有重要意義。

分子檢測(cè)多以樣品中的DNA為靶標(biāo)，亦即無(wú)論樣品中的嗜肺軍團(tuán)菌是否存活均可得到陽(yáng)性結(jié)果，使得分子檢測(cè)與培養(yǎng)法相比可能存在假陽(yáng)性。當(dāng)然，已有研究表明，DNA提取前用氮溴化乙錠（ethidium monoazide，EMA）和疊氮溴化丙錠（propidium monoazide，PMA）進(jìn)行預(yù)處理后，可以只擴(kuò)增活細(xì)胞的基因[24]。

值得一提的是，冷卻塔水、自來(lái)水等人工水體屬寡營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，且多處于低溫狀態(tài)或含有消毒劑，在此環(huán)境下嗜肺軍團(tuán)菌會(huì)進(jìn)入“活的不可培養(yǎng)狀態(tài)（viable but non culturable state，VBNC狀態(tài)）”而無(wú)法在常規(guī)培養(yǎng)基上培養(yǎng)檢出。目前并沒(méi)有VBNC狀態(tài)的軍團(tuán)菌能在人類細(xì)胞或哺乳動(dòng)物模型中復(fù)蘇的案例，然而也沒(méi)有研究表明能完全排除VBNC狀態(tài)的軍團(tuán)菌致病的可能性[25]。軍團(tuán)菌檢測(cè)的復(fù)雜性使我們認(rèn)識(shí)到，分子檢測(cè)法并不能完全取代傳統(tǒng)的檢測(cè)手段；根據(jù)需要選擇相應(yīng)的檢測(cè)方法，或幾種檢測(cè)手段組合使用，才能獲得最佳效果。

分子生物學(xué)是一門發(fā)展迅速的學(xué)科。我們有理由相信，現(xiàn)有的嗜肺軍團(tuán)菌分子生物學(xué)檢測(cè)手段將會(huì)不斷完善；同時(shí)，也會(huì)有更多新的、優(yōu)秀的技術(shù)涌現(xiàn)，使包括軍團(tuán)菌在內(nèi)的病原微生物的檢測(cè)更加準(zhǔn)確、特異與靈敏。

[1]Bartram J,Chartier Y,Lee J V,et al.Legionella and the prevention of legionellosis[M]. Geneva: World Health Organization,2007.

[2]Fraser D W,Tsai T R,Orenstein W,et al.Legion?naires'disease:description of an epidemic of pneumo?nia[J].N Engl J Med,1977,297(22):1189-1197.

[3]McDade J E,Shepard C C,Fraser D W,et al.Legion?naires'disease:isolation of a bacterium and demonstra?tion of its role in other respiratory disease[J].N Engl J Med,1977,297(22):1197-1203.

[4]康曉明,湯忠群,夏錫榮.嗜肺軍團(tuán)菌感染1例報(bào)告[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志,1982,7(4):240.

[5]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.WS 394-2012公共場(chǎng)所集中空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)衛(wèi)生規(guī)范[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2012.

[6]Tronel H,Hartemann P.Overview of diagnostic and detection methods for legionellosis and Legionella spp[J].Lett Appl Microbiol,2009,48(6):653-656.

[7]Yong S F Y,Tan S H,Wee J,et al.Molecular detec?tion of Legionella:moving on from mip[J].Front Micro?biol,2010,1:123.

[8]Anonymous.Water quality-detection and quantification of Legionella spp.and/or Legionella pneumophila by concentration and genic amplification by quantitative polymerase chain reaction(qPCR).ISO TS 12869:2012[S].Geneva:International Organisation for Standardisa?tion,2012.

[9]Omiccioli E,Schiavano G F,Ceppetelli V,et al.Vali?dation according to ISO/TS 12869:2012 of a molecu?lar method for the isolation and quantification of Legi?onella,spp.in water[J].Mol Cell Probes,2015,29(2):86-91.

[10]Calvo L,Gregorio I,García A,et al.A new penta?plex-nested PCR to detect five pathogenic bacteria in free living amoebae[J].Water Res,2013,47(2):493-502.

[11]Cao B,Tian Z,Wang S,et al.Structural comparison of O-antigen gene clusters of Legionella pneumophila and its application of a serogroup-specific multiplex PCR assay[J].Antonie Van Leeuwenhoek,2015,108(6):1405-1423.

[12]Li J,Macdonald J.Advances in isothermal amplifica?tion:novel strategies inspired by biological processes[J].Biosens Bioelectron,2014,64(64C):196-211.

[13]Lu X,Mo Z Y,Zhao H B,et al.LAMP-based meth?od for a rapid identification of Legionella spp.and Le?gionella pneumophila[J].Appl Microbiol Biotechnol,2011,92(1):179-187.

[14]David S,Mentasti M,Tewolde R,et al.Evaluation of an optimal epidemiological typing scheme for Legionel?la pneumophila with whole-genome sequence data us?ing validation guidelines[J].J Clin Microbiol,2016,54(8):2135-2148.

[15]Bianchi A,Pregliasco F E,Consonni M,et al.Geno?typic diversity of Legionella pneumophila in environ?mentaland clinical strains assessed by sequencebased typing,in association with retrospective clinical surveillance in Northern Italy[J].Ann Agric Environ Med,2016,23(2):248-253.

[16]Guo J,Ju J,Turro N J.Fluorescent hybridization probes for nucleic acid detection[J].AnalBioanal Chem,2012,402(10):3115-3125.

[17]Siegrist I,Boertz J,Siegrist I.Legionella pneumophila Detection by rRNA[C].Munich:Analytica Conference 2014:2092-2099.

[18]Plomin R,Schalkwyk L C.Microarrays[J].Dev Sci,2007,10(1):19-23.

[20]D'Souza S F.Microbial biosensors[J].Biosens Bioelec?tron,2001,16(6):337-353.

[21]Rai V,Deng J,Toh C S.Electrochemical nanoporous alumina membrane-based label-free DNA biosensor for the detection of Legionella sp[J].Talanta,2012,98(98):112-117.

[22]Graham R M A,Doyle C J,Jennison A V.Real-time investigation of a Legionella pneumophila outbreak us?ing whole genome sequencing[J].Epidemiol Infect,2014,142(11):2347-2351.

[23]Sibley C D,Peirano G,Church D L.Molecular meth?ods for pathogen and microbial community detection and characterization:current and potential application in diagnostic microbiology[J].Infect Genet Evol,2012,12(3):505-521.

[24]Whiley H,Taylor M.Legionella detection by culture and qPCR:comparing apples and oranges[J].Crit Rev Microbiol,2016,42(1):65-74.

[25]Kirschner A K T.Determination of viable legionellae in engineered water systems:Do we find what we are looking for[J]?Water Res,2016,93:276-288.

Recent Progress of Molecular Methods forLegionella pneu?mophilaDetection

LIN Yun1,XIAO Xiao-Zhen2,XIAO Xian-Sheng2,LU Yong-Jun1*
1.School of Life Sciences,Sun Yat-Sen University,Guangzhou 510275;2.Guangzhou Jinrun Environmental Protection Company,Guangzhou 510726;China

Legionella pneumophila,the major pathogen of legionellosis,widely exists in man-made water or cool?ing systems and remains a great public health concern.Prevention and control of legionellosis requires accurate and efficient detection ofL.pneumophila.Generally,molecular biological techniques are rapid,simple,specific and sensitive,therefore increasingly applied toL.pneumophiladetection.This review briefly introduced the recent prog?ress of molecular methods forL.pneumophiladetection,including PCR and its derived techniques,isothermal nucle?ic acid amplification techniques,genotyping,probe hybridization and its related techniques as well as next genera?tion sequencing.Finally,existing problems and perspective of molecular methods forL.pneumophilawere discussed.

Legionella pneumophila;molecular detection;nucleic acid techniques

Q78;R378

A

1009-0002（2017）05-0704-05

10.3969/j.issn.1009-

*Corresponding author,E-mail:luyj@mail.sysu.edu.cn

2017-03-08

廣東省科技協(xié)同創(chuàng)新與平臺(tái)環(huán)境建設(shè)項(xiàng)目（2014B090901019）

林韻（1994- ），女，博士研究生，（E-mail）498281230@qq.com通信作者：陸勇軍，（E-mail）luyj@mail.sysu.edu.cn