鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子生物學(xué)活性測(cè)定方法的研究

趙淑媛，曾娟梅，扈會(huì)平

1.珠海市麗珠單抗生物技術(shù)有限公司質(zhì)量部，廣東珠海 519000；2.麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠QC部，廣東珠海 519000；3.麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠技術(shù)部，廣東珠海 519000

鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子生物學(xué)活性測(cè)定方法的研究

趙淑媛1，曾娟梅2，扈會(huì)平3

1.珠海市麗珠單抗生物技術(shù)有限公司質(zhì)量部，廣東珠海 519000；2.麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠QC部，廣東珠海 519000；3.麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠技術(shù)部，廣東珠海 519000

目的 建立一個(gè)簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、重復(fù)性好的雞胚背根神經(jīng)節(jié)培養(yǎng)法測(cè)定mNGF活性的實(shí)驗(yàn)方法。方法 通過對(duì)雞胚運(yùn)輸溫度控制、神經(jīng)節(jié)分離和接種時(shí)間限制、培養(yǎng)結(jié)果觀察時(shí)間摸索、活性測(cè)定的濃度范圍、重復(fù)性等試驗(yàn)，建立了鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子生物學(xué)活性的測(cè)定方法。 結(jié)果 該方法具有操作簡(jiǎn)便，靈敏度高、重復(fù)性好、測(cè)試結(jié)果準(zhǔn)確的特點(diǎn)。結(jié)論 采用雞胚背根神經(jīng)節(jié)培養(yǎng)法可有效測(cè)定鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的生物學(xué)活性。

鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子；mNGF；雞胚背根神經(jīng)節(jié)；生物學(xué)活性測(cè)定

神經(jīng)生長(zhǎng)因子（nerve gowth factor，NGF）是神經(jīng)系統(tǒng)最重要的生物活性分子之一，能夠促進(jìn)神經(jīng)元的分化，維持神經(jīng)元的存活[1]。鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子mNGF是一種從小鼠頜下腺分離出來的非共價(jià)鍵連接的多聚體蛋白。其生物學(xué)活性表現(xiàn)在能維持神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活、誘導(dǎo)外周神經(jīng)節(jié)外周突起生長(zhǎng)[2]。鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的生物學(xué)活性測(cè)定是其結(jié)構(gòu)和功能研究的基礎(chǔ)。目前,國(guó)際上用于NGF活性測(cè)定的方法主要有2種,即雞胚背根神經(jīng)節(jié)培養(yǎng)法和PC12細(xì)胞(Pheochromocytoma cells,大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞)培養(yǎng)法[3-4]。由于細(xì)胞培養(yǎng)法對(duì)操作人員的經(jīng)驗(yàn)、細(xì)胞庫(kù)管理、細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境、檢測(cè)儀器等方面要求較高且設(shè)備設(shè)施投入大，故國(guó)內(nèi)神經(jīng)生長(zhǎng)因子生物學(xué)活性測(cè)定的方法還是主要以雞胚背根神經(jīng)節(jié)培養(yǎng)法為主。但是雞胚背根神經(jīng)節(jié)培養(yǎng)法也存在干擾因素多，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性較差的現(xiàn)象，故該文通過對(duì)雞胚運(yùn)輸溫度控制、神經(jīng)節(jié)分離和接種時(shí)間限制、培養(yǎng)結(jié)果觀察時(shí)間摸索、活性測(cè)定的濃度范圍、重復(fù)性等試驗(yàn)，建立了一個(gè)簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、重復(fù)性好的鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子生物學(xué)活性的測(cè)定方法，有效地為鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的生產(chǎn)過程監(jiān)控和產(chǎn)品質(zhì)量判定提供依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

CO2培養(yǎng)箱，解剖顯微鏡，超凈工作臺(tái)、，倒置顯微鏡等。

1.2 試劑

雞胚：購(gòu)于珠海東坑雞場(chǎng)的石歧雞種蛋；鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子樣品：麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠自制；鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子標(biāo)準(zhǔn)品：來自中國(guó)藥品生物制品檢定所，1 000 Au/支；DMEM：購(gòu)于INVITROGEN公司；鼠尾膠：麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠自制。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 鼠尾膠原的涂布

取自制鼠尾膠原均勻涂布于培養(yǎng)瓶中。將殘留液吸盡后，于37℃生化培養(yǎng)箱中干燥。在接種神經(jīng)節(jié)前，培養(yǎng)瓶先用DMEM培養(yǎng)基浸洗，接種前將DMEM培養(yǎng)基倒盡。

2.2 DMEM培養(yǎng)基配制

取DMEM 1包，加葡萄糖0.60 g，L-谷氨酰胺0.02 g，1.5MHEAPS溶液1 mL加純化水溶解，加青霉素1 000 U、鏈霉素10 000U，用碳酸氫鈉調(diào)節(jié)pH=7.0后定容至1 000 mL，無菌過濾使用。

2.3 雞胚背根神經(jīng)節(jié)的分離和接種

取孵育7～9 d雞蛋，于超凈臺(tái)中，取出雞胚置于無菌培養(yǎng)皿中。于解剖顯微鏡下，從脊柱兩側(cè)分離出背根神經(jīng)節(jié)，接種置培養(yǎng)瓶中。每瓶至少3個(gè)，于CO2培養(yǎng)箱中，37℃、5%CO2條件下溫育至少1 h。

2.4 實(shí)驗(yàn)與培養(yǎng)

樣品組（共6個(gè)培養(yǎng)瓶）每瓶分別加入含逐級(jí)3倍稀釋的不同終濃度鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的DMEM培養(yǎng)基各3 mL；標(biāo)準(zhǔn)品組（共5個(gè)培養(yǎng)瓶）每瓶分別加入含逐級(jí)3倍稀釋的不同終濃度鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子標(biāo)準(zhǔn)品的DMEM培養(yǎng)基各3 mL；陰性對(duì)照組加入DMEM培養(yǎng)基3 mL。將培養(yǎng)瓶放入CO2培養(yǎng)箱中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。

2.5 結(jié)果觀察

在倒置顯微鏡下觀察，用電子目鏡拍攝。依神經(jīng)節(jié)突起生長(zhǎng)不同程度分為5個(gè)等級(jí)。神經(jīng)節(jié)突起生長(zhǎng)4個(gè)象限、呈樹杈狀為“++++”；神經(jīng)節(jié)突起生長(zhǎng)3個(gè)象限、呈樹杈狀為 “+++”；神經(jīng)節(jié)突起生長(zhǎng) 2個(gè)象限者為“++”；神經(jīng)節(jié)突起只有幾根生長(zhǎng)者為“+”；無突起生長(zhǎng)者為“-”。

2.6 結(jié)果判定及校正

2.6.1 結(jié)果判定 以神經(jīng)節(jié)突起生長(zhǎng)為“++++”時(shí)的樣品稀釋倍數(shù)計(jì)算效價(jià)（AU/mL）。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

3.1 雞胚運(yùn)輸溫度條件實(shí)驗(yàn)

由于溫度變化對(duì)雞胚的生長(zhǎng)發(fā)育有較大的影響，在氣溫較低的冬季，將種蛋分別用普通紙皮運(yùn)輸箱和采用保溫泡沫箱內(nèi)加電暖寶裝置控制箱內(nèi)溫度在37℃左右的包裝方式進(jìn)行種蛋運(yùn)輸。取不同包裝箱內(nèi)的雞胚摘取神經(jīng)節(jié)接種后加入1 AU/mL的mNGF溶液或DMEM培養(yǎng)基后，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后進(jìn)行觀察神經(jīng)節(jié)的生長(zhǎng)情況。結(jié)果見表1。

表1 雞胚運(yùn)輸溫度條件實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，雞胚運(yùn)輸過程中采取保溫泡沫箱內(nèi)加電暖寶裝置控制運(yùn)輸箱內(nèi)溫度在37℃左右，可以保證運(yùn)輸過程中雞胚不被凍傷，接種后神經(jīng)節(jié)不會(huì)脫落或因受傷神經(jīng)節(jié)生長(zhǎng)狀態(tài)不好，造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異較大。

3.2 神經(jīng)節(jié)分離和接種時(shí)間控制實(shí)驗(yàn)

由于神經(jīng)節(jié)需要在一定的溫度、濕度下才能正常生長(zhǎng)、發(fā)育。為保證神經(jīng)節(jié)的生長(zhǎng)成活率，進(jìn)行了分離接種時(shí)間（神經(jīng)節(jié)分離、接種到培養(yǎng)瓶放入CO2培養(yǎng)箱中）長(zhǎng)短，對(duì)神經(jīng)節(jié)的生長(zhǎng)成活率的影響實(shí)驗(yàn)。取神經(jīng)節(jié)接種后加入1 AU/mL的mNGF溶液后，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后觀察神經(jīng)節(jié)的生長(zhǎng)的存活率情況。結(jié)果見表2。

表2 神經(jīng)節(jié)分離和接種時(shí)間控制實(shí)驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)，觀察到由于接種時(shí)間太長(zhǎng)會(huì)造成神經(jīng)節(jié)生長(zhǎng)緩慢或因凍傷或失水而死亡，從而造成活性檢測(cè)時(shí)出現(xiàn)樣品無活性或無梯度等情況。認(rèn)為保證在30 min內(nèi)完成神經(jīng)節(jié)分離、接種并進(jìn)行溫育，是本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟。對(duì)于在冬季氣溫較低的條件下進(jìn)行mNGF活性檢測(cè)；雞胚背根神經(jīng)節(jié)分離接種操作不熟練者；或同時(shí)進(jìn)行多批次檢品檢測(cè)需接種較多培養(yǎng)瓶時(shí)時(shí)間控制顯得尤其重要。因此，為保證神經(jīng)節(jié)的成活率應(yīng)將接種后的培養(yǎng)瓶及時(shí)放入CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行溫育。

3.3 培養(yǎng)結(jié)果觀察時(shí)間摸索實(shí)驗(yàn)

由于神經(jīng)節(jié)的培養(yǎng)時(shí)間不同，其生長(zhǎng)狀況不一樣。通過不同培養(yǎng)時(shí)間下對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察，認(rèn)為培養(yǎng)24～36 h為觀察結(jié)果的最佳時(shí)間。培養(yǎng)時(shí)間＜24 h，神經(jīng)節(jié)的生長(zhǎng)狀況未到達(dá)最佳狀況，并且常常會(huì)因?yàn)榕囵B(yǎng)瓶的反復(fù)移動(dòng)造成神經(jīng)節(jié)突起貼壁不牢固而出現(xiàn)回卷、包節(jié)的現(xiàn)象，以至于影響結(jié)果判斷。培養(yǎng)時(shí)間＞48 h，神經(jīng)節(jié)的突起生長(zhǎng)會(huì)變得更細(xì)、更長(zhǎng)，出現(xiàn)活性梯度不明顯同時(shí)也會(huì)因?yàn)樯窠?jīng)節(jié)自身的抽絲生長(zhǎng)背景較高而干擾結(jié)果判定。

3.4 mNGF量效學(xué)關(guān)系實(shí)驗(yàn)

采用雞胚背根神經(jīng)節(jié)培養(yǎng)法，摸索不同濃度的mNGF或不同效價(jià)單位的mNGF對(duì)神經(jīng)節(jié)的生長(zhǎng)狀況的影響。結(jié)果見表3和圖1。

圖1 mNGF量效學(xué)關(guān)系實(shí)驗(yàn)神經(jīng)節(jié)生長(zhǎng)狀況

表3 mNGF量效學(xué)關(guān)系實(shí)驗(yàn)結(jié)果

利用雞胚背根神經(jīng)節(jié)培養(yǎng)法，在培養(yǎng)24 h后觀察：在mNGF終濃度為0.1 ng/mL或0.03 AU/mL時(shí)，僅有少量神經(jīng)節(jié)細(xì)胞突起生長(zhǎng)為 “+”；在mNGF終濃度為10 ng/mL或1 AU/mL時(shí)，有大量神經(jīng)節(jié)突起呈放射生長(zhǎng)為“+++”或“++++”，其神經(jīng)節(jié)突起生長(zhǎng)狀況呈現(xiàn)出最好的狀態(tài)。在mNGF終濃度＞30 ng/mL或1AU/mL時(shí)，神經(jīng)節(jié)突起生長(zhǎng)受抑制為“+++”或“++”。

3.5 重復(fù)性測(cè)定

采用雞胚背根神經(jīng)節(jié)培養(yǎng)法，對(duì)3批產(chǎn)品的生物學(xué)活性測(cè)定進(jìn)行了重復(fù)實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)6次結(jié)果，CV值小于20%。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見表4。

表4 mNGF效價(jià)測(cè)定重復(fù)性測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4 結(jié)語

雞胚背根神經(jīng)節(jié)培養(yǎng)法實(shí)驗(yàn)條件要求簡(jiǎn)單，易于開展，并且可以觀察到mNGF對(duì)神經(jīng)節(jié)突起生長(zhǎng)的促進(jìn)作用。采用雞胚背根神經(jīng)節(jié)培養(yǎng)法mNGF生物學(xué)活性測(cè)定時(shí)需控制雞胚37℃保溫運(yùn)輸條件，并在30 min內(nèi)完成神經(jīng)節(jié)分離、接種溫育，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行結(jié)果觀察；且在mNGF的終濃度為0～30 ng/mL時(shí)，隨著mNGF的終濃度升高神經(jīng)節(jié)突起生長(zhǎng)增多、增長(zhǎng)；在mNGF的終濃度高于100 ng/mL或3AU時(shí)，神經(jīng)節(jié)突起生長(zhǎng)變密、變短、生長(zhǎng)受到抑制；而在不加mNGF時(shí)，神經(jīng)節(jié)則無突起或僅有少量突起生長(zhǎng)。通過控制上述實(shí)驗(yàn)條件，該測(cè)定方法的CV值為%，因此，可采用雞胚背根神經(jīng)節(jié)培養(yǎng)法，進(jìn)行鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子生物學(xué)活性的限量或半定量測(cè)定。該方法適合生產(chǎn)過程中對(duì)mNGF原液和制劑的質(zhì)量控制。

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R95

A

1672-5654（2017）02（b）-0052-03

10.16659/j.cnki.1672-5654.2017.05.052

2016-11-15）

趙淑媛（1972.3-），女，湖南衡陽人，本科，制藥工程師，主要從事藥品質(zhì)量控制與質(zhì)量保證工作。