快速推進(jìn)糖化血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)程，促進(jìn)糖尿病臨床診治一致性

高社軍，李 宏

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院 檢驗(yàn)科， 河北 石家莊 050011)

·專(zhuān)題·

快速推進(jìn)糖化血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)程，促進(jìn)糖尿病臨床診治一致性

高社軍，李 宏

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院 檢驗(yàn)科， 河北 石家莊 050011)

糖化血紅蛋白A1c(HbA1c)已經(jīng)作為評(píng)價(jià)糖尿病患者長(zhǎng)期血糖控制情況及糖尿病并發(fā)癥的重要指標(biāo)。但它的檢測(cè)方法繁多，各級(jí)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室操作人員水平參差不齊，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室之間檢測(cè)結(jié)果偏倚較大。2010年美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)(ADA)發(fā)布HbA1c作為糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)，2011年被世界衛(wèi)生組織(WHO)采納，即時(shí)推動(dòng)了國(guó)際上的HbA1c檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)程。國(guó)際HbA1c標(biāo)準(zhǔn)化取得顯著成效，但我國(guó)HbA1c檢測(cè)質(zhì)量尚存一定差距，需在HbA1c標(biāo)準(zhǔn)化方面做出進(jìn)一步努力。

糖尿?。惶腔t蛋白A1C

高社軍，河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院檢驗(yàn)科主任，主任技師，教授，全國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)會(huì)臨床應(yīng)用專(zhuān)業(yè)委員會(huì)理事，河北省生物化學(xué)與分子生物學(xué)會(huì)常務(wù)理事，河北省生化學(xué)會(huì)臨床生化專(zhuān)業(yè)委員會(huì)主任委員，河北省醫(yī)學(xué)會(huì)生化分會(huì)副主任委員，河北省臨床實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理與控制中心委員，河北省臨床實(shí)驗(yàn)室管理協(xié)會(huì)常務(wù)理事，國(guó)家863課題子課《代謝綜合癥患者血清游離脂肪酸水平與胰島素抵抗關(guān)系的研究》(2011AA02A111)項(xiàng)目負(fù)責(zé)人，獲河北省科技進(jìn)步三等獎(jiǎng)1項(xiàng)，河北省衛(wèi)生廳科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)1項(xiàng)，在研課題2項(xiàng)，主編《檢驗(yàn)結(jié)果臨床應(yīng)用及評(píng)價(jià)》、《腫瘤實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)》、《檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)高級(jí)教程》、《免疫膠體金技術(shù)臨床應(yīng)用》、《臨床生物化學(xué)及實(shí)驗(yàn)技術(shù)》等學(xué)術(shù)著作，近年來(lái)發(fā)表學(xué)術(shù)論文40余篇。主要研究方向：臨床生物化學(xué)及分子生物技術(shù)的臨床應(yīng)用，糖尿病、代謝綜合征及相關(guān)疾病發(fā)病機(jī)制及診斷方法學(xué)研究，腫瘤個(gè)體化治療及靶向藥物的臨床應(yīng)用等。

近年來(lái)，血糖控制一直是糖尿病治療中最重要的問(wèn)題，英國(guó)糖尿病前瞻性研究(UKPDS)和糖尿病控制與并發(fā)癥試驗(yàn)(DCCT)等多項(xiàng)大型試驗(yàn)均證實(shí)血糖控制情況與糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。同時(shí)，這些大型研究也證實(shí)了降低糖化血紅蛋白(glycosylatedhemoglobin，GHb)與減少糖尿病并發(fā)癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)間的直接關(guān)系，以及平均血糖水平與GHb之間存在相關(guān)性[1]。而糖化血紅蛋白A1c(HbA1c)是GHb檢測(cè)的最主要標(biāo)志物，作為目前評(píng)估長(zhǎng)期血糖狀況的最好指標(biāo)，HbA1c有助于確定治療目標(biāo)以降低糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。因HbA1c升高代表慢性的血糖增高，對(duì)實(shí)驗(yàn)室測(cè)定HbA1c提出了更高的要求。尤其HbA1c結(jié)果一致性的問(wèn)題，直接影響了HbA1c臨床應(yīng)用。為此自20世紀(jì)90年代起，美國(guó)國(guó)家血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)劃(NGSP)為實(shí)現(xiàn)HbA1c檢測(cè)的結(jié)果一致性，開(kāi)展了HbA1c檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化工作，從HbA1c的檢測(cè)方法學(xué)，校準(zhǔn)品的溯源性以及偏倚允許范圍都進(jìn)行認(rèn)證，有效的促進(jìn)了HbA1c檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化工作。為此，國(guó)際臨床化學(xué)協(xié)會(huì)(IFCC)也對(duì)HbA1c檢測(cè)的參考系統(tǒng)和參考物質(zhì)進(jìn)行了明確，這些工作極大的促進(jìn)了全球范圍內(nèi)HbA1c檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化工作的更進(jìn)一步推進(jìn)。目前，美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)(ADA)和IFCC已經(jīng)推薦HbA1c做為糖尿病的診斷指標(biāo)。2009年，ADA發(fā)表的專(zhuān)家共識(shí)指出：HbAlc的檢測(cè)可用于糖尿病患者早期診斷與治療療效的監(jiān)測(cè)。次年，ADA在指南中明確將HbAlc≥6.5%的界限值作為糖尿病患者的診斷指標(biāo)。目前，已有部分國(guó)家如日本和瑞典等已將HbA1c用于篩查早期糖尿病患者高危人群，并將HbA1c作為診斷糖尿病的重要標(biāo)志物。然而，由于HbA1c檢測(cè)系統(tǒng)的不同導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室間結(jié)果差異性較大，因此HbA1c檢測(cè)方法所得結(jié)果可能不完全一致?；谏鲜鲈颍壳拔覈?guó)在2013年糖尿病治療指南中尚未正式將HbA1c列入糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)，主要問(wèn)題包括：①我國(guó)尚缺乏有效的HbA1c量值溯源體系。②實(shí)驗(yàn)室間質(zhì)控方式有待完善。③國(guó)內(nèi)雖已能生產(chǎn)全自動(dòng)HbA1c分析儀器，但與其相配套的校準(zhǔn)品和質(zhì)控品與國(guó)外廠(chǎng)商仍存在較大差距，多數(shù)國(guó)產(chǎn)化的設(shè)備沒(méi)有通過(guò)NGSP認(rèn)證。④對(duì)異常血紅蛋白尤其是變異的血紅蛋白對(duì)HbA1c檢測(cè)系統(tǒng)干擾性的研究仍需深入，實(shí)驗(yàn)室人員往往缺乏認(rèn)識(shí)，難以較合理解釋HbA1c結(jié)果差異性的原因[2]。因此，推進(jìn)HbA1c標(biāo)準(zhǔn)化工作迫在眉睫、至關(guān)重要。

1 GHb變異及干擾因素

HbA1c的干擾主要存在內(nèi)源性血紅蛋白的干擾和檢測(cè)方法差異性?xún)煞矫妫?由于實(shí)驗(yàn)室對(duì)血紅蛋白變異造成的內(nèi)源性干擾認(rèn)識(shí)和了解還很模糊，同時(shí)對(duì)檢測(cè)方法的干擾認(rèn)識(shí)不足，溯源體系的不完整等因素造成各實(shí)驗(yàn)室間結(jié)果的不一致。

血紅蛋白病是與遺傳相關(guān)的血液系統(tǒng)疾病，常見(jiàn)的包括異常血紅蛋白病和地中海貧血兩大類(lèi)：異常血紅蛋白病是血紅蛋白合成過(guò)程中，血紅蛋白分子結(jié)構(gòu)發(fā)生異常；而地中海貧血為基因突變導(dǎo)致血紅蛋白的珠蛋白肽鏈生成障礙。臨床可表現(xiàn)為溶血性貧血、高鐵血紅蛋白血癥或代償性紅細(xì)胞增多所致紫紺等。但臨床多數(shù)為隱匿性(即無(wú)臨床癥狀)的血紅蛋白病。

正常人包括3種血紅蛋白：HbA、HbA2和HbF。HbA即α2β2，占血紅蛋白總量的95%以上，是健康人最主要的血紅蛋白。在胚胎期到出生2個(gè)月內(nèi)，HbA很少，約占血紅蛋白總量的10%～40%，出生后6個(gè)月才達(dá)成人正常水平。而HbA2由α2δ2構(gòu)成，在出生后1年內(nèi)產(chǎn)生，約占血紅蛋白總量的2%～3%。但HbF由α2γ2構(gòu)成，出生時(shí)最多，約占血紅蛋白總量的70%～90%，在出生后1～6個(gè)月之內(nèi)逐漸降低，在出生6個(gè)月后，降到正常人血紅蛋白的1%左右。因?yàn)檠t蛋白的合成由不同的遺傳基因控制，在血紅蛋白合成過(guò)程中表現(xiàn)為不同的肽鏈結(jié)構(gòu)。大量的珠蛋白合成過(guò)程中由于其單個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失或被替代，最終導(dǎo)致珠蛋白的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，因此紅細(xì)胞中就會(huì)產(chǎn)生血紅蛋白變異體，即異常血紅蛋白病。隨著對(duì)血紅蛋白變異體研究的日趨深入，目前已證實(shí)全世界范圍內(nèi)通過(guò)血紅蛋白結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)的異常血紅蛋白已達(dá)600多種，但在臨床僅有不到1/3的患者會(huì)出現(xiàn)臨床癥狀[3]。多數(shù)患者無(wú)臨床表現(xiàn)，這對(duì)HbA1c的檢測(cè)造成主要的干擾，也是困擾HbA1c標(biāo)準(zhǔn)化的主要原因。 據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計(jì)，在全球范圍內(nèi)，大約有1.5億人可能攜帶血紅蛋白病基因，約占人口總數(shù)的3.75%左右。因此，WHO已將血紅蛋白病列為嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的常見(jiàn)病之一。在我國(guó)南方，尤其在云南、貴州、廣西等地，異常血紅蛋白病發(fā)病率較高，而且無(wú)臨床癥狀的更為突出。隨著交通的便捷，北方地區(qū)輸入性患者也日漸增多。據(jù)2016版中國(guó)衛(wèi)生年鑒統(tǒng)計(jì)，我國(guó)已發(fā)現(xiàn)67種與遺傳相關(guān)的異常血紅蛋白病，其中α鏈變異34種、β鏈變異26種、γ鏈變異7種。在我國(guó)華南及西南地區(qū)，α-地中海貧血的發(fā)病率為2.64%，異常血紅蛋白病的發(fā)病率為0.33%。

在血紅蛋白組成中，98%的成分為HbA，在正常人中GHb因非酶促反應(yīng)形成的HbA1c約占HbA的6%。異常血紅蛋白大多數(shù)為α、β或δ鏈上點(diǎn)突變，點(diǎn)突變導(dǎo)致肽鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，紅細(xì)胞變形性降低，直接縮短了紅細(xì)胞的壽命。如果糖尿病患者合并血紅蛋白病，尤其對(duì)沒(méi)有臨床癥狀或隱性癥狀的血紅蛋白病患者，因遺傳基因的變異，產(chǎn)生大量的異常血紅蛋白，其在糖尿病患者紅細(xì)胞代謝過(guò)程中也會(huì)被糖基化，在進(jìn)行GHb檢測(cè)時(shí)，導(dǎo)致結(jié)果假性偏高，影響HbA1c的檢測(cè)，同時(shí)其異常的蛋白結(jié)構(gòu)也會(huì)對(duì)HbA1c的檢測(cè)造成影響。因此無(wú)論是生理性還是病理性的血紅蛋白變異體，都會(huì)影響到HbA1c檢測(cè)的準(zhǔn)確性和結(jié)果一致性[4]。發(fā)現(xiàn)異常血紅蛋白對(duì)HbA1c的干擾，也是HbA1c標(biāo)準(zhǔn)化工作重點(diǎn)之一。

2 檢測(cè)方法學(xué)導(dǎo)致的結(jié)果差異

目前已批準(zhǔn)上市用來(lái)檢測(cè)HbA1c的檢測(cè)方法多達(dá)30種以上，應(yīng)用最多的是基于HbA1c的帶電荷差異和結(jié)構(gòu)差異進(jìn)行分析， 美國(guó)NGSP推薦以HbA1c占總血紅蛋白的比例(%)報(bào)告HbA1c的測(cè)定結(jié)果。這種報(bào)告方式已經(jīng)被多數(shù)臨床醫(yī)生接受和認(rèn)可，因此各臨床實(shí)驗(yàn)室均以百分?jǐn)?shù)方式報(bào)告HbA1c的結(jié)果。目前HbA1c的檢測(cè)方法有很多種，最常用的包括離子交換層析法、硼酸基親和層析法和免疫學(xué)法等，這些檢測(cè)方法都存在一定問(wèn)題。

2.1 離子交換色譜法 離子交換色譜法的原理是基于電荷差異從HbA中分離出HbA1c。1971年首次將微柱離子交換色譜法用于臨床，其原理是血紅蛋白帶正電荷，當(dāng)外周血中葡萄糖(Glu)與血紅蛋白β鏈N末端纈氨酸(Val)結(jié)合后其等電點(diǎn)降低，這樣導(dǎo)致被糖化的帶正電荷血紅蛋白對(duì)層析柱中樹(shù)脂的附著力減弱，更容易被洗脫出來(lái)，通過(guò)調(diào)整緩沖液中的離子強(qiáng)度，可將血紅蛋白從陽(yáng)離子交換柱中洗脫下來(lái)，洗脫是在不同時(shí)間內(nèi)發(fā)生，通過(guò)掃描產(chǎn)生不同離子強(qiáng)度的峰值，再根據(jù)峰值下面積，最終以HbA1c占總血紅蛋白的百分比的方式報(bào)告結(jié)果。該方法優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，快捷，缺點(diǎn)是交換柱需頻繁更換，同時(shí)易受溫度、pH值影響。另外，高血脂和重度黃疸都容易對(duì)結(jié)果造成干擾。離子交換色譜法無(wú)法解決血紅蛋白變異體干擾問(wèn)題，會(huì)隨HbA1c一起被洗脫，導(dǎo)致報(bào)告結(jié)果假性偏高。雖經(jīng)多年發(fā)展，技術(shù)也逐步完善，其檢測(cè)精密度也有了顯著提高，但因血紅蛋白變異引起的非特異性干擾仍需完善，最為突出的是尿毒癥患者導(dǎo)致的血紅蛋白的氨甲?；?，使血紅蛋白的β鏈N末端正電荷降低，干擾HbA1c的定量測(cè)定[5]。目前臨床上通過(guò)采用高效液相色譜法(HPLC)和低壓液相色譜(LPLC)法減少非特異性血紅蛋白對(duì)測(cè)定的干擾，但非特異性干擾問(wèn)題仍有待進(jìn)一步提高。

2.2 電泳法 其原理與離子交換層析法類(lèi)似，也是基于血紅蛋白中被糖化和非糖化后，GHb所帶正電荷降低，據(jù)此在電場(chǎng)作用下進(jìn)行分離。電場(chǎng)中帶電荷多的移動(dòng)速度快，反之移動(dòng)速度慢。該法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，精密度較高，干擾因素少，溫度和pH值均不造成干擾；缺點(diǎn)是需批量樣本分析，報(bào)告周期長(zhǎng)，難以對(duì)單一樣本分析，臨床上現(xiàn)已較少使用。多用于HbA1c干擾因素的驗(yàn)證分析。

2.3 親和色譜法 親和色譜法的原理是基于糖化后的血紅蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，利用層析技術(shù)將糖化和非糖化血紅蛋白分離。由于HbA1c與HbA0結(jié)構(gòu)不同，以糖基化位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)特異性為測(cè)定原理，GHb可以與親和樹(shù)脂連接，因而可以分離， 親和層析法不受溫度、氨基甲酰GHb和胎兒血紅蛋白的干擾，但與樹(shù)脂結(jié)合的GHb并不是單純的HbA1c，而是包括所有的GHb。因此親和層析法測(cè)定的是總GHb，比特異測(cè)定HbA1c系統(tǒng)的檢測(cè)結(jié)果偏高。

2.4 免疫學(xué)分析法 該方法最早是由英國(guó)Dako公司研制，其原理是基于HbA1c的特殊的分子結(jié)構(gòu)和肽鏈，利用單克隆技術(shù)制備出可識(shí)別Glu附著在血紅蛋白的β鏈N末端8個(gè)氨基酸抗原位點(diǎn)的抗體，該抗體再與標(biāo)記酶結(jié)合，利用酶免疫分析技術(shù)進(jìn)行定量檢測(cè)。該方法優(yōu)點(diǎn)是利用HbA1c與HbA0結(jié)構(gòu)性差異，同時(shí)基于抗原抗體反應(yīng)的專(zhuān)一性，有效而合理的避免了血紅蛋白變異體對(duì)HbA1c造成的干擾。同時(shí)隨著免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展尤其單克隆抗體技術(shù)的運(yùn)用，也基于IFCC明確HbA1c的結(jié)構(gòu)，該方法有了快速發(fā)展。羅氏公司據(jù)此研究成果制備的校準(zhǔn)品與采用IFCC的方法制備的一級(jí)參考物質(zhì)比較，其β鏈N末端6個(gè)氨基酸的短肽有高度的符合性， 通過(guò)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)該方法與IFCC推薦的參考物質(zhì)(2.85%～3.81%)更一致[6]。由于其測(cè)定方法相對(duì)成熟，結(jié)果準(zhǔn)確性好，在2016年美國(guó)病理學(xué)家協(xié)會(huì)(CAP)的質(zhì)評(píng)報(bào)告中，大約有近75%的實(shí)驗(yàn)室采用此方法檢測(cè)HbA1c。在國(guó)內(nèi)現(xiàn)在也有近36%的實(shí)驗(yàn)室采用此方法，并可以用生化分析儀進(jìn)行檢測(cè)，無(wú)需特殊設(shè)備。該方法具有良好的精密度，并與其他方法有良好的相關(guān)性。但是，各廠(chǎng)家制備的單克隆抗體存在差異，因針對(duì)的抗原決定簇不同、親和力不同等因素，不同生產(chǎn)廠(chǎng)商間，HbA1c結(jié)果較難實(shí)現(xiàn)可比性和一致性[7]。另外，變異血紅蛋白尤其是當(dāng)血紅蛋白發(fā)生第6位氨基酸變異時(shí)該位點(diǎn)將不會(huì)被識(shí)別，導(dǎo)致結(jié)果假性偏低， 這也可能是不同生產(chǎn)廠(chǎng)家間的檢測(cè)結(jié)果存在偏倚的主要原因。另外，基于此技術(shù)衍生的免疫投射比濁法、離子捕獲法等，由于各檢測(cè)系統(tǒng)的差異性及HbC、HbF等變異血紅蛋白等可影響檢測(cè)結(jié)果。

2.5 酶法 其原理是在蛋白酶的作用下， 血紅蛋白中糖化的N末端的糖化二肽被蛋白內(nèi)切酶切斷，即HbA1c的β鏈， 糖化二肽在果糖基肽氧化酶和過(guò)氧化物酶的作用下，將生成過(guò)氧化氫酶促反應(yīng)使顯色劑產(chǎn)生紅色，其吸光度值與HbA1c含量成正比， 通過(guò)測(cè)定吸光度求出HbA1c的百分濃度。因蛋白內(nèi)切酶的特異性，避免了樣本中其他蛋白的干擾，大量評(píng)估數(shù)據(jù)顯示該方法有很好的精密度，但該方法需進(jìn)行標(biāo)本前手工處理，因操作原因?qū)е陆Y(jié)果的不可比性或較大偏倚。

2.6 即時(shí)檢驗(yàn)(POCT)檢測(cè)方法 目前POCT法 檢測(cè)HbA1c爭(zhēng)論較多，因便攜、方便、 快速而受到多數(shù)臨床醫(yī)生肯定，但實(shí)驗(yàn)室醫(yī)生則認(rèn)為其精密度和準(zhǔn)確度較差，結(jié)果一致性差，無(wú)法實(shí)現(xiàn)大批量標(biāo)本的檢測(cè)。衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心的2016年的實(shí)驗(yàn)室間質(zhì)評(píng)結(jié)果也證實(shí)CV值大于5.8%。但二級(jí)以下的實(shí)驗(yàn)室多采用此方法。國(guó)內(nèi)多使用以下2種技術(shù)方法測(cè)定GHb。①基于免疫反應(yīng)原理，用熒光素標(biāo)記抗體，抗體與HbA1c特異性的結(jié)合后產(chǎn)生熒光而形成斑點(diǎn)，然后用熒光分析儀測(cè)定含HbA1c的熒光染料分子的斑點(diǎn)數(shù)，再換算成HbA1c的百分濃度。②因硼酸可與糖基化復(fù)合物特異結(jié)合，糖基化復(fù)合物與硼酸結(jié)合后呈藍(lán)色， 而未被糖化的血紅蛋白仍表現(xiàn)紅色， 再通過(guò)比較藍(lán)色光與紅色光強(qiáng)度的比例，計(jì)算出HbA1c的百分濃度。衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心抽樣比較了8款采用POCT方法檢測(cè)HbA1c的產(chǎn)品，多數(shù)產(chǎn)品誤差結(jié)果差異性顯著， 發(fā)現(xiàn)僅2款符合NGSP管理要求[8]。POCT方法因其簡(jiǎn)便、快速，越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)室采用此方法，但質(zhì)控問(wèn)題、結(jié)果一致性的問(wèn)題、溯源性問(wèn)題也一直困擾著POCT的推廣應(yīng)用。目前我國(guó)對(duì)POCT的規(guī)范化和質(zhì)量控制尚沒(méi)有明確規(guī)定，缺乏質(zhì)量控制措施會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果，很大程度上限制了POCT儀器在臨床上的應(yīng)用。

3 NGSP和IFCC參考方法標(biāo)準(zhǔn)化工作

早在1985年，WHO以及CAP就意識(shí)到實(shí)現(xiàn)HbA1c檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化的必要性，但直到1993年，臨床實(shí)驗(yàn)室HbA1c的檢測(cè)分析狀況還相當(dāng)混亂。CAP的精確調(diào)查結(jié)果顯示，對(duì)于同一份樣本的檢測(cè)，不同實(shí)驗(yàn)室之間的檢測(cè)結(jié)果在4.0%～8.1%之間，不同的檢測(cè)方法存在著巨大的偏差和不準(zhǔn)確性。

由于HbA1對(duì)糖尿病的特殊診斷價(jià)值，而不同檢測(cè)系統(tǒng)間差異較顯著，因此，HbA1c檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化工作已經(jīng)得到了IFCC的廣泛關(guān)注[9]。目前，由WHO牽頭，較成熟的HbA1c檢測(cè)的國(guó)家性標(biāo)準(zhǔn)化網(wǎng)絡(luò)體系(DCM)主要有3個(gè)：NGSP、瑞典的Mono-S體系和日本的糖尿病協(xié)會(huì)/臨床檢驗(yàn)協(xié)會(huì)體系(JDS/JSCC)。這些獨(dú)立的檢測(cè)體系雖然內(nèi)部設(shè)計(jì)嚴(yán)謹(jǐn)，保證了體系中各個(gè)實(shí)驗(yàn)室之間結(jié)果的可比性，但缺點(diǎn)是檢測(cè)分析方法基于各自體系確定，體系間沒(méi)有可比性。因而建立HbA1c檢測(cè)的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化體系勢(shì)在必行[10]?；谂R床應(yīng)用需要，美國(guó)ADA由NGSP推動(dòng)HbA1c標(biāo)準(zhǔn)化工作，該項(xiàng)工作得到了IFCC的認(rèn)可，IFCC在1995年組織專(zhuān)家成立了HbA1工作組，目的是推動(dòng)實(shí)現(xiàn)一個(gè)統(tǒng)一的國(guó)際HbA1c標(biāo)準(zhǔn)化參考物，并制定了明確的檢測(cè)HbA1c的參考方法，做為一級(jí)參考物質(zhì)提供給NGSP作為新的標(biāo)準(zhǔn)，并于2002年正式發(fā)表了HbA1c的參考體系[11]。其重要內(nèi)容包括：①明確HbA1c定義，明確了其分子結(jié)構(gòu)：即在非酶促作用下，將與葡萄糖結(jié)合的β鏈N末端纈氨酸殘基定義為穩(wěn)定的葡萄糖基化的血紅蛋白；②確定了國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的HbA1一級(jí)參考物質(zhì)；③建立特異性滿(mǎn)足要求的參考方法：即HPLC-質(zhì)譜或HPLC-毛細(xì)管電泳法；④建立了全球參考實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)，使溯源鏈可以傳遞。由于IFCC方法高于上述3個(gè)國(guó)家的指定比對(duì)方法，但結(jié)果又低于以上指定比對(duì)方法，其間可通過(guò)公式換算，易給臨床醫(yī)師、患者、科研工作者造成一定的混淆。

國(guó)際化體系建立在檢測(cè)結(jié)果具備廣泛的可追溯性這一原則之上。為建立一個(gè)具有可追溯性的檢測(cè)體系，IFCC委員會(huì)將HbA1c定義為Glu穩(wěn)定的與B鏈N-端殘基糖基化結(jié)合的血紅蛋白，并提供兩套參考方法，這些參考方法已在2001年6月獲IFCC批準(zhǔn)。為了與目前廣泛應(yīng)用的NGSP/DCCT/UKPDS單位相區(qū)別，IFCC體系采用mmol/mol作為單位，例如，NGSP/DCCT/UKPDS體系中的7%即等同于IFCC體系中的53mmol/mol。IFCCHbA1c標(biāo)準(zhǔn)化工作委員會(huì)使用的參考方法為：首先用HPLC方法來(lái)分離收集HbA1c，再用毛細(xì)管電泳或質(zhì)譜的方法對(duì)分離物進(jìn)行定量，外周血中氨甲酰化血紅蛋白、乙酰化血紅蛋白和血紅蛋白變異體均不會(huì)對(duì)該參考方法造成干擾。以此方法制備了HbA1c國(guó)際一級(jí)參考物質(zhì)。2010年，為實(shí)現(xiàn)HbA1c全球標(biāo)準(zhǔn)化目標(biāo)，ADA、歐洲糖尿病研究學(xué)會(huì)和國(guó)際糖尿病聯(lián)盟共同召開(kāi)會(huì)議，統(tǒng)一認(rèn)識(shí)，達(dá)成一致的內(nèi)容如下:①同意采用IFCC參考測(cè)量程序制備的HbA1做為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)一級(jí)參考物質(zhì)，并作為廠(chǎng)商校準(zhǔn)HbA1c的新的全球標(biāo)準(zhǔn);② 使用新的IFCC方法來(lái)確定國(guó)際認(rèn)證程序，并對(duì)現(xiàn)有的國(guó)際參考實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行評(píng)估認(rèn)證，研究探討美國(guó)的NGSP網(wǎng)絡(luò)和瑞典、日本等的網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室結(jié)果互通性可能;③現(xiàn)有廠(chǎng)商和臨床實(shí)驗(yàn)室暫不改變HbA1c報(bào)告的單位。在國(guó)際參考實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)研究中更主要關(guān)注HbA1c與平均血糖的關(guān)系。

雖然HbA1c檢測(cè)的技術(shù)方法采用了包括層析技術(shù)、酶學(xué)技術(shù)、免疫學(xué)分析技術(shù)、電泳技術(shù)、POCT快速檢測(cè)技術(shù)等，但非特異性血紅蛋白干擾問(wèn)題仍然存在。標(biāo)本因素如:紅細(xì)胞壽命縮短、 血紅蛋白結(jié)構(gòu)變異、乙酰化血紅蛋白、氨基甲?；t蛋白及標(biāo)本高膽紅素和高脂血癥等，均可造成HbA1c值出現(xiàn)假性升高或降低。基于HbA1c對(duì)糖尿病管理的臨床價(jià)值，雖然檢測(cè)方法不同，但可以通過(guò)加強(qiáng)標(biāo)準(zhǔn)化的技術(shù)操作規(guī)范培訓(xùn)，加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控工作和有效的實(shí)驗(yàn)室間質(zhì)量評(píng)價(jià)體系建立等，實(shí)現(xiàn)在不同方法間測(cè)定HbA1結(jié)果有較好的相關(guān)性和一致性。

4 我國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)HbA1c的現(xiàn)狀

目前我國(guó)尚未正式將HbA1c用于糖尿病診斷，主要有以下原因：①我國(guó)衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心雖開(kāi)展HbA1c實(shí)驗(yàn)室間質(zhì)量評(píng)價(jià)已近10年，但尚未建立有效的量值溯源體系；評(píng)價(jià)方式和方法也有待提高。②國(guó)內(nèi)生產(chǎn)廠(chǎng)商尚不能提供臨床實(shí)驗(yàn)室可溯源的校準(zhǔn)品，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)質(zhì)控品等均沒(méi)有國(guó)產(chǎn)化，臨床實(shí)驗(yàn)室為降低成本而未能?chē)?yán)格開(kāi)展質(zhì)控工作。③技術(shù)支持的滯后導(dǎo)致使用操作不規(guī)范，尤其凸顯在POCT方法上。④對(duì)異常血紅蛋白測(cè)定結(jié)果的干擾知識(shí)缺乏、無(wú)法提供干擾的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)和不能對(duì)測(cè)定結(jié)果給予臨床合理解釋等[12]。我國(guó)HbA1c測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)化工作還處于起步階段，尤其在HbA1檢測(cè)的精密度和準(zhǔn)確性方面，與發(fā)達(dá)國(guó)家相比仍存在較大的差距。衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心近3年的實(shí)驗(yàn)室間質(zhì)評(píng)結(jié)果證實(shí)，我國(guó)HbA1檢測(cè)的系統(tǒng)誤差CV值在5%～7%，難以滿(mǎn)足IFCC要求CV值小于3.5%的目標(biāo)。究其原因，多種HbA1c檢測(cè)方法均有使用，但不同方法之間結(jié)果互通性的研究尚缺乏，結(jié)果不一致性問(wèn)題的技術(shù)手段尚在探索中，缺乏國(guó)家層面的方法學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化的認(rèn)證和認(rèn)可，導(dǎo)致各實(shí)驗(yàn)室間多種檢測(cè)方法并存，增加了標(biāo)準(zhǔn)化工作難度。其測(cè)定所用的儀器、試劑、質(zhì)控品和校準(zhǔn)品多依賴(lài)進(jìn)口，質(zhì)量控制手段尤其是實(shí)驗(yàn)室內(nèi)質(zhì)控方面因成本問(wèn)題沒(méi)有得到足夠重視，導(dǎo)致各實(shí)驗(yàn)室間HbA1檢測(cè)結(jié)果差異較大，尚不能符合目前糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)的要求，因此2013年中華醫(yī)學(xué)會(huì)糖尿病分會(huì)暫未將HbA1c列為糖尿病診斷指標(biāo)。隨著對(duì)HbA1干擾因素研究的日益深入，HbA1c在糖尿病診斷和治療中的價(jià)值越來(lái)越大，面對(duì)潛在糖尿病及新發(fā)病患者逐漸增多，臨床醫(yī)生充分認(rèn)識(shí)到與臨床檢驗(yàn)醫(yī)生合作的重要性，這對(duì)我國(guó)HbA1c檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化工作起到了積極的促進(jìn)作用?！短腔t蛋白標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)》為我國(guó)首個(gè)HbA1c實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。另外，為了實(shí)現(xiàn)HbA1c檢測(cè)全球標(biāo)準(zhǔn)化的目標(biāo)，上海市臨床檢驗(yàn)中心和衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心分別依托IFCC建立HbA1標(biāo)準(zhǔn)化網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)，已基本建立了HbA1c參考體系，有望形成具有規(guī)范化的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。上海市臨檢中心在2012年由復(fù)旦大學(xué)中山醫(yī)院牽頭啟動(dòng)了上海地區(qū)GHb檢測(cè)結(jié)果一致性計(jì)劃，目前已覆蓋全國(guó)70多家臨床實(shí)驗(yàn)室，使各實(shí)驗(yàn)室間CV值降至0.94%～4.22%之間。同時(shí)衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心按照IFCC參考體系建立了基于質(zhì)譜法制備的HbA1c國(guó)家一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，對(duì)促進(jìn)HbA1標(biāo)準(zhǔn)化工作尤其是廠(chǎng)商校準(zhǔn)品的制備奠定了基礎(chǔ)，與此同時(shí)也逐步推行GHb臨床參考測(cè)量實(shí)驗(yàn)室的認(rèn)可工作，保障了HbA1c量值溯源體系的建立，也為HbA1c的測(cè)定奠定了理論基礎(chǔ)。HbA1檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化的專(zhuān)家共識(shí)明確指出，我國(guó)的HbA1c檢測(cè)將IFCC的一級(jí)參考物作為國(guó)家參考物質(zhì)，其測(cè)量方法需符合國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化的要求，并溯源至IFCC；開(kāi)展檢測(cè)HbA1c的臨床實(shí)驗(yàn)室必須開(kāi)展常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)質(zhì)量控制工作并需參加省以上臨床檢驗(yàn)中心的實(shí)驗(yàn)室間質(zhì)評(píng)，以確保測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性[13]；同步開(kāi)展我國(guó)變異血紅蛋白對(duì)HbA1c檢測(cè)系統(tǒng)影響工作的研究。上述措施對(duì)促進(jìn)GHb標(biāo)準(zhǔn)化工作起到了極大的促進(jìn)作用。另外，復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗(yàn)科依據(jù)ADA導(dǎo)則的精神，倡導(dǎo)臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)至少保證兩個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行HbA1c測(cè)定。在使用離子交換HPLC檢測(cè)HbA1c的同時(shí)，如發(fā)現(xiàn)血紅蛋白變異體的干擾可使用另一方法進(jìn)行驗(yàn)證。這種做法就保證了GHb結(jié)果的準(zhǔn)確性，同時(shí)在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)減少了異常血紅蛋白對(duì)HbA1c檢測(cè)結(jié)果的假性干擾。在我國(guó)東南沿海地區(qū)、西南地區(qū)，異常血紅蛋白對(duì)糖尿病診斷的影響問(wèn)題比較突出。目前，隨著交通的便捷化，人口流動(dòng)的增加，北方地區(qū)對(duì)于新發(fā)糖尿病患者也應(yīng)當(dāng)高度重視異常血紅蛋白和血紅蛋白變異體對(duì)HbA1c檢測(cè)結(jié)果造成的干擾，臨床實(shí)驗(yàn)室工作者應(yīng)普及和充實(shí)這方面的知識(shí)。各地臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)時(shí)刻注意異常血紅蛋白對(duì)HbA1c檢測(cè)結(jié)果的影響。

5 結(jié)語(yǔ)

HbA1c是診斷和監(jiān)測(cè)糖尿病治療效果的重要指標(biāo)，全球范圍內(nèi)HbA1c檢測(cè)結(jié)果的差異正逐步縮小。理想的實(shí)驗(yàn)室間CV值應(yīng)當(dāng)小于3.5%。國(guó)內(nèi)應(yīng)加快異常血紅蛋白對(duì)檢測(cè)系統(tǒng)干擾因素的分析，同時(shí)改良診斷技術(shù)方法，提高和加快推進(jìn)HbA1c檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化工作，使糖尿病患者獲益。每個(gè)臨床實(shí)驗(yàn)室需充分認(rèn)識(shí)異常血紅蛋白的干擾，同時(shí)建立完善的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)質(zhì)控和實(shí)驗(yàn)室間質(zhì)評(píng)等保障程序，對(duì)新引入HbA1c檢測(cè)方法在用于臨床檢測(cè)前必須進(jìn)行系統(tǒng)性驗(yàn)證工作。在區(qū)域范圍內(nèi)建議設(shè)置HbA1c檢測(cè)的驗(yàn)證系統(tǒng)，提高及早識(shí)別異常血紅蛋白干擾的能力，做到各系統(tǒng)間相互驗(yàn)證。目前，應(yīng)用免疫學(xué)方法檢測(cè)HbA1c時(shí)尚未發(fā)現(xiàn)變異血紅蛋白造成的干擾，但對(duì)這種方法仍需深入研究才能作出客觀(guān)的判斷，這需要各實(shí)驗(yàn)室間共同協(xié)作，同時(shí)建立國(guó)內(nèi)異常血紅蛋白干擾的網(wǎng)絡(luò)信息平臺(tái)，從管理層、生產(chǎn)廠(chǎng)商和臨床實(shí)驗(yàn)室三方面共同協(xié)作才能實(shí)現(xiàn)。為了實(shí)現(xiàn)糖尿病患者的有效管理和治療，應(yīng)加強(qiáng)臨床與實(shí)驗(yàn)室的合作，充分認(rèn)識(shí)HbA1c干擾因素，最終使患者獲益。

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Rapidlyadvancestandardizationprocessofglycosylatedhemoglobintests，promotediabetesclinicaldiagnosisandconsistency

GaoShejun，LiHong

DepartmentofClinicalLaboratory，theFourthHospitalofHebeiMedicalUniversity，Shijiazhuang050011，China

Correspondingauthor:GaoShejun，Email:gaoshe@sina.com.cn

Glycohemoglobin(HbA1c)isimportantforassessinglong-termglycemiclevelsanddiabeticcomplicationsofbloodvesselsindiabeticpatients.However，therearesignificantlydifferencesinbiasbecauseofvarioustestmethodsandtechnologicalcapabilitiesindifferentlaboratories.In2010，HbA1cwasincludedinnewguidelinesfromADAfordiagnosingdiabetes，andrecommendedbyWHOin2011.AllthosepromotedthestandardizationprocessofHbA1ctests.SignificantachievementsofHbA1cstandardizationhavebeenmadeinsomepartsoftheworld，butthereissomegapinourcountryandothercountries，furthereffortisneededinthestandardizationofHbA1cmeasurement.

diabetesmellitus；hemoglobinA1c

高社軍，Email:gaoshe@sina.com.cn

R

A

1004-583X(2017)04-0291-06

10.3969/j.issn.1004-583X.2017.04.005

2017-03-21 編輯:張衛(wèi)國(guó)