• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    淫羊藿苷對(duì)成骨細(xì)胞成骨分化的影響及Wnt/-catenin信號(hào)系統(tǒng)的關(guān)系研究*

    2017-04-07 03:26:26熊莉娜柳湘潔李凝旭張瑞蕓
    中國中醫(yī)急癥 2017年3期
    關(guān)鍵詞:藿苷成骨成骨細(xì)胞

    涂 艷 熊莉娜柳湘潔 雷 超 李凝旭 張瑞蕓

    (華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院,湖北 武漢 430077)

    ·實(shí)驗(yàn)報(bào)告·

    淫羊藿苷對(duì)成骨細(xì)胞成骨分化的影響及Wnt/-catenin信號(hào)系統(tǒng)的關(guān)系研究*

    涂 艷 熊莉娜△柳湘潔 雷 超 李凝旭 張瑞蕓

    (華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院,湖北 武漢 430077)

    目的探討淫羊藿苷對(duì)成骨細(xì)胞分化及其細(xì)胞內(nèi)Wnt/-catenin信號(hào)通路的影響。方法取SD大鼠,采用全骨髓貼壁法分離并體外培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rBMSC),并用貼壁篩選法進(jìn)行體外培養(yǎng)rBMSC,給予淫羊藿苷3、6、9 d后,觀察對(duì)照組與淫羊藿苷處理組的堿性磷酸酶 (ALP)活性,對(duì)堿性磷酸酶陽性克?。–FUALP-F)以及礦化結(jié)節(jié)形成的影響。采用Western blot方法檢測(cè)每組-catenin和Runx2組蛋白表達(dá)水,采用RT-PCR方法檢測(cè)淫羊藿苷對(duì)Wnt10b、GSK-3、-catenin及LEF1 mRNA水平的影響。結(jié)果淫羊藿苷可以提高ALP的活性,堿性磷酸酶克隆數(shù)和礦化結(jié)節(jié)的形成。Western blot結(jié)果顯示,淫羊藿苷可以提高-catenin和Runx2的蛋白表達(dá)水平;RT-PCR結(jié)果顯示,淫羊藿苷可以提高Wnt10b、GSK-3、-catenin及LEF1表達(dá)水平。結(jié)論初步證明淫羊藿苷可以激活Wnt/-catenin信號(hào)通路,參與并調(diào)控BMSC的成骨分化。

    淫羊藿苷 成骨細(xì)胞 成骨分化 Wnt/-catenin信號(hào)通路

    成骨細(xì)胞(PB)來源于中胚層內(nèi)外骨膜、骨髓基質(zhì)的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs),MSCs有著多向分化潛能,并在體內(nèi)復(fù)雜的調(diào)控因素的作用下可以分化成骨祖細(xì)胞,從而形成前成骨細(xì)胞(preosteoblast),MSCs的成骨分化是骨形成的重要過程[1]。多項(xiàng)研究表明,Wnt/-catenin信號(hào)通路在成骨細(xì)胞分化及骨的形成過程中具有重要的作用[2-4]。淫羊藿苷是從中藥淫羊藿內(nèi)提取出的單體,對(duì)抗骨質(zhì)疏松具有顯著的效果,可以抑制前體破骨細(xì)胞的增殖,進(jìn)而減少破骨細(xì)胞的形成[5]。并且研究表明,淫羊藿苷在治療骨質(zhì)疏松的過程中有著顯著的效果[6-7]。為探究淫羊藿苷對(duì)成骨細(xì)胞成骨分化,以及對(duì)Wnt/-catenin信號(hào)通路調(diào)控的關(guān)系,本實(shí)驗(yàn)取大鼠rBMSC為研究對(duì)象,對(duì)上述機(jī)制進(jìn)行研究。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料 SD大鼠5只,體質(zhì)量200~250 g,購自中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。DMEM/F12培養(yǎng)液(Thermo Scientific Hyclone公司);胎牛血清(FBS,Gibco公司);青鏈霉素、25%Trypsin-EDTA(上海北諾生物科技有限公司);淫羊藿苷、甘油磷酸鈉、地塞米松、抗壞血酸、MTT試劑、DMSO、茜紅素(上海源葉生物科技有限公司);總RNA提取試劑盒、堿性磷酸酶測(cè)定試劑、SYBR Green熒光定量預(yù)混試劑 (浙江愛康生物科技有限公司);引物、-catenin、Runx-2單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(北京奧科鼎盛生物科技有限公司)。

    1.2 rBMSCs的分離培養(yǎng) 用頸椎脫臼法處死大鼠,浸泡于75%乙醇中20 min,在無菌條件下分離股骨和脛骨,用注射器抽取適量DMEM/F12沖洗骨髓腔。用微量移液器吹打收集的沖洗液后靜置10 min。將上清液在1000 r/min離心5 min后棄去上清液,用含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基使細(xì)胞重懸,吹打數(shù)次后計(jì)數(shù),以106個(gè)/cm2的密度接種在6孔板中,并在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。3 d后開始更換培養(yǎng)液,每天觀察細(xì)胞情況,當(dāng)90%貼壁細(xì)胞融合時(shí),用胰酶消化傳代培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞傳代至第3代時(shí)開始實(shí)驗(yàn),96孔板、24孔板、6孔板接種密度分別為2×104、2×106、4× 106細(xì)胞/孔。

    1.3 ALP活性檢測(cè) 取96孔板,接種并培養(yǎng)細(xì)胞24 h,然后將細(xì)胞進(jìn)行成骨性誘導(dǎo)。并給予藥物處理,淫羊藿苷濃度為分別為0.6、1.2、5、8、10、20 mol/L。對(duì)照組和處理組的培養(yǎng)液中均含有0.1%的DMSO。在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3、6、9 d,每3日更換1次培養(yǎng)液,PBS沖洗2次,將基質(zhì)液和緩沖液各50 L加入每孔中,置于37℃溫水中15 min。再加入150 L的顯影液,在520 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度(OD)。結(jié)果用每孔15 min內(nèi)產(chǎn)生酚的量表示。

    1.4 CFUALP-F分析 取12孔板,接種并培養(yǎng)細(xì)胞24h,然后將細(xì)胞進(jìn)行成骨性誘導(dǎo)。處理組加入10 mol/L的淫羊藿苷,對(duì)照組給予空白誘導(dǎo)培養(yǎng)液,對(duì)照組和處理組的培養(yǎng)液中均含有0.1%的DMSO。7 d后進(jìn)行ALP組織化學(xué)染色,用PBS漂洗2次后加入基質(zhì)液,靜置30 min后再用PBS漂洗,固定。然后用IPP6.0軟件進(jìn)行CFUALP-F灰度值、數(shù)量和面積的測(cè)定。

    1.5 礦化結(jié)節(jié)的形成 取24孔板,接種并培養(yǎng)細(xì)胞24h,然后將細(xì)胞進(jìn)行成骨性誘導(dǎo)。處理組加入10 mol/L的淫羊藿苷,對(duì)照組給予空白誘導(dǎo)培養(yǎng)液,對(duì)照組和處理組的培養(yǎng)液中均含有0.1%的DMSO。12 d后棄去培養(yǎng)液,用PBS漂洗2次后加入基茜紅素,并置于37℃環(huán)境中1 h,然后用IPP6.0軟件進(jìn)行礦化結(jié)節(jié)灰度值、數(shù)量和面積的測(cè)定。

    1.6 RT-CPR檢測(cè) 取6孔板,接種并培養(yǎng)細(xì)胞24 h,然后將細(xì)胞進(jìn)行成骨性誘導(dǎo)。處理組給予淫羊藿苷10 mol/L,對(duì)照組給予空白誘導(dǎo)培養(yǎng)液。分別在8、24、48 h候提取總RNA,檢測(cè)純度及濃度,并調(diào)整RNA的濃度至1 g,再取1L逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。加入引物和SYBR Green試劑,用兩步法對(duì)cDNA擴(kuò)增。并記錄CT(cycle threshold)值,ΔΔCT=(CT目的基因-CT內(nèi)參基因)處理組-(CT目的基因-CT內(nèi)參基因)對(duì)照組,計(jì)算各組2-ΔΔCT,結(jié)果即為目的基因處理組mRNA表達(dá)和對(duì)照組mRNA的倍數(shù)。

    1.7 Western blot檢測(cè) 取6孔板,接種并培養(yǎng)細(xì)胞24 h,然后將細(xì)胞進(jìn)行成骨性誘導(dǎo)。處理組分別給予淫羊藿苷5、10、20 mol/L,對(duì)照組給予空白誘導(dǎo)培養(yǎng)液。3 d后,提取細(xì)胞總蛋白。BCA法檢測(cè)蛋白的濃度,加入含溴酚藍(lán)上樣緩沖液,95℃水浴5 min。在SDSPAGE凝膠進(jìn)行電泳,然后將蛋白移至PVDF膜上,PVDF膜置于含5%脫脂奶粉的TBST中,并在室溫下?lián)u床封閉2h,再加入-catenin、Runx2、-actin的一抗,在4℃環(huán)境下放置過夜。第2日,用TBST漂洗PVDF膜3次,每次10 min。用含標(biāo)記辣根過氧化物的二抗,在室溫下?lián)u晃2 h。漂洗3次后,PVDF膜上涂抹發(fā)光液,并置于暗室內(nèi)曝光。晾干后,用IPP6.0軟件測(cè)定灰度值。

    1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0軟件。計(jì)量資料以(s)表示,組間差異分析比較采用方差分析,檢驗(yàn)水平=0.05。

    2 結(jié) 果

    2.1 不同濃度的淫羊藿苷對(duì)ALP活性的影響 見圖1。如圖1所示,rBMSC誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞后,隨著時(shí)間的增加,ALP活性的也隨之增加,在第9天時(shí)其活性達(dá)到最高。不同濃度淫羊藿苷作用下,第6天和第9天時(shí)的ALP活性均有所提高。并且在濃度為10 mol/L淫羊藿苷作用下ALP活性增加至最高,在濃度為20 mol/L淫羊藿苷的作用下ALP活性稍有減少。

    圖1 不同濃度的淫羊藿苷對(duì)ALP活性的影響

    2.2 淫羊藿苷對(duì)CFUALP-F的影響 見表1。加入淫羊藿苷5、10、20 mol/L后,將3個(gè)處理組和對(duì)照組形成CFUALP-F的灰度值、數(shù)量和面積進(jìn)行對(duì)比分析,3個(gè)處理組CFUALP-F的灰度值、數(shù)量和面積高于對(duì)照組(P<0.05)。

    表1 各組CFUALP-F的灰度值、數(shù)量和面積的方差分析(s)

    表1 各組CFUALP-F的灰度值、數(shù)量和面積的方差分析(s)

    與對(duì)照組比較,△P<0.05。

    組別 灰度值 數(shù)量 面積對(duì)照組 23658.24±7.26 422.38±44.55 31.69±8.33 5 mol/L組 44054.12±4.89△846.01±75.93△56.87±7.12△10 mol/L組 59873.75±6.60△966.51±69.18△77.34±8.96△20 mol/L組 50770.15±5.27△870.23±52.46△69.05±5.45△

    2.3 淫羊藿苷對(duì)礦化結(jié)節(jié)形成的影響 見表2。加入淫羊藿苷 5、10、20 mol/L后,3個(gè)處理組 Wnt10b、GSK-3、-catenin、LEF1 mRNA表達(dá)水平明顯提高。且在36 h時(shí),淫羊藿苷對(duì)Wnt 10 b和LEF1 mRNA表達(dá)水平的影響最顯著。

    表2 不同時(shí)間下10 mol/L淫羊藿苷對(duì)Wnt/-catenin的mRNA表達(dá)水平影響的方差分析(s)

    表2 不同時(shí)間下10 mol/L淫羊藿苷對(duì)Wnt/-catenin的mRNA表達(dá)水平影響的方差分析(s)

    與12、24 h比較,*P<0.05。

    時(shí)間 -catenin LEF1 Wnt 10 b GSK-3 12 h 5.12±0.05 3.59±0.05 24 h 5.53±0.28 3.47±0.56 16.03±2.58 4.69±0.03 20.29±2.63 4.87±0.24 36 h 6.48±0.17*13.93±1.18*24.76±2.70*5.34±0.96*

    2.4 淫羊藿苷對(duì)-catenin和Runx2蛋白表達(dá)水平對(duì)影響 加入淫羊藿苷 5、10、20 mol/L 3 d后,采用Western blot對(duì)-catenin和Runx2蛋白表達(dá)水平檢測(cè)。結(jié)果顯示,在10 mol/L濃度淫羊藿苷下,Runx2蛋白表達(dá)水平的提高較為明顯,而-catenin蛋白表達(dá)水平在3種濃度下的淫羊藿苷均有提高。

    3 討 論

    目前,許多骨質(zhì)疏松、關(guān)節(jié)炎等骨關(guān)節(jié)疾病影響著人們的健康及生活質(zhì)量。特別是對(duì)于絕經(jīng)期后,體內(nèi)雌激素下降的女性,更易引發(fā)骨質(zhì)疏松。淫羊藿苷是淫羊藿的主要活性成分。多項(xiàng)研究表明,淫羊藿苷可以有效防治骨質(zhì)疏松、延緩衰老、抗腫瘤等功效[8-9]。相比較其他藥物對(duì)防治骨質(zhì)疏松的過程中,如降鈣素、雌激素等,使用淫羊藿苷后的不良反應(yīng)及并發(fā)癥較少,服用時(shí)更為安全。

    Wnt/-catenin信號(hào)通路對(duì)骨的形成和重建過程中有著重要的作用。該通路可以激活因子,從而促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化。-catenin在成骨細(xì)胞分化過程中起著關(guān)鍵的作用,是成骨細(xì)胞分化早期階段不可或缺的,在-catenin剔除的小鼠中,MSCs前體細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化,而沒有形成成骨細(xì)胞[10]。當(dāng)-catenin與 LEF1/TCF和Smad4形成復(fù)合物時(shí),可促使Smad4進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi),調(diào)控Wnt靶基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn),Wnt10b可活化-catenin表達(dá)水平,激活Wnt/-catenin信號(hào)通路,從而促進(jìn)成骨細(xì)胞形成和成骨細(xì)胞向成骨分化以及骨細(xì)胞的礦化[11]。Runx2在BMSCs成骨分化中也起到關(guān)鍵的作用,Runx2基因表達(dá)活性影響Wnt/ -catenin信號(hào)通路調(diào)控成骨細(xì)胞成骨分化。Runx2可以和OCN啟動(dòng)子上的特異性元件結(jié)合調(diào)控成骨細(xì)胞的分化過程,同時(shí)Runx2可以提高Colla1的表達(dá)水平。缺失Runx2基因會(huì)降低BMSCs向成骨細(xì)胞分化的能力。研究發(fā)現(xiàn),Runx2基因突變的小鼠不會(huì)形成肋骨,而且出生不久便會(huì)死亡,經(jīng)組織切片發(fā)現(xiàn)小鼠沒有成骨細(xì)胞的形成[12]。此外,淫羊藿苷可以明顯增加ALP的活性,而ALP則是成骨細(xì)胞分化的早期標(biāo)志[13]。

    體內(nèi)激素水平可以影響Wnt/-catenin信號(hào)通路和Runx2表達(dá)水平,從而影響著成骨細(xì)胞的增殖與分化。女性絕經(jīng)后體內(nèi)雌激素水平明顯下降,極易引發(fā)骨質(zhì)疏松。而淫羊藿苷的有效成分為黃酮類化合物,可以預(yù)防和治療因激素水平而造成的骨質(zhì)疏松。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,淫羊藿苷可以使Wnt10b、GSK-3、-catenin、LEF1 mRNA表達(dá)水平明顯提高。Western blot結(jié)果提示,淫羊藿苷可以提高-catenin和Runx2的蛋白表達(dá)水平。說明淫羊藿苷可以通過激活Wnt/-catenin信號(hào)通路,參與并調(diào)控BMSC向成骨細(xì)胞分化。

    近年來,淫羊藿苷在治療骨質(zhì)疏松、關(guān)節(jié)炎等骨關(guān)節(jié)疾病的研究取得了很大的進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn),淫羊藿苷可以激活Wnt/-catenin信號(hào)通路能夠促進(jìn)了成骨細(xì)胞的增殖與分化。但是,Wnt/-catenin信號(hào)通路中一些信號(hào)過度增強(qiáng)反而會(huì)誘導(dǎo)BMCs衰老[14]。因此,對(duì)Wnt/-catenin信號(hào)通路信號(hào)的強(qiáng)弱把控以及 Wnt/ -catenin信號(hào)通路中其他相關(guān)因子有待于進(jìn)一步研究,以期使我們能更深一步的了解淫羊藿苷促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化的機(jī)制,為臨床防治骨關(guān)節(jié)疾病提供有力依據(jù)。

    [1] Kasten P,Vogel J,Luginühl R,et al.Influence of platelet-rich plasma on osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells and ectopic bone formation in calcium phosphate ceramics[J].Cells Tissues Organs,2006,183(2):68-79.

    [2] Cawthorn WP,Bree AJ,Yao Y,et al.Wnt6,Wnt10a and Wnt 10 b inhibit adipogenesis and stimulate osteoblastogenesis through a-catenin-dependent mechanism[J].Bone,2012,50(2):477-489.

    [3] Davidson ENB,Vitters EL,Vanderkraan PM,et al.Expression of transforming growth factor-beta(TGFbeta)and TGFbeta signaling molecule SMAD-2P in spontaneous and instabilityinduced osteoarthritis:role in cartilage degradation,chondro-genesis and osteophyte formation[J].Ann Rheum Dis,2006,65(11):1414-1421.

    [4] Velasco J,Zarrabeitia MT,Prieto JR,et al.Wnt pathway genes in osteoporosis and osteoarthritis:differential expression and genetic association study[J].Osteoporos Int,2012,21(10):109.

    [5] Qin L,Zhang G,Hung W Y,et al.Phytoestrogen-rich herb formula”XLGB”prevents OVX-induced deterioration of musculoskeletal tissues at the hip in old rats[J].J Bone Miner Metab,2005,23(S1):55-61.

    [6] 訾慧,李可強(qiáng),鄭洪新.補(bǔ)腎壯骨滴丸中淫羊藿苷在骨質(zhì)疏松模型與正常大鼠體內(nèi)組織分布比較[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2015,33(12):2856-2859

    [7] 朱彤彤,黃連弟,李俊瑋,等.淫羊藿苷對(duì)去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥等保護(hù)作用及其機(jī)制[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2016,42(5):915-919.

    [8] 劉波,張睿,徐彭,等.淫羊藿對(duì)去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松的影響[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2013,19(7):178-181.

    [9] Wang ZQ,Li JL,Sun YL,et al.Chinese herbal medicine for osteoporosis:a systematic review of a randomized controlled trails[J].Evid Based Complement Alternat Med,2013,2013(1):57-65.

    [10]Krishnan V,Bryant HU,Macdougal OA.Regulation of bone mass by Wnt signaling[J].J Clin Invest,2006,116(5):1202-1209.

    [11]Bennett CN,Longo KA,Wright WS,et al.Regulation of osteoblastogenesis and bone mass by Wnt10b[J].Proc Acad Sci USA,2005,102(9):3324-3329.

    [12]賈忠寶,張柳,田發(fā)明.Wnt/-catenin信號(hào)通路主要因子于成骨細(xì)胞研究進(jìn)展[J].中國骨質(zhì)疏松雜志,2012,18(1):90-94.

    [13]Enomoto H,F(xiàn)ruuihi T,Zanma A,et al.RUNX2 deficiency in chondrocytes causes adipogenic changes invitro[J].J Cell Sci,2004,117(3):417-425.

    [14]Zhang DZ,Wang HJ,Tan YZ,et al.Wnt 3a promotes proliferation and suppresses osteogenic differentiation of adult human mesenchymal stem cells[J].J Cell Biochem,2004,93(6):1210-1230.

    Effect of Icariin on Osteogenic Differentiation of Osteoblasts and Research on the Relationship of Wnt/-catenin Signal System

    TU Yan,XIONG Lina,LIU XiangJie,et al. Liyuan Hospital Affiliated to Tongji Medical College Huazhong University of Science and Technology,Hubei,Wuhan 430077,China.

    Objective:To investigate the effect of icariin on osteogenic differentiation of osteoblasts and Wnt/-catenin signaling pathway in the cells.Methods:SD rats were selected and rat bone marrow derived mesenchymal stem cells(rBMSC)were isolated and cultured by whole bone marrow adherent method in vitro,with adherent screening method.On the 3rd,6th and 9th day being treated with icariin,alkaline phosphatase(ALP)activity was observed in the control group and icariin treatment group,the alkaline phosphatase positive clone(CFUALP-F)and the influence of the formation of mineralized nodules were observed.Western blot method was used to detect the expression of-catenin and Runx2 protein in each group.The effect of Wnt10b,GSK-3,-catenin and LEF1 mRNA levels were detected by RT-PCR method.Results:The activity of ALP,the number of alkaline phosphatase and the formation of mineralized nodules could be enhanced by the activity of the alkaline phosphatase. Western blot results showed that the protein expression levels of-catenin and Runx2 could be improved by the expression of the protein.RT-PCR results showed that the expression levels of Wnt10b,GSK-3,-catenin and LEF1 were increased.Conclusion:Icariin can activate the Wnt/-catenin signaling pathway and participate in and regulate the BMSC osteogenic differentiation.

    Icariin;Osteoblast;Osteogenic differentiation;Wnt/-catenin signal pathway

    R285.5

    A

    1004-745X(2017)03-0448-04

    10.3969/j.issn.1004-745X.2017.03.023

    2016-12-06)

    華中科技大學(xué)院系自主創(chuàng)新研究基金(2016YXMS127)

    △通信作者(電子郵箱:huyanyan@163.com)

    猜你喜歡
    藿苷成骨成骨細(xì)胞
    淫羊藿中朝藿苷A、B和C的酶轉(zhuǎn)化及其稀有箭藿苷的制備
    經(jīng)典Wnt信號(hào)通路與牙周膜干細(xì)胞成骨分化
    新型雙相酶水解體系制備寶藿苷I
    中成藥(2018年12期)2018-12-29 12:26:00
    雙藿苷A分子印跡聚合物的制備及應(yīng)用
    中成藥(2017年4期)2017-05-17 06:09:49
    糖尿病大鼠Nfic與成骨相關(guān)基因表達(dá)的研究
    淫羊藿次苷Ⅱ通過p38MAPK調(diào)控成骨細(xì)胞護(hù)骨素表達(dá)的體外研究
    土家傳統(tǒng)藥刺老苞總皂苷對(duì)2O2誘導(dǎo)的MC3T3-E1成骨細(xì)胞損傷改善
    液晶/聚氨酯復(fù)合基底影響rBMSCs成骨分化的研究
    30例Ⅰ型成骨不全患者股骨干骨折術(shù)后康復(fù)護(hù)理
    Bim在激素誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡中的表達(dá)及意義
    成人国语在线视频| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 久久香蕉精品热| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 香蕉丝袜av| 欧美日本中文国产一区发布| 国产精品日韩av在线免费观看 | 欧美激情 高清一区二区三区| 亚洲精品一二三| 精品人妻在线不人妻| 精品一区二区三卡| 精品一品国产午夜福利视频| 美女大奶头视频| 日韩精品免费视频一区二区三区| 91成人精品电影| 国产成人系列免费观看| 97碰自拍视频| 在线观看一区二区三区激情| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 一区二区日韩欧美中文字幕| 男人舔女人下体高潮全视频| 一区福利在线观看| 久热这里只有精品99| 免费av毛片视频| 国产精品国产av在线观看| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 久久精品国产清高在天天线| 亚洲,欧美精品.| 国产91精品成人一区二区三区| 日韩欧美三级三区| 亚洲中文av在线| 香蕉丝袜av| 这个男人来自地球电影免费观看| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| bbb黄色大片| 精品久久久久久电影网| 国产麻豆69| av网站在线播放免费| av天堂久久9| 久久久久久久久免费视频了| 一区二区三区国产精品乱码| 国产伦一二天堂av在线观看| 国产乱人伦免费视频| 欧美成人午夜精品| 欧美日韩黄片免| 午夜免费成人在线视频| 99re在线观看精品视频| 亚洲第一青青草原| 国产欧美日韩精品亚洲av| 视频区欧美日本亚洲| 日韩欧美免费精品| 69av精品久久久久久| 久久久久国内视频| 一区在线观看完整版| 精品无人区乱码1区二区| 欧美一级毛片孕妇| 正在播放国产对白刺激| 级片在线观看| 脱女人内裤的视频| 91在线观看av| 老司机在亚洲福利影院| 999久久久国产精品视频| 美女大奶头视频| 欧美激情 高清一区二区三区| 国产免费现黄频在线看| 亚洲七黄色美女视频| 一边摸一边抽搐一进一小说| 纯流量卡能插随身wifi吗| 激情在线观看视频在线高清| 超碰97精品在线观看| 久久欧美精品欧美久久欧美| 日韩精品免费视频一区二区三区| 欧美黄色片欧美黄色片| av有码第一页| 人成视频在线观看免费观看| 99riav亚洲国产免费| 男人操女人黄网站| 老司机午夜福利在线观看视频| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 热re99久久国产66热| 曰老女人黄片| 亚洲精品中文字幕在线视频| 午夜影院日韩av| 他把我摸到了高潮在线观看| 亚洲男人天堂网一区| 天天添夜夜摸| 亚洲国产欧美一区二区综合| tocl精华| 国产亚洲欧美98| 高清在线国产一区| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| www日本在线高清视频| 热re99久久精品国产66热6| 午夜影院日韩av| 午夜免费观看网址| 女性生殖器流出的白浆| 久久久久久久久久久久大奶| 制服诱惑二区| 一级片'在线观看视频| 亚洲精品久久午夜乱码| a级毛片黄视频| 精品国产亚洲在线| 国产成人欧美| 色在线成人网| 亚洲av成人av| cao死你这个sao货| 免费不卡黄色视频| 国产在线精品亚洲第一网站| 国产精品 欧美亚洲| 日韩大尺度精品在线看网址 | 久久人妻av系列| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 欧美日韩精品网址| 日韩中文字幕欧美一区二区| 自线自在国产av| 亚洲少妇的诱惑av| 欧美午夜高清在线| 国产成人精品在线电影| 日韩大码丰满熟妇| 亚洲欧美激情综合另类| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 黄色怎么调成土黄色| www日本在线高清视频| 午夜视频精品福利| 国产一区在线观看成人免费| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 极品教师在线免费播放| 日韩大码丰满熟妇| 99久久国产精品久久久| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 一级毛片高清免费大全| 国产精品一区二区精品视频观看| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 天天影视国产精品| 亚洲精品美女久久av网站| 电影成人av| 女警被强在线播放| 国产高清国产精品国产三级| 亚洲av片天天在线观看| 黄色成人免费大全| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 久久久久亚洲av毛片大全| 日韩欧美一区视频在线观看| videosex国产| 男人的好看免费观看在线视频 | 国产人伦9x9x在线观看| 精品国产国语对白av| 热re99久久精品国产66热6| 国产真人三级小视频在线观看| 深夜精品福利| 亚洲九九香蕉| 中亚洲国语对白在线视频| 女警被强在线播放| 久久久久精品国产欧美久久久| 男男h啪啪无遮挡| 午夜激情av网站| 男人舔女人的私密视频| 久久狼人影院| 国产精品日韩av在线免费观看 | 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 一级a爱视频在线免费观看| 国产成人系列免费观看| 国产欧美日韩精品亚洲av| 一夜夜www| 精品无人区乱码1区二区| 国产片内射在线| 久久国产亚洲av麻豆专区| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 日韩成人在线观看一区二区三区| 天堂动漫精品| 母亲3免费完整高清在线观看| 亚洲免费av在线视频| 国产精品一区二区免费欧美| ponron亚洲| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 日韩欧美三级三区| 精品国产乱码久久久久久男人| 丝袜人妻中文字幕| 午夜久久久在线观看| 香蕉久久夜色| 国产精品99久久99久久久不卡| 欧美乱色亚洲激情| 一区二区三区激情视频| 亚洲熟女毛片儿| 色在线成人网| av有码第一页| 国产色视频综合| 亚洲男人的天堂狠狠| 黑人操中国人逼视频| 免费在线观看影片大全网站| 午夜福利一区二区在线看| 久久中文字幕一级| 久9热在线精品视频| 亚洲男人的天堂狠狠| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 国产三级在线视频| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 欧美日韩视频精品一区| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 一边摸一边做爽爽视频免费| 欧美在线黄色| 久久久久久久午夜电影 | 国产亚洲av高清不卡| 国产精品久久久av美女十八| 国产免费现黄频在线看| 99在线视频只有这里精品首页| 色尼玛亚洲综合影院| av电影中文网址| 韩国精品一区二区三区| 五月开心婷婷网| 中文欧美无线码| 又大又爽又粗| 夜夜看夜夜爽夜夜摸 | 在线播放国产精品三级| 国产麻豆69| 国产精品一区二区三区四区久久 | 999精品在线视频| 婷婷精品国产亚洲av在线| 亚洲中文av在线| 成人黄色视频免费在线看| 两个人看的免费小视频| 老司机在亚洲福利影院| 亚洲第一av免费看| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 日本vs欧美在线观看视频| 丁香六月欧美| 一区二区三区激情视频| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 亚洲av熟女| 大码成人一级视频| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| www.自偷自拍.com| 国产精品日韩av在线免费观看 | 两性夫妻黄色片| 国产人伦9x9x在线观看| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 搡老岳熟女国产| 亚洲九九香蕉| 夜夜夜夜夜久久久久| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 精品电影一区二区在线| 天堂动漫精品| 国产精品成人在线| 久久久久精品国产欧美久久久| 成年版毛片免费区| 免费少妇av软件| 欧美日韩乱码在线| 桃色一区二区三区在线观看| 搡老熟女国产l中国老女人| 18禁观看日本| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 国产欧美日韩一区二区精品| 精品久久久久久久久久免费视频 | 五月开心婷婷网| bbb黄色大片| 中文字幕高清在线视频| 日韩免费av在线播放| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 高清毛片免费观看视频网站 | 日韩精品中文字幕看吧| 国产精品综合久久久久久久免费 | 久热爱精品视频在线9| 欧美日本亚洲视频在线播放| 叶爱在线成人免费视频播放| 欧美中文日本在线观看视频| 91在线观看av| 国产精品影院久久| 久久中文字幕一级| 国产精品亚洲av一区麻豆| 美国免费a级毛片| 新久久久久国产一级毛片| 91成年电影在线观看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 精品高清国产在线一区| 男女午夜视频在线观看| 香蕉丝袜av| 欧美成人免费av一区二区三区| 九色亚洲精品在线播放| 国产真人三级小视频在线观看| 51午夜福利影视在线观看| 色综合欧美亚洲国产小说| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 久久人妻熟女aⅴ| 无遮挡黄片免费观看| 黑丝袜美女国产一区| 国产麻豆69| 久久国产亚洲av麻豆专区| 日本五十路高清| av在线天堂中文字幕 | 欧美乱码精品一区二区三区| 国产在线观看jvid| 大型av网站在线播放| 成熟少妇高潮喷水视频| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 后天国语完整版免费观看| 国产激情欧美一区二区| 嫩草影视91久久| 女性生殖器流出的白浆| 女人被狂操c到高潮| 美国免费a级毛片| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 一级片免费观看大全| 正在播放国产对白刺激| 亚洲精品国产区一区二| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 三级毛片av免费| 国产熟女xx| avwww免费| 国产成人影院久久av| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 国产成年人精品一区二区 | 精品福利观看| 欧美黄色片欧美黄色片| 久久久国产成人免费| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 99国产综合亚洲精品| 首页视频小说图片口味搜索| a级毛片黄视频| 在线免费观看的www视频| 香蕉国产在线看| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 午夜免费观看网址| 欧美日韩福利视频一区二区| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 波多野结衣av一区二区av| 亚洲性夜色夜夜综合| 成人三级做爰电影| 色老头精品视频在线观看| 午夜a级毛片| 视频在线观看一区二区三区| 国产精品一区二区免费欧美| 精品电影一区二区在线| 国产av精品麻豆| 国产成人啪精品午夜网站| 天堂俺去俺来也www色官网| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 超碰成人久久| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 久99久视频精品免费| 欧美性长视频在线观看| 久久精品国产清高在天天线| 国产熟女午夜一区二区三区| 欧美乱码精品一区二区三区| 亚洲第一av免费看| 啪啪无遮挡十八禁网站| 精品久久久久久久久久免费视频 | 一个人免费在线观看的高清视频| 成熟少妇高潮喷水视频| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 亚洲第一青青草原| 无人区码免费观看不卡| 欧美性长视频在线观看| 黄片小视频在线播放| 精品久久久久久电影网| 激情在线观看视频在线高清| 91精品三级在线观看| 国产97色在线日韩免费| 一级a爱视频在线免费观看| 十八禁网站免费在线| 免费不卡黄色视频| 欧美日韩精品网址| 国产一区二区三区综合在线观看| 国产成人欧美在线观看| 午夜两性在线视频| 一个人免费在线观看的高清视频| 久久伊人香网站| 亚洲成人久久性| 午夜亚洲福利在线播放| 久久影院123| 久久人人97超碰香蕉20202| а√天堂www在线а√下载| 国产高清videossex| 乱人伦中国视频| 久久精品91无色码中文字幕| 国产成人免费无遮挡视频| 亚洲第一av免费看| 久久香蕉激情| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 岛国视频午夜一区免费看| 精品久久久久久电影网| 少妇 在线观看| 久久精品人人爽人人爽视色| 校园春色视频在线观看| 国产99白浆流出| 午夜亚洲福利在线播放| 丰满迷人的少妇在线观看| 精品人妻1区二区| 日韩高清综合在线| 搡老熟女国产l中国老女人| 午夜免费观看网址| 亚洲成a人片在线一区二区| 日韩中文字幕欧美一区二区| 久久精品影院6| 久久久国产一区二区| 自线自在国产av| av超薄肉色丝袜交足视频| 亚洲中文日韩欧美视频| 久久狼人影院| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 免费日韩欧美在线观看| 天堂√8在线中文| 亚洲国产中文字幕在线视频| 乱人伦中国视频| 丝袜人妻中文字幕| 国产精品久久久久成人av| 99精品欧美一区二区三区四区| 精品熟女少妇八av免费久了| 热99国产精品久久久久久7| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 久久久国产欧美日韩av| 亚洲国产欧美一区二区综合| 久久国产亚洲av麻豆专区| 国产免费av片在线观看野外av| 热99re8久久精品国产| 精品国产亚洲在线| 午夜亚洲福利在线播放| 国产成人av激情在线播放| 国产高清视频在线播放一区| 男女之事视频高清在线观看| 丁香六月欧美| 国产91精品成人一区二区三区| 成年女人毛片免费观看观看9| 大型黄色视频在线免费观看| 在线观看午夜福利视频| 黑人操中国人逼视频| 国产精品二区激情视频| 成年女人毛片免费观看观看9| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 日本免费a在线| 最近最新中文字幕大全电影3 | 免费在线观看黄色视频的| 一级黄色大片毛片| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| √禁漫天堂资源中文www| 91字幕亚洲| 青草久久国产| 欧美精品啪啪一区二区三区| 国产午夜精品久久久久久| 久久热在线av| 少妇被粗大的猛进出69影院| 性欧美人与动物交配| 少妇粗大呻吟视频| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 黑人操中国人逼视频| 亚洲,欧美精品.| 国产区一区二久久| 免费在线观看影片大全网站| 亚洲av第一区精品v没综合| 视频在线观看一区二区三区| 亚洲精品国产色婷婷电影| 老汉色∧v一级毛片| 高清黄色对白视频在线免费看| 一级毛片高清免费大全| 日韩欧美三级三区| 桃色一区二区三区在线观看| 欧美乱码精品一区二区三区| 他把我摸到了高潮在线观看| 国产欧美日韩一区二区精品| 国产激情欧美一区二区| 国产av一区二区精品久久| 国产精品一区二区精品视频观看| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| www.999成人在线观看| 午夜成年电影在线免费观看| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 后天国语完整版免费观看| 97人妻天天添夜夜摸| 久久中文字幕人妻熟女| 脱女人内裤的视频| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 亚洲成a人片在线一区二区| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 亚洲五月婷婷丁香| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 黄色成人免费大全| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 色播在线永久视频| 亚洲精品粉嫩美女一区| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 国产免费av片在线观看野外av| 夫妻午夜视频| 亚洲国产看品久久| 国产极品粉嫩免费观看在线| 妹子高潮喷水视频| www.www免费av| 午夜激情av网站| 国产成人精品久久二区二区91| 韩国av一区二区三区四区| 久久久国产精品麻豆| 国产激情欧美一区二区| 在线免费观看的www视频| svipshipincom国产片| 精品国产一区二区三区四区第35| 欧美丝袜亚洲另类 | 又紧又爽又黄一区二区| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 黄色a级毛片大全视频| 欧美激情 高清一区二区三区| 久久久国产一区二区| 亚洲成人免费av在线播放| 人人妻人人澡人人看| 亚洲中文字幕日韩| 日韩人妻精品一区2区三区| 亚洲国产精品合色在线| 91av网站免费观看| 咕卡用的链子| 久久久精品欧美日韩精品| 国产精品野战在线观看 | 丰满迷人的少妇在线观看| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 国产野战对白在线观看| 操出白浆在线播放| 老汉色∧v一级毛片| 久久午夜亚洲精品久久| 亚洲中文字幕日韩| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 亚洲七黄色美女视频| 无限看片的www在线观看| 久久中文字幕人妻熟女| 国产成人精品久久二区二区免费| 成人免费观看视频高清| 可以在线观看毛片的网站| 日本黄色日本黄色录像| 日日夜夜操网爽| 欧美激情极品国产一区二区三区| 脱女人内裤的视频| 啦啦啦 在线观看视频| 国产成人免费无遮挡视频| 啦啦啦 在线观看视频| 亚洲色图综合在线观看| 99在线人妻在线中文字幕| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 日本精品一区二区三区蜜桃| 久久久久久久久免费视频了| 亚洲激情在线av| 久久影院123| 99热只有精品国产| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 国产91精品成人一区二区三区| 国产高清国产精品国产三级| 1024香蕉在线观看| 人妻久久中文字幕网| 国产xxxxx性猛交| 精品久久久久久成人av| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 国产av一区在线观看免费| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 正在播放国产对白刺激| 在线免费观看的www视频| 高潮久久久久久久久久久不卡| 久久久水蜜桃国产精品网| 在线观看免费高清a一片| 亚洲人成77777在线视频| 亚洲一区二区三区不卡视频| 国产亚洲精品久久久久5区| www日本在线高清视频| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 国产精品国产高清国产av| 在线看a的网站| 日韩精品中文字幕看吧| 免费人成视频x8x8入口观看| av免费在线观看网站| 一边摸一边抽搐一进一小说| 国产精品亚洲一级av第二区| 大香蕉久久成人网| 女同久久另类99精品国产91| 麻豆国产av国片精品| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 午夜老司机福利片| 亚洲成人精品中文字幕电影 | 国产熟女xx| 国产精品av久久久久免费| 国产精品久久久久成人av| 18禁美女被吸乳视频| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 男女下面插进去视频免费观看| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 老鸭窝网址在线观看| 久热爱精品视频在线9| 国产精品偷伦视频观看了| 妹子高潮喷水视频| 国产极品粉嫩免费观看在线| 亚洲精品在线观看二区| 少妇的丰满在线观看| 国产又色又爽无遮挡免费看| 国产精品 欧美亚洲| 免费在线观看完整版高清| 中文字幕av电影在线播放| 99国产综合亚洲精品| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 日韩高清综合在线| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 无人区码免费观看不卡| 无遮挡黄片免费观看| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 国产91精品成人一区二区三区| 黄色怎么调成土黄色| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 大型av网站在线播放| 又紧又爽又黄一区二区| 制服诱惑二区| 神马国产精品三级电影在线观看 | 级片在线观看| 亚洲男人天堂网一区| 精品高清国产在线一区|