磷脂酰肌醇3—激酶在間歇性低氧對抗大鼠心肌缺血/再灌注損傷中的保護機制

王媛媛++曹建++萬建華

[摘要]目的 研究磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）在間歇性低氧（IH）對抗大鼠心肌缺血/再灌注（I/R）損傷中的作用機制。方法 將60只大鼠隨機分為四組，分別為假手術組（n=15）、I/R組（n=15）、IH+I/R組（n=15）、IH+I/R+PI3K抑制劑組（n=15）。將大鼠暴露在低氧循環(huán)制作IH動物模型，通過球囊結扎冠脈方法制作心肌I/R動物模型，通過TTC染色確定梗死面積。采用Western blot法檢測蛋白激酶B（AKt）表達。結果 與I/R組比較，IH+I/R組的心肌梗死面積下降（P<0.05），Akt蛋白表達升高（P<0.05）。與IH+I/R組比較，IH+I/R+PI3K抑制劑組心肌梗死面積增加（P<0.05），Akt蛋白表達下降（P<0.05）。結論 IH在大鼠心肌缺血損傷中具有心臟保護作用，其保護機制與激PI3K信號通路有關。

[關鍵詞]磷脂酰肌醇3-激酶；心肌缺血/再灌注；蛋白激酶B

[中圖分類號] R-332 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）02（c）-0106-03

Protective mechanism of phosphatidylinositol 3- kinase on myocardial ischemia/reperfusion injury induced by intermittent hypoxia in rats

WANG Yuan-yuan1 CAO Jian2▲ WAN Jian-hua3

1.Department of Cardiology，the Third Hospital of Nanchang City，Nanchang 330009，China；2.Department of Anesthesiology，the Second Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang 330006，China；3.Department of Anesthesiology，Hospital of Traditional Chinese Medicine of Jingdezhen City in Jiangxi Province，Jingdezhen 333000，China

[Abstract]Objective To study the mechanisms of phosphatidylinositol 3-kinase PI3K on myocardial ischemia/reperfusion injury induced by intermittent hypoxia in rats.Methods 60 rats were randomly divided into 4 groups，included sham-operated group （n=15），myocardial ischemia/reperfusion group （I/R） （n=15），I/R+intermittent hypoxia （IH） group （n=15） and I/R+IH+PI3K inhibitor group（n=15）.Mice were exposed to intermittent hypoxia cycles to establish the IH model.I/R model was established by ligating the left anterior descending coronary artery，myocardial infarct areas were measured through TCC staining，the expression of phosphorylation of protein kinase B （Akt） was analyzed by Westen blot.Results Compared with the I/R group，the myocardial infarct size of IH+I/R group decreased （P<0.05），the expression of Akt protein increased （P<0.05）.Compared with the IH+I/R group，the myocardial infarction area of IH+I/R+PI3K inhibitor group increased （P<0.05），the expression of Akt protein decreased （P<0.05）.Conclusion There is protective effects of intermittent hypoxia on myocardial ischemia injury in rats，and the protective mechanism is related to the activation of inibitor group PI3K signaling pathway.

[Key words]Phosphatidylinositol 3-kinase；Myocardial ischemia/reperfusion injury；Protein kinase B間歇性低氧（intermittent hypoxia，IH）是機體某種生理和病理狀態(tài)下的低氧形式，一定時間內(nèi)間斷地暴露于低氧環(huán)境，其余時間均處于常氧環(huán)境。給機體反復間斷中等程度的低氧刺激，能增強機體對此種及更高程度低氧的耐受力，從而避免對機體真正的不可逆損傷的產(chǎn)生[1]。早期的動物實驗及流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)，低氧適應可以增加心臟對缺氧缺血損傷的保護作用[2]。磷脂酰肌醇3-激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶（PI3K/Akt）信號途徑是細胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導通路，是由PI3K活化，從而產(chǎn)生的類脂產(chǎn)物，并作為第二信使結合激活下游多種靶蛋白，結合成信號級聯(lián)復合物，調(diào)節(jié)細胞增殖分化凋亡[3-4]。PI3K及下游靶蛋白所組成的信號途徑是目前細胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導通路之一。細胞凋亡的這兩種通路都被認為是PI3K/Akt通路的下游通路，受PI3K-Akt通路的調(diào)控。PI3K超家族在細胞生長、增殖、存活和凋亡過程中發(fā)揮重要作用。Akt是PI3K/Akt激活后的下游效應器。PI3K/Akt通路也可通過調(diào)控Caspase-3、Caspase-8以及Bcl-2家族參與肌細胞凋亡的心肌保護作用。本實驗擬討論PI3K在間歇性低氧對心肌缺血/再灌注（I/R）損傷中的作用機制。

1材料與方法

1.1實驗動物及試劑材料

取8～10周雄性SD大鼠60只，體重（200±20）g，由南昌大學動物實驗中心提供。渥曼青霉素購自Alexis公司，小鼠抗Akt單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；蛋白濃度測定標準品購自普利萊公司；兔抗小鼠辣根過氧化物酶標記的二抗購自美國Sigma公司。

1.2動物模型建立

本實驗研究經(jīng)南昌大學醫(yī)學院動物倫理委員會審查通過，許可證號為SCXK（贛）2009-0001。將實驗動物隨機分為4組，制作老鼠IH模型：暴露在每日4次的低氧循環(huán)（每次接受2 min 6%～8%低氧，然后3 min再氧和處理，5次），IH處理14 d，含氧量正常的降支老鼠作為對照組。假手術組（n=15）：絲線穿過冠狀動脈但左室支但不結扎，通過尾靜脈注射生理鹽水；I/R組（n=15）：參考墊扎球囊法[5]制作大鼠I/R模型；IH+I/R組（n=15）：建立IH動物模型后，制作I/R模型；IH+I/R+PI3K抑制劑組（n=15）：建立IH模型，制作I/R模型時，在冠狀動脈左前降支閉塞15 min前注射PI3K抑制劑-渥曼青霉素（24 μg/kg）。

1.3心肌梗死面積測定

制模結束后處死存活大鼠，取新鮮大鼠心臟，用PBS沖洗，-20℃冰凍30 min切片，再用1% TTC 37℃染色25 min，切片放甲醛過夜增強顏色對比。梗死區(qū)不染色，非心肌梗死區(qū)染色為紅色。掃描儀掃描心臟切片，使用Image proplus 6.0軟件測量相關區(qū)域面積，梗死面積（%）=左心室組織切片梗死區(qū)面積/左心室組織切片總面積×100%。

1.4 Western blot法檢測Akt蛋白表達

制模結束后處死手術處理后的存活大鼠，通過組織顏色改變判斷心肌正常組織和缺血組織，通過Western blot方法來測定Akt蛋白，提取各組心肌組織，按蛋白提取試劑盒說明書提取總蛋白，監(jiān)測蛋白濃度，收集上清液，采用考馬斯亮藍法進行擔保定量。SDS-PAGE分離樣品后電泳轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，常溫下TBST封閉過夜，再加入anti-Akt 小鼠單抗（一抗）、室溫下免疫沉淀1 h，加入兔抗小鼠辣根過氧化物酶標記的二抗2 h。洗膜，顯色。具體方法參照文獻[9]，實驗膠片掃描后用Image J軟件進行圖像分析，比值結果表示蛋白的相對含量，用Gel-ProAnalyzer分析軟件分析通道蛋白的灰度值。

1.5統(tǒng)計學分析

采用SPSS 15.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間兩兩比較應用q檢驗，多組間比較應用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

與I/R組比較，IH+I/R組的心肌梗死面積下降（P<0.05），Akt蛋白表達升高（P<0.05）。與IH+I/R組比較，IH+I/R+PI3K抑制劑組心肌梗死面積增加（P<0.05），Akt蛋白表達下降（P<0.05）（表1）。

3討論

低氧是心肌缺血的主要因素，對引發(fā)缺血性心臟疾病起著重要作用。通過增加心臟對缺血、低/缺氧的耐受性來達到保護心臟的目的是臨床和基礎醫(yī)學研究關注的熱點。IH能增加心肌對I/R損傷的耐受性、減少心肌梗死面積、對抗細胞凋亡、改善I/R心臟舒縮功能。有資料顯示，IH適應可減輕應激、缺血、I/R及心律失常等對心肌的損傷[7-9]，不過目前關于IH的心肌保護作用機制的研究還是非常匱乏。

PI3K是心肌細胞內(nèi)的一個重要生物分子，是細胞內(nèi)信號傳導有關的脂類第二信使，可參與細胞應答，在細胞存活、細胞凋亡、細胞骨架重組、囊泡運輸?shù)榷喾N生物學事件中有重要作用[10-12]。在心肌，PI3K通過信號轉(zhuǎn)導、改善心肌收縮力及間接調(diào)節(jié)鈣通道鈣離子內(nèi)流等方面調(diào)節(jié)心肌功能[13-14]。

PI3K活化底物PI-3，4，5-P3（PIP3）與AKT結合，此時AKT的構型發(fā)生改變，AKT被磷酸化而激活，促進細胞進入到細胞分裂周期并減少細胞凋亡[15]。Akt磷酸化后被激活，激活的Akt可磷酸化eNOS第1177位絲氨酸，使eNOS激活。eNOS是合成NO的限速酶，NO可激活蛋白激酶C和線粒體ATP敏感性鉀離子通道，抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開放，降低線粒體膜通透性，抑制線粒體內(nèi)鈣超載，改善線粒體功能，抑制線粒體釋放凋亡因子而調(diào)控細胞凋亡過程[16-17].

本實驗建立IH模型，發(fā)現(xiàn)IH預處理后可以減輕心肌I/R損傷，使Akt蛋白表達增加，心肌梗死面積下降。PI3K抑制劑（渥曼青霉素）組的Akt蛋白表達降低，心肌梗死面積增加，提示心肌I/R損傷在IH處理后，可以激活PI3K-Akt信號途徑，使AKt磷酸化活化，減少細胞凋亡。PI3K/Akt可能通過活化內(nèi)皮型一氧化氮合酶誘導抗凋亡蛋白表達增加，同時抑制促凋亡蛋白調(diào)控細胞凋亡等多種機制發(fā)揮心肌保護作用，其內(nèi)在機制值得進一步研究探討。

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（收稿日期：2016-12-09 本文編輯：祁海文）