高效液相色譜法測(cè)定板藍(lán)根水提物（R—s）—告依春的含量

金風(fēng)華

[摘要]目的采用高效液相色譜法測(cè)定板藍(lán)根水提物中（R-s）-告依春的含量，對(duì)板藍(lán)根提取物進(jìn)行質(zhì)量控制。方法高效液相所用的色譜柱為phenomenex（250mm×4.6mm，5um），流動(dòng)相為甲醇-水（15：85），流速為1mL/min，柱溫為30°C，檢測(cè)波長(zhǎng)為245nm。結(jié)果在含量測(cè)定中，（R-s）-告依春的質(zhì)量濃度在1.6125～51.6ug/mL范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系（R²=0.99954，n=6）。結(jié)論本方法快速、準(zhǔn)確、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，可以測(cè)定板藍(lán)根藥材中（R-s）-告依春的含量。

[關(guān)鍵詞]板藍(lán)根提取物；高效液相色譜法；（P.-S）-告依春；含量測(cè)定

[中圖分類號(hào)]R286.0

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]B

[文章編號(hào)]2095-0616（2016）23-57-04

板藍(lán)根為十字花科植物菘藍(lán)（Isatis indigoticaFort）的干燥根，載于《神農(nóng)本草經(jīng)》中，是傳統(tǒng)的抗病毒中藥之一。長(zhǎng)時(shí)間的臨床調(diào)查與研究已經(jīng)表明板藍(lán)根具有清熱解毒，涼血利咽的功效?？捎糜诜挝笩釋?dǎo)致的口干舌燥、咽喉腫痛、腮部腫脹、腮腺炎、急性扁桃體炎等癥的治療。板藍(lán)根中含有靛玉紅、（R-S）-告依春、蔗糖、靛藍(lán)、氨基酸等多種有效成分，查閱相關(guān)文獻(xiàn)可知，板藍(lán)根的這幾種成分都有相關(guān)學(xué)者在研究，并且得到了很多的研究成果。（R-S）-告依春是板藍(lán)根中抗病毒的代表性成分，本研究旨在進(jìn)一步制定板藍(lán)根配方顆粒質(zhì)量控制的新方法，為相關(guān)研究提供依據(jù)及參考?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1.材料與儀器

1.1儀器

高效液相色譜儀紫外一可見光（型號(hào)：SPD-16，島津儀器有限公司）；KQ2200型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；（50mL、100mL、1000mL）量筒；微孔濾膜過濾裝置；25mL容量瓶；萬分之一天平。

1.2材料與試劑

板藍(lán)根藥材飲片（安徽源和堂藥業(yè)股份有限公司，151021）；（R-S）-告依春對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究所，251505）；甲醇。

2.板藍(lán)根水提物的制備

以加水量、提取次數(shù)、提取時(shí)間作為三個(gè)研究因素來研究板藍(lán)根的水提工藝。依據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)資料設(shè)置三個(gè)水平參數(shù)，優(yōu)選出最佳的提取工藝。板藍(lán)根提取工藝的提取流程為：用粉碎機(jī)將板藍(lán)根飲片打粉，取2號(hào)及4號(hào)篩中間的粉末和4號(hào)篩篩下的粉末。每次按（過4號(hào)篩不超過40%）的比例取中間粉和篩下粉20g，用自來水提取，用正交設(shè)計(jì)法，設(shè)計(jì)出九組不同的加水量，提取次數(shù)，提取時(shí)間提取工藝，每一組平行重復(fù)三次，將每組提取得到的提取液放入離心機(jī)中離心。取離心過后提取液的上清液，置85℃水浴鍋上水浴蒸發(fā)掉溶劑，將在水浴鍋上蒸的粘稠浸膏放入60℃烘箱中烘干，得干浸膏，計(jì)算出膏率。

3.板藍(lán)根浸膏中（R-S）-告依春的含量測(cè)定

3.1色譜條件

為了使（R-S）一告依春更好地顯現(xiàn)在高效液相分析圖中，需要確定一個(gè)有效的分析方法及檢測(cè)條件。查閱相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)影響供試品中（R-S）一告依春出峰的幾個(gè)因素進(jìn)行考察：色譜柱類型的選擇，流動(dòng)相的選擇及流動(dòng)相比例的選擇，柱溫箱溫度的選擇，流速的選擇及檢測(cè)器的選擇等。

由于C₁₈色譜柱具有適應(yīng)性好，保留值大，穩(wěn)定性好等諸多優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)作為高效液相中使用最廣泛的色譜柱種類之一。色譜柱phenomenex（250ram×4.6mm，5um）的分離效果可以達(dá)到（R-S）-告依春很好的分離，故選用C₁₈色譜柱phenomenex（250mm×4.6mm，5um）。

因?yàn)楸敬螌?shí)驗(yàn)所用流動(dòng)相的比例已經(jīng)確定，故采用等度洗脫的方法，用甲醇和水作為流動(dòng)相，流動(dòng)相的比例為15：85。先把洗脫時(shí)間設(shè)計(jì)為30min，通過用對(duì)照品溶液的摸索，可以得到（R-S）-告依春大約在7.5min左右出峰。所以把洗脫時(shí)間設(shè)計(jì)為10min，每次的進(jìn)樣量為20uL，檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)為245nm，流速設(shè)為1mL/min，柱溫箱的溫度設(shè)為30℃。

3.2溶液的制備

3.2.1對(duì)照品溶液的制備用萬分之一電子天平精密稱?。≧-S）-告依春對(duì)照品1.032mg，加入10mL容量瓶中，加入水至刻度，配成濃度為103.2ug/mL的對(duì)照品溶液。從103.2ug/mL對(duì)照品溶液中精密吸取1mL，并吸取1mL水，加入到剛才吸取的1mL對(duì)照品溶液中，配制成濃度為51.6ug/mL的對(duì)照品溶液，同樣的方法配制濃度為1.6125ug/mL，3.225ug/mL，6.45ug/mL，12.9ug/mL，25.8ug/mL的對(duì)照品溶液。

3.2.2供試品溶液的制備精密稱取一定量的板藍(lán)根浸膏，相當(dāng)于0.4g的板藍(lán)根藥材粉末，精密加入超純水25mL，振蕩搖勻使溶解。用針管和微孔濾膜將溶解過的板藍(lán)根溶液過濾并注入EP管中，貼上標(biāo)簽，即得供試品溶液。

3.3系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

分別取對(duì)照品及供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行色譜分析，記錄檢測(cè)所得到的色譜圖。結(jié)果顯示，在選定的色譜條件下，分離度為大于13，理論塔板數(shù)大于5000。見圖1～2。

3.4線性關(guān)系的考察及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密量?。≧-S）-告依春對(duì)照品儲(chǔ)備溶液（51.6ug/mL）1mL，分別稀釋成濃度為25.8斗咖L，12.9ug/mL，6.45ug/mL，3.225ug/mL，1.6125ug/mL的對(duì)照品溶液，按低濃度至高濃度依次各進(jìn)樣20uL，注入高效液相色譜儀中，測(cè)定各個(gè)對(duì)照品溶液的峰面積值，把各個(gè)對(duì)照品溶液濃度作為橫坐標(biāo)，把各個(gè)對(duì)照品溶液檢測(cè)到的峰面積值作為縱坐標(biāo)，以此繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。得出（R-S）-告依春的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=81943x-14683，R²=0.99954。結(jié)果表明（R-S）-告依春對(duì)照品溶液在濃度為1.625～51.6ug/mL的范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系。見表1、圖3。

3.5精密度實(shí)驗(yàn)

取同一濃度的（R-S）一告依春對(duì)照品溶液（濃度是51.6ug/mL），進(jìn)樣量為20uL，注入高效液相色譜儀中，連續(xù)進(jìn)樣6次，6次峰面積的RSD為1.20%。表明高效液相色譜儀的精密度良好。見表2。

3.6穩(wěn)定性試驗(yàn)

取正交實(shí)驗(yàn)的第7次實(shí)驗(yàn)（25倍水，提取1次，每次75rain）所得到的浸膏，這次實(shí)驗(yàn)的浸膏得率為31.14%。精密稱定，按“供試品溶液制定”項(xiàng)下的配制方法配制供試品溶液，放冰箱內(nèi)備用。分別于0，2，4，8，12，24h精密吸取供試品溶液20uL，注入高效液相色譜儀中。由于峰面積的RSD=1.26%，表明供試品溶液在24h內(nèi)保持穩(wěn)定。見表3。

3.7重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取正交實(shí)驗(yàn)的第9次試驗(yàn)（25倍水，提取3次，每次75min）所得到的浸膏，這次實(shí)驗(yàn)的浸膏得率為43.27%，精密量取浸膏0.17308g，一共稱取6份。將稱取得浸膏放入25mL容量瓶中，加超純水至容量瓶的刻度線。振蕩搖勻使溶解。將配制好的供試品溶液用針管通過微孔濾膜注入EP管中，既得所需的供試品溶液。將配制好的6份供試品溶液按順序注入高效液相色譜儀中，進(jìn)樣量為20uL。高效液相色譜儀所測(cè)得的參數(shù)如下表4所示。由于峰面積的RSD=2.49%，表明該實(shí)驗(yàn)方法的重復(fù)性好。見表4。

3.8加樣回收率實(shí)驗(yàn)

取已知同一供試品6份，配制成供試品溶液，經(jīng)高效液相及標(biāo)準(zhǔn)曲線算得其濃度為12.57ug/mL，取供試品溶液0.1mL，再取濃度為1.6125ug/mL的對(duì)照品溶液0.9mL，將兩者混勻，制成新的供試品溶液；取供試品溶液（濃度為12.57ug，mL）1mL，濃度為6.45ug/mL的對(duì)照品溶液2mL，將兩者混勻，制成另一種新的供試品溶液；再取供試品溶液（濃度為12.57u/mL）1mL，濃度為51.6ug/mL的對(duì)照品溶液0.25mL，將兩者混勻，制成第三種供試品溶液。依次注入高效液相色譜儀中，所得參數(shù)如下表5所示。根據(jù)公式：加樣回收率=實(shí)際測(cè)得的量（ug）一供試品中所含（R-S）-告依春的量（ug）/加入對(duì)照品的量（ug）×100%。見表5。

4.討論

本論文研究了用高效液相色譜法測(cè)定板藍(lán)根水提物中（R-S）-告依春的含量，該法重復(fù)性好，準(zhǔn)確度高。但是，做高效液相所使用的色譜條件不同也會(huì)影響高效液相的效率，檢測(cè)波長(zhǎng)依據(jù)《中國藥典》現(xiàn)行版一部板藍(lán)根項(xiàng)下的規(guī)定，測(cè)定波長(zhǎng)為245nm。在流動(dòng)相及流動(dòng)相的比例選擇上，經(jīng)查閱大量文獻(xiàn)資料了解到，以甲醇一水為流動(dòng)相時(shí)響應(yīng)值好，峰形良好，理論塔板數(shù)，分離度等符合要求。

在提取溶劑的選擇上，查閱大量文獻(xiàn)。由于（R-S）-告依春為水溶性成分，所以直接用水對(duì)樣品進(jìn)行稀釋處理，操作方便，經(jīng)濟(jì)節(jié)省，對(duì)環(huán)境無污染。

中國藥典中藥材品的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)一般都較成熟，本文的研究思路是參考藥典拓展開來，還存在不足之處，尚需進(jìn)一步深入研究。