傣藥望江南中的一個(gè)新的降倍半萜類化合物及其活性研究

秦瑞欣+左茜++黃蕭涵

[摘要]對(duì)傣藥望江南Cassia occidentalis的化學(xué)成分進(jìn)行研究，望江南細(xì)枝采用乙醇提取，然后用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取物用硅膠柱色譜及PRHPLC制備色譜技術(shù)進(jìn)行多次分離，得到1個(gè)降倍半萜3異丙基1，6二甲氧基5甲基萘7醇1和一個(gè)倍半萜 2，7二羥基4異丙基6甲基萘1甲醛2，其結(jié)構(gòu)通過(guò)譜學(xué)數(shù)據(jù)鑒定?；衔?為新化合物，化合物2也首次從望江南中分離得到。并用 MTT 法測(cè)定了化合物1對(duì) NB4，A549，SHSY5Y，PC3，MCF7 5 株人癌細(xì)胞株的細(xì)胞毒活性，其 IC50分別為（18±02）， （12±02）， （09±01）， （22±03）， （26±03） μmol·L-1。

[關(guān)鍵詞]望江南； 降倍半萜； 細(xì)胞毒活性

A new norsesquiterpene from Cassia occidentalis and its bioactivity

QIN Ruixin1，2， ZUO Qian1*， HUANG Xiaohan1， MA Hangying 2， YANG Yan2， XING Huanhuan2，

ZHOU Ling2， ZHOU Min2， HU Qiufen2

（1The High School Affiliated to Yunnan Normal University， Kunming 650106， China；

2 Key Laboratory of Chemistry in Ethnic Medicinal Resources， State Ethnic Affairs Commission & Ministry of Education， Yunnan Minzu University， Kunming 650106， China）

[Abstract]The phytochemistry investigation on the Cassia occidentalis， a Dai Medicine， was carried out The C occidentalis was extracted with ethanol and then partitioned with EtOAc The EtOAc soluble materials were subjected repeatedly to column chromatography on silica gel and preparative RPHPLC， leading to isolation of a norsesquiterpene， 3isopropyl1，6dimethoxy5methylnaphthalen7ol （1）， and a sesquiterpene， 2，7dihydroxy4isopropyl6methylnaphthalene1carbaldehyde （2） Their structures were determined by means of spectroscopic studies Compound 1 is a new compound Compound 2 is also isolated from C occidentalis for the first time In addition， the cytotoxicity of compound 1 for NB4， A549， SHSY5Y， PC3， and MCF7 cells line was assayed by using the MTT method， and it displayed potential cytotoxicity for the tested cancer cellline with IC50 valves of （18±02）， （12±02）， （09±01）， （22±03）， （26±03） μmol·L-1， respectively

[Key words]Cassia occidentalis； norsesquiterpenes； cytotoxic activity

doi：10.4268/cjcmm20162316

望江南Cassia occidentalis Linn為豆科決明屬植物，現(xiàn)廣布于全世界熱帶地區(qū)，在我國(guó)主要發(fā)布在東南部、南部及西南部各省區(qū)，是村邊荒地習(xí)見(jiàn)植物[1]。該植物為我國(guó)傣族民間常用的中草藥，常用作緩瀉劑；種子炒后治瘧疾，根有利尿功效，鮮葉搗碎治毒蛇毒蟲(chóng)咬傷；葉、根、種子中所含的揮發(fā)油，對(duì)多種細(xì)菌有抑制作用[2]。

目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)望江南進(jìn)行過(guò)一些研究，主要報(bào)道的化學(xué)成分有蒽醌、甾體、黃酮、萜類等類型的化合物[35]，這些化合物表現(xiàn)出抗菌、抗腫瘤、抗瘧疾、抗病毒等多種活性。為充分利用我國(guó)豐富的資源，進(jìn)一步尋找新的活性天然產(chǎn)物，本文對(duì)產(chǎn)于西雙版納的望江南細(xì)枝化學(xué)成分進(jìn)行了研究，并從中分離到1個(gè)降倍半萜類化合物1和1個(gè)倍半萜類化合物（2），其中化合物1為新化合物，并且該化合物具有顯著的細(xì)胞毒活性?；衔铮?）也首次從望江南中分離到。

1材料

UV2401A 紫外光譜儀 （日本島津公司）；BioRad FTS185 傅里葉變換紅外光譜儀 （美國(guó)伯樂(lè)BIORAD 公司）；DRX500 型核磁共振儀 （瑞士布魯克公司）；半制備 HPLC 分析儀器為安捷倫公司 1200 型高效液相色譜儀，色譜柱為安捷倫公司 Zorbax PrepHT GF （212 mm ×250 mm， 7 μm）。拌樣時(shí)使用 80～100 目硅膠，柱色譜時(shí)使用 200～300 目硅膠，薄層色譜用GF254 （100 mm×100 mm） 硅膠板，均為青島海洋化工廠生產(chǎn)；薄層色譜顯色劑為 5% H2SO4乙醇溶液；工業(yè)用氯仿、丙酮、甲醇、乙酸乙酯、乙醇；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

望江南于 2014年8 月購(gòu)自云南西雙版納傣醫(yī)院，產(chǎn)地為云南西雙版納洲勐臘縣，經(jīng)西雙版納傣醫(yī)院林艷芳主任醫(yī)師和云南民族大學(xué)民族藥資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室楊青松教授鑒定為豆科決明屬植物望江南；植物標(biāo)本（編號(hào)YMU20140822）保存于云南民族大學(xué)民族藥資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本館。

2提取分離

取望江南的細(xì)枝 28 kg曬干，粉碎到 30 目，然后用 95% 的乙醇水超聲提取4 次 （每次 30 min，乙醇用量50 L）；提取完后合并提取液并加入500 mL的水，減壓蒸去乙醇；殘余液用乙酸乙酯萃取3次（每次用乙酸乙酯500 mL），合并乙酸乙酯相減壓濃縮得浸膏638 g。浸膏用 60 g （80～100 目） 粗硅膠拌樣，然后用 420 g硅膠 （200～300目） 柱色譜分離，以氯仿丙酮（9∶1， 8∶2， 7∶3， 6∶4， 5∶5， 1∶2） 梯度洗脫，分成 6 個(gè)部分。選取 8∶2 洗脫部分進(jìn)行 HPLC進(jìn)一步分離：用 Zorbax PrepHT GF （212 mm×250 mm） 反相柱，52% 甲醇為流動(dòng)相，流速為 20 mL·min-1，收集 286 min 的色譜峰可得化合物1（118 mg）。選取 7∶3 洗脫部分用Zorbax PrepHT GF （212 mm × 250 mm） 反相柱，以40% 甲醇為流動(dòng)相，流速為 20 mL·min-1，收集 224 min 的色譜峰可得化合物2（154 mg），見(jiàn)圖1。

3結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1為淺黃色膠狀物；高分辨質(zhì)譜 （HRESIMS） 給出準(zhǔn)分子離子峰m/z 283130 5 [M+Na]+ （計(jì)算值283131 0），結(jié)合1H和13 CNMR譜， 推測(cè)分子式為C16H20O3，不飽和度為7。紅外光譜數(shù)據(jù)證實(shí)化合物中存在羥基（3 428 cm-1）和芳環(huán)（1 610，1 548，1 469 cm-1）功能團(tuán)，紫外光譜在312，256 nm處有強(qiáng)吸收也證實(shí)化合物中存在芳環(huán)結(jié)構(gòu)。從1H和13CNMR譜（數(shù)據(jù)歸屬見(jiàn)表1）信號(hào)可以看出化合物中有10個(gè)雙鍵碳[C1～10，包括3個(gè)次甲基雙鍵碳（C2，C4和C8）]、1個(gè)異丙基（C11～13；H11～13）、1個(gè)甲基（C14，H14）、2個(gè)甲氧基（δC 561 q，614 q；δH 382 s，390 s），以及1個(gè)酚羥基（δH 1062）。由于化合物的不飽和度為7（除去10個(gè)雙鍵碳的不飽和度5），化合物中還應(yīng)有2個(gè)環(huán)；考慮到其他確定的取代基（異丙基、1個(gè)甲基、甲氧基和酚羥基）均沒(méi)有成環(huán)的可能，可初步推測(cè)10個(gè)雙鍵碳形成了1個(gè)萘環(huán)。根據(jù)H8 （δH 705）和C1 （δC 1551）、C6 （δC 1517）、C7 （δC 1482）、C9 （δC 1217）、C10 （δC 1301），H4 （δH 688）和C2 （δC 1063）、C3 （δC 1337）、C5 （δC 1229）、C9 （δC 1217）、C10 （δC 1301），以及H2 （δH 641）和C1 （δC 1551）、C3 （δC 1337）、C4 （δC 1136）、C9 （δC 1217）的HMBC相關(guān)見(jiàn)圖 2，可進(jìn)一步確定化合物中存在萘環(huán)結(jié)構(gòu)。并且通過(guò)上述核磁共振信號(hào)和文獻(xiàn)[6]對(duì)比，可證實(shí)化合物1為芳構(gòu)化桉葉烷類型降倍半萜?；衔锏哪负说玫酱_認(rèn)后，剩余的甲基、異丙基、甲氧基和酚羥基為母核上的取代基。根據(jù)H11 （δH 331） 和C2 （δC 1063）、C3 （δC 1337）、C4 （δC 1136），H12，13 （δH 139）和C3 （δC 1337），以及H2 （δH 641）、H4 （δH 688）和C11 （δC 335）的HMBC相關(guān)可證實(shí)異丙基取代在萘環(huán)的C3位；根據(jù)H314 （δH 240）和C5 （δC 1229）、C6 （δC 1517）、C10 （δC 1301）的HMBC相關(guān)，可證實(shí)該甲基取代在母核的C5位；根據(jù)2個(gè)甲氧基氫（δH 382 s，390 s）分別和C1 （δC 1551）和C6 （δC 1517）有HMBC相關(guān)，可證實(shí)2個(gè)甲氧基分別取代在母核的C1和C6位；根據(jù)酚羥基氫（δH 1062）和C6 （δC 1517）、C7 （δC 1482）、C8 （δC 1033） 的HMBC相關(guān)，可證實(shí)酚羥基取代在母核的C7位；而且萘環(huán)上典型的氫譜信號(hào)[ 705 s，688 （d， J=22 Hz），641 （d， J=22 Hz） ]也支持由HMBC相關(guān)證實(shí)的取代基位置。至此本化合物的結(jié)構(gòu)得以確定，并命名為3異丙基1，6二甲氧基5甲基萘7醇?；衔铮?）為已知化合物，通過(guò)其核磁共振數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)[6]對(duì)比被鑒定為2，7二羥基4異丙基6甲基萘1甲醛。

4波譜數(shù)據(jù)

化合物1淺黃色膠狀物， 分子式為C16H20O3； ESIMS （正離子模式） m/z 283 [M+Na]+； HRESIMS m/z 283130 5 [M+Na]+ （計(jì)算值為283131 0），推測(cè)分子式為C16H20O3Na。UV （MeOH）λmax （log ε） 312 （362）， 256 （340）， 215 （418） nm； IR （KBr） λmax 3 428， 3 050， 2 942， 1 610， 1 548， 1 469， 1 353， 1 254， 1 207， 1 131，

5化合物的細(xì)胞毒活性

對(duì)化合物1進(jìn)行了細(xì)胞毒活性篩選。細(xì)胞毒活性檢測(cè)參照文獻(xiàn)[9]采用改良的 MTT 測(cè)定法，以紫杉醇為陽(yáng)性對(duì)照藥，采用了 5 種人源癌細(xì)胞株：急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞（NB4）、人肺腺癌細(xì)胞（A549）、人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（SHSY5Y）、人前列腺癌細(xì)胞（PC3）和人乳腺癌細(xì)胞（MCF7），所有腫瘤細(xì)胞均購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入 100 μL，鋪板使待測(cè)細(xì)胞密度調(diào)為 1萬(wàn)/孔。在 5% CO2，37 ℃ 的條件下孵育至細(xì)胞貼壁，加入濃度梯度的藥物（設(shè)0，02，1，25，5，10 μmol·L-1 6個(gè)濃度梯度，每孔 100 μL），繼續(xù)在 5% CO2，37 ℃條件下孵育 24～72 h，倒置顯微鏡下觀察。再往每孔加入 20 μL MTT 溶液（5 g·L-1，即 05% MTT），繼續(xù)培養(yǎng) 4 h 后終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，接著每孔加入 150 μL 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩 10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè) A490 nm處測(cè)量各孔的吸光值。計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率。同時(shí)設(shè)置空白組（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對(duì)照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜）。通過(guò)測(cè)定藥物在不同濃度下對(duì)細(xì)胞的抑制率；抑制率=（A空白-A加藥孔）/空白對(duì)照A×100%；并采用改良寇式法計(jì)算IC50。每個(gè)化合物平行測(cè)定3次，結(jié)果取平均值，測(cè)定結(jié)果為：紫杉醇的 IC50分別為003， 002， 005， 005， 003 μmol·L-1，化合物 1 的 IC50分別為（18±02）， （12±02）， （09±01）， （22±03）， （26±03） μmol·L-1，結(jié)果表明化合物 1 對(duì)所測(cè)試的人源腫瘤細(xì)胞增殖具有細(xì)胞毒活性。

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[責(zé)任編輯丁廣治]