稀土元素鑭對(duì)丹參活性物質(zhì)積累及其合成途徑中酶基因表達(dá)的影響?yīng)お?/h1>
2017-04-07 23:11:44邊麗華鄒琳周冰謙劉偉周潔
中國中藥雜志 2016年23期 關(guān)鍵詞：丹參
邊麗華+++鄒琳++周冰謙 劉偉 周潔
[摘要]該文研究了鑭對(duì)丹參毛狀根中活性物質(zhì)積累及其合成途徑中酶基因表達(dá)的影響，為揭示土壤因子鑭影響丹參藥材品質(zhì)形成的環(huán)境機(jī)制奠定基礎(chǔ)。采用HPLC測定丹參毛狀根中活性物質(zhì)含量；采用Tiangen多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取RNA，采用Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，采用PCR熒光定量試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)定量分析，采用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果顯示鑭處理對(duì)丹參毛狀根內(nèi)丹參酮類和酚酸類的積累表現(xiàn)出顯著的促進(jìn)效應(yīng)，處理后9 d其酚酸類成分含量達(dá)到峰值，丹參酮類成分含量隨處理時(shí)間的延長而增加（15 d內(nèi)）；鑭處理后丹參體內(nèi)活性物質(zhì)積累的峰值時(shí)間相對(duì)滯后于酶基因表達(dá)的峰值時(shí)期，F(xiàn)PPS，TAT，HPPR 3個(gè)酶基因與丹參酮ⅡA、迷迭香酸和丹酚酸B含量變化趨勢相似，暗示FPPS，TAT，HPPR 3個(gè)酶基因在鑭誘導(dǎo)的丹參活性物質(zhì)積累中發(fā)揮重要作用。
[關(guān)鍵詞]丹參； 毛狀根； 活性物質(zhì)； 關(guān)鍵酶基因
Effect of Lanthanum on accumulation of active constituent and key enzymes expression of Salvia miltiorrhiza hairy root
BIAN Lihua1，3， ZOU Lin1， ZHOU Bingqian1， LIU Wei1， ZHOU Jie1，2*， WANG Xiao1
（1Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Quality Control Technology， Shandong Analysis and
Test Center， Ji′nan 250014， China；
2 School of Biological Science and Technology，University of Ji′nan， Ji′nan 250012， China；
3 Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Ji′nan 250355， China）
[Abstract]The effect of Lanthanum on the accumulation of active constituent and key enzymes expression of Salvia miltiorrhiza hairy root were studied and furthermore signaling molecules mediating the synthesis of secondary metabolism was also defined in order to provide references for the reveal of synthesis mechanism of active constituent of S miltiorrhiza hairy root inducing by Lanthanum The content of active constituents were detected by HPLC RNA was extracted with RNA prep Pure RNA purification kit （Tiangen） The results shows that LaCl3 processing promoted the accumulation of tanshinones and phenolic acids in S miltiorrhiza hairy root The accumulation of phenolic acids reached the highest at 9 d after treatment， and tanshinones accumulation continued to increase in 15 days Accumulation of active substance in S miltiorrhiza may relate with FPPS， TAT， HPPR several key enzyme activation
[Key words]Salvia miltiorrhiza； hairy root； active substance； key enzymes
doi：10.4268/cjcmm20162309
道地藥材是人們傳統(tǒng)公認(rèn)且來源于特定產(chǎn)地的名優(yōu)正品藥材，是中藥材的精髓所在，也是歷代醫(yī)家防病治病最有力的武器之一[1]。丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge的干燥根和根莖，具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰等功效[2]，屬于我國常用大宗藥材，是臨床上治療心腦血管疾病的要藥之一[3]。道地藥材品質(zhì)的形成與生態(tài)環(huán)境關(guān)系密切[4]，而關(guān)于丹參道地藥材品質(zhì)形成的環(huán)境因子及其作用機(jī)制尚未深入研究。
土壤因子是重要的生態(tài)因子，也是影響藥材產(chǎn)量和品質(zhì)形成的重要因素[5]。稀土是由原子序數(shù)為57～71的鑭系元素以及與之性質(zhì)極為相似的鈧、釔共17種元素組成。鑭（La）是一種典型的稀土，地殼中鑭約為0001 83%，稀土能夠影響藥材中活性物質(zhì)的積累[6]。據(jù)報(bào)道山東丹參道地產(chǎn)區(qū)土壤中La達(dá)到27 mg·kg-1[7]，丹參中La超過843 mg·kg-1，遠(yuǎn)高于水稻、玉米、大麥等作物[8]，推測土壤中的鑭元素是影響山東丹參道地藥材品質(zhì)形成的重要生態(tài)因子。預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)La處理后丹參中活性物質(zhì)的含量發(fā)生顯著變化，而La影響丹參中活性物質(zhì)積累的機(jī)制尚未深入探討。本文擬以丹參毛狀根為試材，研究La處理對(duì)丹參毛狀根中活性物質(zhì)積累及其生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因表達(dá)的影響，探討丹參中活性成分及其關(guān)鍵酶基因?qū)﹁|的響應(yīng)特點(diǎn)，為揭示丹參道地藥材形成的環(huán)境機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
1材料
采用發(fā)根農(nóng)桿菌菌株Agrobacterium rhizogenes 15834處理丹參葉片獲得丹參毛狀根，將經(jīng)PCR鑒定的陽性株系置于67 V液體培養(yǎng)基[9]中培養(yǎng)。精確稱取05 g毛狀根接種于50 mL培養(yǎng)基，25 ℃，110～120 r·min-1搖床上避光培養(yǎng)。
2方法
21實(shí)驗(yàn)處理
毛狀根繼代培養(yǎng)18 d后，在無菌條件下添加LaCl3使其終濃度達(dá)到001 mmol·L-1（濃度由預(yù)實(shí)驗(yàn)得到），對(duì)照加等量滅菌水，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)，分別于處理后1，3，5，9，15 d取樣，取樣時(shí)將毛狀根取出后迅速吸干水分，每一取樣點(diǎn)取得的樣品分為2份，一份樣品用液氮迅速冷凍，置-70 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?，用于基因表達(dá)分析；另一份迅速超低溫冷凍干燥，用于丹參活性物質(zhì)含量測定。
22毛狀根中活性物質(zhì)含量測定
將干燥后的丹參毛狀根研磨過篩，70%乙醇提取，HPLC同時(shí)測定迷迭香酸、丹酚酸B、二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA含量[1013]，以乙腈（A）和水（02%乙酸）為流動(dòng)相，乙腈5%為初始濃度，0～25 min，5%～35% A，25～26 min，35%～100% A。酚酸類成分檢測波長為270 nm，丹參酮類成分檢測波長為280 nm；柱溫25 ℃。
23毛狀根中活性物質(zhì)生物合成中關(guān)鍵酶基因表達(dá)分析
231毛狀根總RNA提取采用天根多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（Tiangen RNA prep Pure 多糖多酚植物總RNA提取試劑盒）提取。采用瓊脂糖凝膠電泳法檢測RNA純度和完整性；使用核酸蛋白分析儀（TY10 Biospecnano ZX21）檢測RNA濃度。
232實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列見表1。采用TaKaRa試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，采用瓊脂糖凝膠法檢測cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行 PCR檢測。利用Pfaffi法計(jì)算目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率。計(jì)算公式為基因表達(dá)量=C（A-E）/D（F-B），C，D分別是目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率；A和E分別是對(duì)照樣品和待測樣品中目的基因的Ct；F，B分別是對(duì)照樣品和待測樣品中內(nèi)參基因的Ct。
24數(shù)據(jù)分析
用Excel軟件處理數(shù)據(jù)，用SPSS 130軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
3結(jié)果與分析
31RNA提取與檢測結(jié)果
瓊脂糖凝膠電泳顯示RNA無蛋白質(zhì)污染，RNA完整無降解，符合反轉(zhuǎn)錄成cDNA要求。核酸蛋白分析儀檢測結(jié)果顯示A260/230，A260/280讀數(shù)均在18～21，RNA質(zhì)量濃度均在200 mg·L-1以上，符合反轉(zhuǎn)錄成cDNA要求。cDNA瓊脂糖凝膠電泳條帶清晰且為單一條帶說明PCR產(chǎn)物特異性好，無明顯引物二聚體，符合Real time實(shí)驗(yàn)要求。引物的特異性良好，各引物擴(kuò)增效率均在適宜范圍之內(nèi)，符合Real time PCR實(shí)驗(yàn)要求。
32LaCl3處理對(duì)丹參毛狀根中活性物質(zhì)積累的影響
321LaCl3處理對(duì)丹參毛狀根中丹參酮類成分積累的影響LaCl3處理后1 d二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA含量均顯著高于對(duì)照（P<005），處理后3 d其含量略有下降，處理后5～15 d其含量逐漸升高，均顯著高于對(duì)照（P<005），如二氫丹參酮含量5～15 d分別高出對(duì)照6623%（5 d，P<005），5345%（9 d，P<005），2618%（15 d，P<005）。二氫丹參酮、隱丹參酮和丹參酮Ⅰ的含量應(yīng)對(duì)鑭的響應(yīng)表現(xiàn)出較相似的變化趨勢。與對(duì)照相比LaCl3處理后丹參酮類成分變化趨勢總體表現(xiàn)為“升降升”的趨勢，見圖1。
322LaCl3處理對(duì)丹參毛狀根中酚酸類成分的影響LaCl3處理對(duì)迷迭香酸和丹酚酸B成分的積累表現(xiàn)出促進(jìn)效應(yīng)。LaCl3處理后5 d迷迭香酸迅速積累，其含量顯著高出對(duì)照2859%（P<001）；處理后9 d其含量達(dá)到峰值，顯著高出對(duì)照5626%（P<001）。和迷迭香酸的變化趨勢相似，LaCl3處理后5 d丹酚酸B含量迅速上升，顯著高出對(duì)照3567%（P<001），處理后9 d達(dá)到峰值，見圖2。
33LaCl3處理對(duì)丹參毛狀根中關(guān)鍵酶基因表達(dá)的影響
331LaCl3處理對(duì)丹參酮類成分生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因表達(dá)的影響LaCl3處理對(duì)AACT和FPPS表達(dá)量的影響較為相似，處理后1 d其表達(dá)量迅速上升，分別高于對(duì)照4963%（P<005），27364%（P<005）；處理后9 d表達(dá)量均低于對(duì)照；處理后15 d其表達(dá)量分別高出對(duì)照19094%（P<005），5058%（P<005）。LaCl3處理對(duì)GPPS的表達(dá)表現(xiàn)出促進(jìn)抑制促進(jìn)抑制的波浪狀趨勢，其中處理后1，5 d為2個(gè)GPPS表達(dá)量的高峰，分別高出對(duì)照24910%（P<005），11366%（P<005）。LaCl3處理對(duì)丹參酮類成分生物合成途徑中AACT，F(xiàn)PPS，GPPS 3個(gè)關(guān)鍵酶基因的表達(dá)均表現(xiàn)出促進(jìn)和抑制相互交替的波浪線趨勢，見圖3。
332LaCl3處理對(duì)酚酸類成分生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因表達(dá)的影響LaCl3處理對(duì)丹參毛狀根酚酸類成分生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因表達(dá)的影響見圖4。LaCl3處理1 d對(duì)PAL表達(dá)量未表現(xiàn)出顯著影響，處理后3，5 d PAL表達(dá)略低于對(duì)照組，處理后9 d PAL表達(dá)量顯著高出對(duì)照17875%（P<005）；LaCl3處理后1 d C4H表達(dá)量迅速增加，顯著高出對(duì)照9407%（P<005）。LaCl3處理對(duì)4CL的表達(dá)總體表現(xiàn)為促進(jìn)效應(yīng)；處理后1 d HPPR基因表達(dá)量高出對(duì)照組39199%（P<005），3 d仍顯著高于對(duì)照，處理后5 d和9 d HPPR表達(dá)量略低對(duì)于對(duì)照，15 d又出現(xiàn)回升，高出對(duì)照6091%（P<005）。LaCl3處理對(duì)酚酸類成分生物合成過程中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)表現(xiàn)出促進(jìn)和抑制相互交替的波浪線趨勢。
34相關(guān)性分析
341丹參酮類成分含量及其合成途徑中的關(guān)鍵酶基因表達(dá)量的相關(guān)性分析丹參酮類成分含量及其合成途徑中的關(guān)鍵酶基因表達(dá)量的相關(guān)性分析見表2。AACT，F(xiàn)PPS呈現(xiàn)顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0685（P<005）。FPPS表達(dá)量與二氫丹參酮和隱丹參酮含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0716（P<005），0750（P<005）。LaCl3處理后，丹參酮ⅡA與隱丹參酮含量之間尚未表現(xiàn)出顯著相關(guān)性，其余活性成分之間均表現(xiàn)出極顯著相關(guān)性（P<005）。
342酚酸類成分與關(guān)鍵酶基因相關(guān)性分析酚酸類成分和關(guān)鍵酶基因相關(guān)性分析結(jié)果見表3。相關(guān)性分析結(jié)果顯示迷迭香酸和丹酚酸B之間有極顯著相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為0966（P<001）。
4討論
本文通過研究LaCl3處理后不同時(shí)間段丹參酮類和酚酸類積累及其相應(yīng)的關(guān)鍵酶基因表達(dá)量的動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)鑭處理對(duì)丹參中丹參酮和酚酸類成分的積累整體表現(xiàn)出促進(jìn)的效應(yīng)，其中丹參酮類成分含量隨處理時(shí)間的延長而增加（15 d內(nèi)），酚酸類成分含量在處理后9 d達(dá)到峰值后又回落。
鑭處理后丹參體內(nèi)活性物質(zhì)生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量表現(xiàn)出明顯的變化。FPPS，TAT，HPPR 3個(gè)關(guān)鍵酶基因均呈促進(jìn)抑制相互交替的波浪狀變化，該趨勢與丹參酮ⅡA、迷迭香酸和丹酚酸B含量變化趨勢相似，且活性物質(zhì)積累的峰值時(shí)間相對(duì)滯后于關(guān)鍵酶基因表達(dá)的峰值時(shí)期，暗示FPPS，TAT，HPPR關(guān)鍵酶基因在鑭處理誘導(dǎo)丹參中活性物質(zhì)丹參酮ⅡA、迷迭香酸和丹酚酸B成分積累中發(fā)揮重要作用。據(jù)報(bào)道FPPS是丹參酮類成分代謝途徑中的下游基因，其對(duì)丹參酮類成分合成影響作用較大。TAT是酪氨酸代謝途徑的起始酶，也被公認(rèn)為是該途徑的限速酶[14]。HPPR為酪氨酸代謝途徑中第一個(gè)使代謝流特異流向迷迭香酸的關(guān)鍵酶[15]。3個(gè)酶基因均為代謝途徑中與次生代謝產(chǎn)物合成密切相關(guān)的關(guān)鍵酶基因，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合。相關(guān)性結(jié)果表明FPPS與二氫丹參酮和隱丹參酮均有顯著正相關(guān)，且鑭處理后1 d FPPS表達(dá)量即迅速上升，推測FPPS在鑭響應(yīng)機(jī)制中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。除了稀土元素外，土壤中影響藥用植物次生代謝產(chǎn)物積累的因子很多，從分子水平上探討其作用機(jī)制是揭示道地藥材品質(zhì)形成的環(huán)境機(jī)制的重要方面。
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[責(zé)任編輯呂冬梅]
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doi：10.4268/cjcmm20162309
道地藥材是人們傳統(tǒng)公認(rèn)且來源于特定產(chǎn)地的名優(yōu)正品藥材，是中藥材的精髓所在，也是歷代醫(yī)家防病治病最有力的武器之一[1]。丹參為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge的干燥根和根莖，具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰等功效[2]，屬于我國常用大宗藥材，是臨床上治療心腦血管疾病的要藥之一[3]。道地藥材品質(zhì)的形成與生態(tài)環(huán)境關(guān)系密切[4]，而關(guān)于丹參道地藥材品質(zhì)形成的環(huán)境因子及其作用機(jī)制尚未深入研究。
土壤因子是重要的生態(tài)因子，也是影響藥材產(chǎn)量和品質(zhì)形成的重要因素[5]。稀土是由原子序數(shù)為57～71的鑭系元素以及與之性質(zhì)極為相似的鈧、釔共17種元素組成。鑭（La）是一種典型的稀土，地殼中鑭約為0001 83%，稀土能夠影響藥材中活性物質(zhì)的積累[6]。據(jù)報(bào)道山東丹參道地產(chǎn)區(qū)土壤中La達(dá)到27 mg·kg-1[7]，丹參中La超過843 mg·kg-1，遠(yuǎn)高于水稻、玉米、大麥等作物[8]，推測土壤中的鑭元素是影響山東丹參道地藥材品質(zhì)形成的重要生態(tài)因子。預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)La處理后丹參中活性物質(zhì)的含量發(fā)生顯著變化，而La影響丹參中活性物質(zhì)積累的機(jī)制尚未深入探討。本文擬以丹參毛狀根為試材，研究La處理對(duì)丹參毛狀根中活性物質(zhì)積累及其生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因表達(dá)的影響，探討丹參中活性成分及其關(guān)鍵酶基因?qū)﹁|的響應(yīng)特點(diǎn)，為揭示丹參道地藥材形成的環(huán)境機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
1材料
采用發(fā)根農(nóng)桿菌菌株Agrobacterium rhizogenes 15834處理丹參葉片獲得丹參毛狀根，將經(jīng)PCR鑒定的陽性株系置于67 V液體培養(yǎng)基[9]中培養(yǎng)。精確稱取05 g毛狀根接種于50 mL培養(yǎng)基，25 ℃，110～120 r·min-1搖床上避光培養(yǎng)。
2方法
21實(shí)驗(yàn)處理
毛狀根繼代培養(yǎng)18 d后，在無菌條件下添加LaCl3使其終濃度達(dá)到001 mmol·L-1（濃度由預(yù)實(shí)驗(yàn)得到），對(duì)照加等量滅菌水，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)，分別于處理后1，3，5，9，15 d取樣，取樣時(shí)將毛狀根取出后迅速吸干水分，每一取樣點(diǎn)取得的樣品分為2份，一份樣品用液氮迅速冷凍，置-70 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?，用于基因表達(dá)分析；另一份迅速超低溫冷凍干燥，用于丹參活性物質(zhì)含量測定。
22毛狀根中活性物質(zhì)含量測定
將干燥后的丹參毛狀根研磨過篩，70%乙醇提取，HPLC同時(shí)測定迷迭香酸、丹酚酸B、二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA含量[1013]，以乙腈（A）和水（02%乙酸）為流動(dòng)相，乙腈5%為初始濃度，0～25 min，5%～35% A，25～26 min，35%～100% A。酚酸類成分檢測波長為270 nm，丹參酮類成分檢測波長為280 nm；柱溫25 ℃。
23毛狀根中活性物質(zhì)生物合成中關(guān)鍵酶基因表達(dá)分析
231毛狀根總RNA提取采用天根多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（Tiangen RNA prep Pure 多糖多酚植物總RNA提取試劑盒）提取。采用瓊脂糖凝膠電泳法檢測RNA純度和完整性；使用核酸蛋白分析儀（TY10 Biospecnano ZX21）檢測RNA濃度。
232實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列見表1。采用TaKaRa試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，采用瓊脂糖凝膠法檢測cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行 PCR檢測。利用Pfaffi法計(jì)算目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率。計(jì)算公式為基因表達(dá)量=C（A-E）/D（F-B），C，D分別是目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率；A和E分別是對(duì)照樣品和待測樣品中目的基因的Ct；F，B分別是對(duì)照樣品和待測樣品中內(nèi)參基因的Ct。
24數(shù)據(jù)分析
用Excel軟件處理數(shù)據(jù)，用SPSS 130軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
3結(jié)果與分析
31RNA提取與檢測結(jié)果
瓊脂糖凝膠電泳顯示RNA無蛋白質(zhì)污染，RNA完整無降解，符合反轉(zhuǎn)錄成cDNA要求。核酸蛋白分析儀檢測結(jié)果顯示A260/230，A260/280讀數(shù)均在18～21，RNA質(zhì)量濃度均在200 mg·L-1以上，符合反轉(zhuǎn)錄成cDNA要求。cDNA瓊脂糖凝膠電泳條帶清晰且為單一條帶說明PCR產(chǎn)物特異性好，無明顯引物二聚體，符合Real time實(shí)驗(yàn)要求。引物的特異性良好，各引物擴(kuò)增效率均在適宜范圍之內(nèi)，符合Real time PCR實(shí)驗(yàn)要求。
32LaCl3處理對(duì)丹參毛狀根中活性物質(zhì)積累的影響
321LaCl3處理對(duì)丹參毛狀根中丹參酮類成分積累的影響LaCl3處理后1 d二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA含量均顯著高于對(duì)照（P<005），處理后3 d其含量略有下降，處理后5～15 d其含量逐漸升高，均顯著高于對(duì)照（P<005），如二氫丹參酮含量5～15 d分別高出對(duì)照6623%（5 d，P<005），5345%（9 d，P<005），2618%（15 d，P<005）。二氫丹參酮、隱丹參酮和丹參酮Ⅰ的含量應(yīng)對(duì)鑭的響應(yīng)表現(xiàn)出較相似的變化趨勢。與對(duì)照相比LaCl3處理后丹參酮類成分變化趨勢總體表現(xiàn)為“升降升”的趨勢，見圖1。
322LaCl3處理對(duì)丹參毛狀根中酚酸類成分的影響LaCl3處理對(duì)迷迭香酸和丹酚酸B成分的積累表現(xiàn)出促進(jìn)效應(yīng)。LaCl3處理后5 d迷迭香酸迅速積累，其含量顯著高出對(duì)照2859%（P<001）；處理后9 d其含量達(dá)到峰值，顯著高出對(duì)照5626%（P<001）。和迷迭香酸的變化趨勢相似，LaCl3處理后5 d丹酚酸B含量迅速上升，顯著高出對(duì)照3567%（P<001），處理后9 d達(dá)到峰值，見圖2。
33LaCl3處理對(duì)丹參毛狀根中關(guān)鍵酶基因表達(dá)的影響
331LaCl3處理對(duì)丹參酮類成分生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因表達(dá)的影響LaCl3處理對(duì)AACT和FPPS表達(dá)量的影響較為相似，處理后1 d其表達(dá)量迅速上升，分別高于對(duì)照4963%（P<005），27364%（P<005）；處理后9 d表達(dá)量均低于對(duì)照；處理后15 d其表達(dá)量分別高出對(duì)照19094%（P<005），5058%（P<005）。LaCl3處理對(duì)GPPS的表達(dá)表現(xiàn)出促進(jìn)抑制促進(jìn)抑制的波浪狀趨勢，其中處理后1，5 d為2個(gè)GPPS表達(dá)量的高峰，分別高出對(duì)照24910%（P<005），11366%（P<005）。LaCl3處理對(duì)丹參酮類成分生物合成途徑中AACT，F(xiàn)PPS，GPPS 3個(gè)關(guān)鍵酶基因的表達(dá)均表現(xiàn)出促進(jìn)和抑制相互交替的波浪線趨勢，見圖3。
332LaCl3處理對(duì)酚酸類成分生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因表達(dá)的影響LaCl3處理對(duì)丹參毛狀根酚酸類成分生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因表達(dá)的影響見圖4。LaCl3處理1 d對(duì)PAL表達(dá)量未表現(xiàn)出顯著影響，處理后3，5 d PAL表達(dá)略低于對(duì)照組，處理后9 d PAL表達(dá)量顯著高出對(duì)照17875%（P<005）；LaCl3處理后1 d C4H表達(dá)量迅速增加，顯著高出對(duì)照9407%（P<005）。LaCl3處理對(duì)4CL的表達(dá)總體表現(xiàn)為促進(jìn)效應(yīng)；處理后1 d HPPR基因表達(dá)量高出對(duì)照組39199%（P<005），3 d仍顯著高于對(duì)照，處理后5 d和9 d HPPR表達(dá)量略低對(duì)于對(duì)照，15 d又出現(xiàn)回升，高出對(duì)照6091%（P<005）。LaCl3處理對(duì)酚酸類成分生物合成過程中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)表現(xiàn)出促進(jìn)和抑制相互交替的波浪線趨勢。
34相關(guān)性分析
341丹參酮類成分含量及其合成途徑中的關(guān)鍵酶基因表達(dá)量的相關(guān)性分析丹參酮類成分含量及其合成途徑中的關(guān)鍵酶基因表達(dá)量的相關(guān)性分析見表2。AACT，F(xiàn)PPS呈現(xiàn)顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0685（P<005）。FPPS表達(dá)量與二氫丹參酮和隱丹參酮含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0716（P<005），0750（P<005）。LaCl3處理后，丹參酮ⅡA與隱丹參酮含量之間尚未表現(xiàn)出顯著相關(guān)性，其余活性成分之間均表現(xiàn)出極顯著相關(guān)性（P<005）。
342酚酸類成分與關(guān)鍵酶基因相關(guān)性分析酚酸類成分和關(guān)鍵酶基因相關(guān)性分析結(jié)果見表3。相關(guān)性分析結(jié)果顯示迷迭香酸和丹酚酸B之間有極顯著相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為0966（P<001）。
4討論
本文通過研究LaCl3處理后不同時(shí)間段丹參酮類和酚酸類積累及其相應(yīng)的關(guān)鍵酶基因表達(dá)量的動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)鑭處理對(duì)丹參中丹參酮和酚酸類成分的積累整體表現(xiàn)出促進(jìn)的效應(yīng)，其中丹參酮類成分含量隨處理時(shí)間的延長而增加（15 d內(nèi)），酚酸類成分含量在處理后9 d達(dá)到峰值后又回落。
鑭處理后丹參體內(nèi)活性物質(zhì)生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量表現(xiàn)出明顯的變化。FPPS，TAT，HPPR 3個(gè)關(guān)鍵酶基因均呈促進(jìn)抑制相互交替的波浪狀變化，該趨勢與丹參酮ⅡA、迷迭香酸和丹酚酸B含量變化趨勢相似，且活性物質(zhì)積累的峰值時(shí)間相對(duì)滯后于關(guān)鍵酶基因表達(dá)的峰值時(shí)期，暗示FPPS，TAT，HPPR關(guān)鍵酶基因在鑭處理誘導(dǎo)丹參中活性物質(zhì)丹參酮ⅡA、迷迭香酸和丹酚酸B成分積累中發(fā)揮重要作用。據(jù)報(bào)道FPPS是丹參酮類成分代謝途徑中的下游基因，其對(duì)丹參酮類成分合成影響作用較大。TAT是酪氨酸代謝途徑的起始酶，也被公認(rèn)為是該途徑的限速酶[14]。HPPR為酪氨酸代謝途徑中第一個(gè)使代謝流特異流向迷迭香酸的關(guān)鍵酶[15]。3個(gè)酶基因均為代謝途徑中與次生代謝產(chǎn)物合成密切相關(guān)的關(guān)鍵酶基因，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合。相關(guān)性結(jié)果表明FPPS與二氫丹參酮和隱丹參酮均有顯著正相關(guān)，且鑭處理后1 d FPPS表達(dá)量即迅速上升，推測FPPS在鑭響應(yīng)機(jī)制中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。除了稀土元素外，土壤中影響藥用植物次生代謝產(chǎn)物積累的因子很多，從分子水平上探討其作用機(jī)制是揭示道地藥材品質(zhì)形成的環(huán)境機(jī)制的重要方面。
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[責(zé)任編輯呂冬梅]
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