麻黃—杏仁藥對配比與有效成分含量變化規(guī)律研究

楊麗+李瑩+王清嫻+孫勇兵+劉灣+李文宏

[摘要]目的 探討不同配比麻黃-杏仁藥對中麻黃堿、偽麻黃堿與苦杏仁苷多組分含量的變化規(guī)律。方法 選用U6（64）均勻設計表安排配比，采用高效液相色譜法測定麻黃-杏仁藥對不同配伍比例中麻黃堿、偽麻黃堿與苦杏仁苷的含量。結果 經(jīng)方法學考察，麻黃堿回歸方程為y=212.36x+0.6658，R2=0.9995；偽麻黃堿回歸方程為y=184.95x+0.7268，R2=0.9990；苦杏仁苷回歸方程為y=153.5x+2.4961，R2=0.9990；麻黃與杏仁配伍后，隨著配伍比例的變化，麻黃堿、偽麻黃堿的含量與麻黃用量、苦杏仁苷與杏仁用量之間均呈現(xiàn)良好的線性關系。結論 該方法簡便、準確、重現(xiàn)性好；麻黃-杏仁藥對中有效成分的含量與用藥量成正相關，而與配伍比例無明顯的相關性。

[關鍵詞]麻黃-杏仁藥對；麻黃堿；偽麻黃堿；苦杏仁苷

[中圖分類號] R285.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）02（b）-0004-05

[Abstract]Objective To discuss the change rule between the different compatibility of ephedra-almond drugs and the multicomponent content variation of ephedrine，pseudo-ephedrine and amygdalin.Methods The U6（64） uniform design table was selected to plan proportions，and a simultaneous quantitative HPLC method was used for determination of the content of ephedrine，pseudo-ephedrine and amygdalin in different compatibility of ephedra-almond drugs.Results The regression equation of ephedrine was y=212.36x+0.6658，R2=0.9995；the regression equation of pseudo-oephedrine was y=184.95x+0.7268，R2=0.9990；the regression equation of amygdalin was y=153.5x+2.4961，R2=0.9990.After compatibility of ephedra and almond，the content of ephedrine，pseudo-ephedrine and ephedrine，amygdalin and almond showed a good linear relationship with the compatibility ratio.Conclusion The method is simple，accurate and reproducible.The content of effective components of ephedra-almond drugs and dose is positive correlation，but it has no obvious correlation with compatibility proportion.

[Key words]Ephedra-almond drugs；Ephedrine；Pseudo-ephedrine；Amygdalin

麻黃辛散苦泄，有效成分主要為麻黃堿和偽麻黃堿，具有發(fā)汗、平喘、止咳、祛痰、利尿等藥理作用[1-4]，臨床上多用于水腫、咳喘、無汗、惡寒發(fā)熱、外感風寒等癥狀的治療[5-6]。杏仁味苦微溫，有效成分為苦杏仁苷，主要有祛痰、止咳、平喘、潤腸之功效[7-8]。兩藥配伍使用，麻黃宣肺氣，杏仁降肺氣，一宣一降，相輔相成[9]?！秱摗分新辄S湯、大青龍湯、麻黃杏仁甘草石膏湯、麻黃加術湯、麻黃杏仁薏苡甘草湯、厚樸麻黃湯、文蛤湯等皆為麻黃杏仁合用協(xié)同定喘[10-12]。譚曉梅等[13]研究證實了麻黃-杏仁配伍使用后確實比單用麻黃或杏仁有更好的平喘效果，同時降低苦杏仁毒性，并提出麻黃-杏仁能有效改善哮喘狀態(tài)的作用機制可能與降低嗜酸性粒細胞百分數(shù)和血小板數(shù)量有關。

中醫(yī)治療中，組方劑量配比的不同可能產(chǎn)生不同的治療作用[3，14-16]。為詮釋麻黃-杏仁配伍的科學內(nèi)涵，本研究選用U6（64）均勻設計表，即對麻黃、杏仁2個因素各取6個不同的水平并設計成6種配比，采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）同時測定不同配伍比麻黃-杏仁藥對中麻黃堿、偽麻黃堿與苦杏仁苷的含量，探討不同配伍比麻黃-杏仁藥對中麻黃堿、偽麻黃堿和苦杏仁苷多組分含量變化規(guī)律，為進一步研究不同配伍配比與平喘機制、療效之間的關系奠定基礎。

1儀器與材料

1.1儀器

Waters 2998高效液相色譜儀（美國Waters公司）；超聲波清洗器（深圳市潔康洗凈電器有限公司）；臺式大容量離心機（上海安亭科學儀器廠）；萬分之一天平（梅特勒-托利儀器制造廠）。

1.2試藥與試劑

鹽酸麻黃堿對照品（國家食品藥品檢定研究院，批號：171241-201508）；鹽酸偽麻黃堿對照品（國家食品藥品檢定研究院，批號：171237-201208）；苦杏仁苷對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號：K01020CB14）；甲醇（山東禹王實業(yè)有限公化工公司，批號：20150629033）；磷酸（西隴化工股份有限公司，批號：140913-1）；三乙胺（西隴化工股分有限公司，批號：140222-1）；二正丁胺（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20150603）；乙腈（天津康巢科技開發(fā)有限公司，批號：20131123）；純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）。

1.3藥材

經(jīng)江西中醫(yī)藥大學藥學院付小梅副教授鑒定，麻黃為麻黃科植物草麻黃Ephedra sinica Stapf.的干燥草質(zhì)莖（產(chǎn)地：甘肅，批號：15091069）；苦杏仁為薔薇科植物山杏Prunusarmeniaca L.var.ansu Maxim.的干燥成熟種子（產(chǎn)地：河北，炒苦杏仁，批號：15021533）。

1.4麻黃-杏仁藥對水煎液的制備

參照臨床煎藥方法，按照各配比方量精密稱取藥材，將稱取的麻黃藥材加入方藥總量8倍的水，浸泡30 min，加熱至沸騰，然后改用小火煎煮30 min，加入苦杏仁藥材煎煮40 min，趁熱過濾，量測煎液總?cè)萘浚舸?0 ml，余下煎液濃縮，定容至1 g生藥/ml，煎液和濃縮藥液凍存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

2方法與結果

2.1樣品中麻黃堿和偽麻黃堿的HPLC測定

2.1.1色譜條件 Phenomenex Syncrgi色譜柱（250 mm×4.6 mm，4 μm，廣州菲羅門科學儀器有限公司），流動相：甲醇-0.1%磷酸溶液（含0.04%三乙胺和0.02%二正丁胺）=1.5∶98.5，流速為1.0 ml/min；柱溫25℃，檢測波長210 nm，進樣量10 μl。

按上述色譜條件，分別取麻黃堿-偽麻黃堿混合對照品溶液、麻黃-杏仁藥對供試品溶液、陰性對照溶液各10 μl，注入高效液相色譜儀，結果如圖1。

2.1.2對照品溶液的制備 精密稱取對照品麻黃堿0.0162 g、偽麻黃堿0.0157 g，分別用80%甲醇適量溶解，超聲5 min，置50 ml容量瓶中，定容；另取配制后等容量麻黃堿和偽麻黃堿溶液混合制成混合對照品溶液；配制得到濃度為1.62 μg/ml（麻黃堿）及1.52 μg/ml（偽麻黃堿）的混合對照品儲備液。

2.1.3供試品溶液的制備 將備用凍存煎液37℃水浴解凍，室溫靜置2 h，吸取1.5 ml，15 000 r/min離心10 min，取上清液，0.22 μm微孔膜濾過，取濾液作為供試品溶液。

2.1.4陰性溶液的制備 按“2.1.3”項下方法制備得到不含麻黃的陰性對照樣品。

2.1.5標準曲線的制作 精確吸取麻黃堿、偽麻黃堿對照品儲備液1、2、4、6、8、10 ml分別置于10 ml容量瓶中，用80%甲醇稀釋至刻度，制得系列濃度梯度的標準曲線溶液。溶液經(jīng)0.22 μm有機微孔濾膜濾過后，分別進樣10 μl，按2.1.1所述色譜條件進行HPLC檢測分析，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度（μg/ml，x）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標，繪制標準曲線。麻黃堿回歸方程為y=212.36x+0.6658，R2=0.9995；偽麻黃堿回歸方程為y=184.95x+0.7268，R2=0.9990。

2.2樣品中苦杏仁苷的HPLC測定

2.2.1色譜條件 Agilent TC色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相：甲醇-0.1%磷酸溶液15∶85，流速為1.0 ml/min；柱溫35℃，檢測波長210 nm。進樣量10 μl。

按上述色譜條件，取苦杏仁苷對照品溶液、麻黃-杏仁藥對供試品溶液、陰性對照溶液各10 μl，注入高效液相色譜儀，結果如圖2。

2.2.2對照品溶液的制備 精密稱取對照品苦杏苷0.0156 g，用80%甲醇適量溶解，超聲5 min，置50 ml容量瓶中，定容，配制得到濃度為3.12 μg/ml的對照品儲備液。

2.2.3供試品溶液的制備 將“2.1.3”項下的備用凍存煎液37℃水浴解凍，室溫靜置2 h，吸取1.5 ml，15000 r/min離心10 min，取上清液，0.22 μm微孔膜濾過，取濾液作為供試品溶液。

2.2.4陰性溶液的制備 按“2.1.3”項下方法制備得到不含苦杏仁苷的陰性對照樣品。

2.2.5標準曲線的制作 精確吸取苦杏仁苷對照品儲備液1、2、4、6、8、10 ml分別置于10 ml容量瓶中，用80%甲醇稀釋至刻度，制得系列濃度梯度的標準曲線溶液。溶液經(jīng)0.22 μm有機微孔濾膜濾過后，分別進樣10 μl，按“2.2.1”項下色譜條件進行HPLC檢測分析，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度（μg/ml，x）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標，繪制標準曲線。苦杏仁苷回歸方程為y=153.5x+2.4961，R2=0.9990。

2.3方法學考察

2.3.1精密度試驗 分別精密吸取麻黃堿、偽麻黃堿、苦杏仁苷對照品溶液各10 μl，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結果麻黃堿、偽麻黃堿、苦杏仁苷峰面積的相對標準偏差（RSD）分別為0.11%、0.09%、0.17%，表明儀器精密度良好。

2.3.2重復性試驗 按照“2.1.3”項下方法平行制備麻黃-杏仁藥對供試品溶液6份，0.22 μm微孔濾膜濾過，進樣10 μl，分別測定供試品溶液中麻黃堿、偽麻黃堿、苦杏仁苷的峰面積。結果樣品中麻黃堿、偽麻黃堿、苦杏仁苷峰面積RSD分別為1.54%、1.89%、0.93%，表明本文建立的HPLC檢測方法有著良好的重復性。

2.3.3穩(wěn)定性試驗 取麻黃-杏仁藥對供試品溶液，分別于制備后0、2、4、6、8、12、24 h后進樣10 μl，記錄峰面積。結果樣品中麻黃堿、偽麻黃堿、苦杏仁苷峰面積RSD分別為0.78%、1.22%、1.04%，表明在24 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定。

2.3.4加樣回收率試驗 按照“2.1.3”項下方法平行制備麻黃-杏仁藥對供試品溶液9份，分別精密加入高、中、低3個濃度麻黃堿、偽麻黃堿、苦杏仁苷對照液1 ml（每個濃度3份），按上述色譜條件對三種成分進行檢測，計算回收率。結果麻黃堿、偽麻黃堿、苦杏仁苷的平均加樣回收率分別為98.08%、99.78%、98.56%，RSD值分別為2.69%、1.55%、1.18%。

2.4樣品測定

選用均勻設計表Un（ns）來規(guī)劃實驗，其中s為待考察因素，n為實驗次數(shù)和水平數(shù)。即對麻黃、杏仁兩個因素各取6個不同的水平并設計成6種配比進行考察，選用U6（64）表。麻黃的藥典用量為1.5～10.0 g，杏仁的藥典用量為4.5～9.0 g。生藥總量100 g，均勻設計實驗配比方案，結果如表1。

參照臨床煎藥方法，按照上表中各配比方量稱取藥材，將稱取的麻黃藥材加入方藥總量8倍的水，浸泡30 min，加熱至沸騰，然后改用小火煎煮30 min，加入苦杏仁藥材煎煮40 min，趁熱過濾，即得供試品溶液。供試品溶液各6份，分別進樣10 μl，依次測定樣品中麻黃堿、偽麻黃堿、苦杏仁苷的含量，折算成1 g生藥/ml的含量，結果如表2。

從表2可以看出，隨著麻黃用量的增加，麻黃堿和偽麻黃堿的含量也隨之增加。分別以麻黃用藥量為橫坐標（x），麻黃堿或偽麻黃堿含量為縱坐標（y），得線性回歸方程分別為y=0.0307x+0.2316，R2=0.9908；y=0.0397x-0.0033，R2=0.9967，表明麻黃堿和偽麻黃堿在麻黃-杏仁藥對中的含量與麻黃的用量呈現(xiàn)良好的線性關系。

隨著杏仁用量的增加，苦杏仁苷的含量也隨之增加。以杏仁用藥量為橫坐標（x），苦杏仁苷含量為縱坐標（y），得線性回歸方程為y=0.2015x+0.9631，R2=0.9969，表明苦杏仁苷在麻黃-杏仁藥對中的含量與杏仁的用量亦呈現(xiàn)良好的線性關系。且配伍比例的改變對麻黃堿、偽麻黃堿和苦杏仁苷的含量均無明顯影響。

3討論

3.1分析方法選擇

目前文獻中報道的麻黃堿和偽麻黃堿定量方法主要有HPLC[11，17-18]和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）[19-20]兩種；苦杏仁苷常用的定量方法有HPLC[21]和液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜法（UPLC-QTOF-MS/MS）[22]。分析比較發(fā)現(xiàn)，HPLC、GC-MS和UPLC-QTOF-MS/MS分別用于麻黃堿、偽麻黃堿和苦杏仁苷定量時，均有分離度高、穩(wěn)定性好的特點，又因HPLC設備使用維修成本較低，是目前應用最為廣泛的藥物分析方法，故本研究選用HPLC對麻黃-杏仁藥對中麻黃堿、偽麻黃堿和苦杏仁苷進行定量分析。

3.2流動相考察

以不同比例的甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸、甲醇-0.1%磷酸作為流動相考察，以甲醇-0.1%磷酸溶液（1.5∶98.5）為流動相測定麻黃堿和偽麻黃堿時，以甲醇-0.1%磷酸溶液（15∶85）為流動相時測定苦杏仁苷，峰型與分離效果均最佳。

3.3供試品溶液的選擇

為了更為準確地測定各組分含量，且與對照品有更好的可比性，本研究對供試品溶液進行了篩選。將1 g生藥/ml濃縮藥液作為供試品，結果響應值相對過大；將濃縮液分別稀釋5、20、40倍后作為供試品，響應值均相對不佳，且檢測取樣微量，考慮到稀釋過程對備用凍存濃縮液微量取樣也存在影響，故最終選擇未濃縮煎液作為供試樣品，響應值相對較好，與對照品可比性好。測定其中各組分含量，再折算成1 g生藥/ml的濃度。用該方法計算得到的含量準確可靠，可以作為麻黃-杏仁藥對質(zhì)量監(jiān)控方法。

3.4不同配伍比對麻黃-杏仁藥對中麻黃、偽麻黃、苦杏仁苷含量的影響

實驗結果可見，隨著配伍比例的變化，麻黃堿、偽麻黃堿的含量與麻黃用量（R2分別為0.9908和0.9967）、苦杏仁苷和杏仁用量之間（R2=0.9969）均呈現(xiàn)良好的線性關系；而配伍比例的改變對麻黃堿、偽麻黃堿和苦杏仁苷的含量均無明顯影響，表明配伍比例對有效成分的含量無明顯影響，結果與文獻報道相一致[16]。而不同配伍比對麻黃-杏仁藥對的藥動學及藥效學影響均有待于進一步研究。

[參考文獻]

[1]于海峰.麻黃研究簡史[D].哈爾濱：黑龍江中醫(yī)藥大學，2011：1-74.

[2]傅延齡，張林.歷代麻黃臨床用量評述[J].世界中醫(yī)藥，2014，9（1）：3-7.

[3]李偉霞，唐于平，劉立，等.藥對研究（Ⅲ）——藥對的功效物質(zhì)基礎[J].中國中藥雜志，2013，38（24）：4196-4202.

[4]徐彥飛，蔡永敏.麻黃湯原始劑量應用啟悟[J].中醫(yī)雜志，2015，56（9）：807-810.

[5]劉寶磊，孫佳石.麻黃古今應用[J].河南中醫(yī)，2013，33（11）：2015-2016.

[6]廖芳，張丹，蘭明輝，等.探析不同炮制方法對麻黃主要功效影響的機理[J].西部中醫(yī)藥，2015，28（8）：12-15.

[7]賈玉梅，張祥云.2013第六次臨床中藥學學術年會暨臨床中藥學學科建設經(jīng)驗交流會論文集[A]//中華中醫(yī)藥學會[C].北京.2013：348-351.

[8]崔亞珊，徐立鵬，仝小林.杏仁臨床用量研究[J].中國臨床醫(yī)生，2014，42（6）：83-84.

[9]嚴興海，蔡基鴻.麻黃在張仲景治哮喘諸方中的應用淺析[J].西部中醫(yī)藥，2012，25（3）：9-11.

[10]劉貴軍，李然，李全.麻黃常用藥對的配伍方法[J].中醫(yī)藥信息，2011，28（2）：13-14.

[11]黃曉潔，魏剛，張龍，等.麻杏石甘湯的藥理作用和臨床應用研究進展[J].廣東藥學院學報，2014，30（1）：110-114.

[12]任耀全，石宗珂，沈玉鵬.麻杏化瘀湯加減治療肺炎喘嗽痰熱閉肺型療效觀察[J].西部中醫(yī)藥，2015，28（5）：103-105.

[13]譚曉梅，郭陽，余林中，等.麻黃-杏仁藥對配伍及不同配比對急性毒性及平喘作用的影響[J].中藥藥理與臨床，2013，29（1）：82-84.

[14]謝穎，湯慶發(fā)，徐文杰，等.不同配伍比例對麻黃-杏仁藥對有效成分含量的影響[J].時珍國醫(yī)國藥，2012，23（11）：2686-2688.

[15]譚曉梅，郭陽，余林中，等.麻黃-杏仁藥對配伍及不同配比對急性毒性及平喘作用的影響[J].中藥藥理與臨床，2013，29（1）：82-84.

[16]吳昭暉，羅佳波，胡曉添.HPLC法研究配伍對麻黃湯中苦杏仁苷含量的影響[J].中草藥，2004，35（3）：269-270.

[17]謝穎，湯慶發(fā)，宋帥，等.藥對麻黃-杏仁配伍對哮喘大鼠干預的尿液代謝組學研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2015，26（4）：815-817.

[18]曾勇，李睿，曾岑，等.HPLC測定不同配比麻黃湯水煎液中的麻黃堿和偽麻黃堿[J].華西藥學雜志，2014，29（4）：433-435.

[19]姜麗，李惠蘭，張啟云，等.HPLC法同時測定麻杏石甘湯中5種成分的含量[J].中華中醫(yī)藥雜志，2015，30（2）：537-540.

[20]趙杰.麻黃類藥對組成規(guī)律的基礎研究-麻黃-甘草藥對（Ⅰ）[D].廣州：南方醫(yī)科大學，2012：1-114.

[21]謝穎.麻黃-杏仁藥對配伍的主要化學成分及尿液代謝物的研究[D].廣州：南方醫(yī)科大學，2013：1-62.

[22]高萌，王躍生，魏惠珍，等.超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜和超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜用于血漿中苦杏仁苷及其代謝產(chǎn)物野黑櫻苷的定性和定量分析[J].色譜，2014，32（6）：591-599.

（收稿日期：2016-11-10 本文編輯：任 念）

[基金項目]國家自然科學基金項目（81460610）

[作者簡介]楊麗（1977-），女，江西中醫(yī)藥大學2014級藥學專業(yè)在讀碩士研究生，研究方向：基礎藥學

通訊作者：李文宏（1974-），男，博士，副教授，碩士生導師，研究方向：中藥藥理學