沙利度胺對(duì)前列腺癌PC3細(xì)胞的增殖及其IL—6和Cx43表達(dá)的影響

尹衛(wèi)華+夏紅梅+羅小瑾+徐榮+胡小雄

[摘要]目的 觀察沙利度胺對(duì)前列腺癌PC3細(xì)胞增殖和凋亡的作用及其IL-6和Cx43表達(dá)的影響。方法 將遞增濃度6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 μg/ml沙利度胺加入處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的前列腺癌PC3細(xì)胞培養(yǎng)。采用MTT法檢測(cè)不同濃度沙利度胺對(duì)PC3細(xì)胞的增殖抑制影響，Annexin PI雙染色法檢測(cè)PC3細(xì)胞凋亡情況，ELISA法檢測(cè)PC3細(xì)胞中IL-6和Cx43的表達(dá)。結(jié)果 25.00、50.00、100.00 μg/ml沙利度胺能明顯抑制PC3細(xì)胞體外增殖，隨著時(shí)間延長(zhǎng)、濃度增加，增殖抑制率相應(yīng)升高；IL-6表達(dá)隨沙利度胺濃度增加而下降（r=-0.924，P=0.009），Cx43表達(dá)與沙利度胺濃度成正相關(guān)（r=0.915，P=0.010）。結(jié)論 沙利度胺可通過(guò)抑制人前列腺癌PC3細(xì)胞IL-6表達(dá)、上調(diào)Cx43水平，可能恢復(fù)細(xì)胞縫隙連接通訊功能來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)其調(diào)亡，從而達(dá)到抗腫瘤效果。

[關(guān)鍵詞]沙利度胺；前列腺癌；白介素-6；連接蛋白43

[中圖分類號(hào)] R737.25 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2017）02（b）-0008-04

[Abstract]Objective To observe the effects of Thalidomide on the proliferation and apoptosis of prostate cancer PC3 cells，as well as on the expression of the protein Cx43 and IL-6 in this cells.Methods Thalidomide with different concentrations （6.25，12.50，25.00，50.00，100.00 μg/ml） was added to PC3 cells at the logarithmic growth phase.MTT was used to detect the inhibitory effect of different concentration of Thalidomide on proliferation of PC3 cells，the apoptosis rate of PC3 cells was studied by Annexin V fluorescein isothiocyanate （Annexin PI） double staining with flow cytometry.Enzyme-linked Immunosorbnent assay method was used to detect the expression of IL-6 and Cx43 in PC3 cells.Results Below 25.00，50.00，100.00 μg/ml，Talidomide significantly inhibited the proliferation of PC3 cells in vitro，and the inhibition rate increased with the increase of time and concentration，the expression of IL-6 decreased with the increasing of concentration（r=-0.924，P=0.009），the expression of Cx43 had positive correlation with the concentration of thalidomide（r=0.915，P=0.010）.Conclusion Thalidomide can inhibit the expression of IL-6 in PC3 cells，increase the expression levels of Cx43，restore the functional refreshment of gap junction intercellular communication function in prostate cancer PC3 cells for in inhibiting the proliferation of PC3 cells and inducing its apoptosis，in order to inhibit the growth of tumor.

[Key words]Thalidomide；Prostate cancer；Interleulin-6；Connexin43

前列腺癌是目前男性最常見(jiàn)的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤之一，在西方國(guó)家，其死亡率位居惡性腫瘤的第2位[1-2]。近年來(lái)，我國(guó)前列腺癌發(fā)病率明顯呈上升趨勢(shì)[3-4]。早期前列腺癌采用去勢(shì)治療取得了一定的效果，18～24個(gè)月發(fā)展為激素非依賴性前列腺癌。目前激素非依賴性前列腺癌缺乏有效的治療手段，是前列腺癌患者死亡的主要原因。雖然以紫杉醇類為基礎(chǔ)的化療藥如多西他賽、卡巴他賽以及新藥阿比特龍，Sipuleucel-T疫苗可改善激素非依賴性前列腺癌患者短期生存，但仍然逃脫不了耐藥、免疫耐受的問(wèn)題[5-6]。相關(guān)研究顯示，前列腺癌進(jìn)展可能與白介素-6（interleulin-6，IL-6）、連接蛋白43（Connexin43，Cx43）有關(guān)[7-11]。IL-6是具有強(qiáng)烈激發(fā)雄激素受體，上調(diào)腫瘤細(xì)胞VEGF的表達(dá)，是前列腺癌進(jìn)展因素之一[7-8]。Cx43是介導(dǎo)細(xì)胞間縫隙連接通訊（gap junctional intercellular communation，GJIC）的蛋白，為腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞提供連接途徑，GJIC功能受Cx43的調(diào)控；Cx43表達(dá)下降，GJIC轉(zhuǎn)移功能低可促使腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和正常細(xì)胞的惡性表型轉(zhuǎn)化，在激素非依賴性前列腺癌的細(xì)胞生物學(xué)行為惡化過(guò)程中起決定作用[9-11]。

沙利度胺又名反應(yīng)停，是一種合成性的谷氨酸衍生物，化學(xué)名稱是N-（2，6-二氧代-3哌啶基）-鄰苯二甲酰亞胺，通過(guò)抑制血管增殖、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)，具體機(jī)制不清楚。本課題組前期工作提示，沙利度胺能抑制IL-6，上調(diào)Cx43，本實(shí)驗(yàn)旨在利用體外細(xì)胞培養(yǎng)來(lái)觀察沙利度胺對(duì)前列腺癌PC3細(xì)胞增殖及其IL-6、Cx43表達(dá)的影響，從細(xì)胞通訊的角度來(lái)探討激素非依賴性前列腺癌分子機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料

人雄激素非依賴型前列腺癌PC3細(xì)胞株由南方醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院贈(zèng)送。純品沙利度胺購(gòu)自常州制藥廠。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清均購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；青霉素-鏈霉素溶液（100X）購(gòu)自中國(guó)碧云天生物技術(shù)公司；IL-6、CX ELISA試劑盒、Annexin試劑盒均購(gòu)置R&D Systems總公司；流式細(xì)胞儀：美國(guó)BD公司FACS Vantage產(chǎn)品，使用CellQuest軟件系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及增殖試驗(yàn)檢測(cè) 前列腺癌PC3細(xì)胞置于含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，37℃ 5%二氧化碳連續(xù)培養(yǎng)，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的PC3細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰酶消化，加入96孔板，以5×105個(gè)/孔接種到96孔培養(yǎng)板，每孔200 μl。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、沙利度胺實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組均設(shè)6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 μg/ml共5個(gè)濃度，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)加藥，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入150 μl的MTT試劑（5 g/L），培養(yǎng)4 h，然后棄上清液，加入100 μl二甲基亞砜，震蕩15 min。用酶標(biāo)儀測(cè)定492 nm波長(zhǎng)處（以630 nm為參考）的各孔吸光度D（λ）值，計(jì)算PC3細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組D492 nm/空白對(duì)照組D492 nm）×100%。

1.2.2細(xì)胞調(diào)亡實(shí)驗(yàn) 按上述實(shí)驗(yàn)，離心收集各處理組的細(xì)胞，按凋亡檢測(cè)試劑說(shuō)明步驟行Annexin V與碘化丙啶（propidium iodide，PI）雙標(biāo)染色，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 IL-6和Cx43檢測(cè) PC3細(xì)胞在培養(yǎng)24、48 h后，3000 r/min，4℃離心10 min，取上清液。按ELISA操作說(shuō)明書(shū)檢測(cè)Cx43和IL-6蛋白的表達(dá)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)和方差分析，計(jì)數(shù)資料用百分率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1沙利度胺對(duì)PC3細(xì)胞增殖的影響

MTT法結(jié)果顯示，細(xì)胞增殖均呈現(xiàn)不同程度的抑制，且隨沙利度胺濃度增加、作用時(shí)間延長(zhǎng)，沙利度胺對(duì)PC3細(xì)胞的增殖抑制作用逐漸增強(qiáng)，呈明顯的劑量-效應(yīng)和時(shí)間-效應(yīng)依賴關(guān)系。不同濃度沙利度胺作用PC3細(xì)胞24、48 h后，抑制率由1.3%增至48.6%（圖1）。

2.2沙利度胺對(duì)PC3細(xì)胞凋亡的影響

不同濃度沙利度胺作用PC3細(xì)胞48 h后，25.00、50.00、100.00 μg/ml組凋亡率分別為（8.02±0.15）、（15.70±0.23）、（48.10±0.33），空白對(duì)照組細(xì)胞的凋亡率為（0.01±0.01），不同濃度的沙利度胺組與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖2）。

2.3不同濃度沙利度胺對(duì)PC3細(xì)胞中IL-6和Cx43表達(dá)水平的影響

隨沙利度胺作用時(shí)間的延長(zhǎng)，各實(shí)驗(yàn)組Cx43表達(dá)均逐漸升高，沙利度胺藥物作用濃度最高100.00 μg/ml組表達(dá)最早且最明顯，而沙利度胺藥物濃度最低6.25 μg/ml組表達(dá)最不明顯。IL-6隨沙利度胺濃度、作用時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)均逐漸降低，沙利度胺藥物作用濃度最高的100.00 μg/ml組表達(dá)下降最明顯，而沙利度胺藥物濃度最低的6.25 μg/ml組表達(dá)最不明顯。24 h后，100.00 μg/ml組Cx43、IL-6與其他組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；48 h后，25.00 μg/ml組、50.00 μg/ml組、100.00 μg/ml組優(yōu)于空白對(duì)照組（P<0.05）。PC3細(xì)胞Cx43表達(dá)量與沙利度胺的濃度成正相關(guān)（r=0.915，P=0.010），而IL-6表達(dá)與沙利度胺濃度成負(fù)相關(guān)（r=-0.924，P=0.009）（圖3）。

3討論

激素非依賴性前列腺癌進(jìn)展是多種因素、多步驟導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境異常[12]，從而引起癌細(xì)胞以更惡性的生物行為復(fù)發(fā)，或獲得雄激素非依賴性增殖能力，給臨床上治療帶來(lái)困境。人Cx43主要通過(guò)形成細(xì)胞膜間的通道樣結(jié)構(gòu)，為腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞提供連接途徑；Cx43通過(guò)細(xì)GJIC間接調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和正常細(xì)胞的惡性表型轉(zhuǎn)化，在前列腺癌進(jìn)展過(guò)程中起一定的作用。研究顯示，Cx43為前列腺基底細(xì)胞連接通訊點(diǎn)，其介導(dǎo)的GJIC對(duì)維持前列腺組織中的細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和分化起關(guān)鍵作用，GJIC功能異?？赡軙?huì)導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化；Cx43蛋白在前列腺癌組織中表達(dá)及其強(qiáng)度降低，且與前列腺癌惡性程度成負(fù)相關(guān)，說(shuō)明癌細(xì)胞的GJIC水平普遍下降，導(dǎo)致了上皮細(xì)胞異?；虿荒芸刂破渖L(zhǎng)增殖和分化，進(jìn)而促進(jìn)了惡性表型的進(jìn)展[9-11]。此外，IL-6作為炎性因子，參與調(diào)控包括前列腺癌在內(nèi)的多種腫瘤的血管形成、腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移過(guò)程，其機(jī)制多與JAK或Stat3信號(hào)通路有關(guān)。在LNCap細(xì)胞中，IL-6通過(guò)Stat3途徑激活雄激素受體（androgen receptor，AR），上調(diào)VEGF表達(dá)，從而啟動(dòng)AR介導(dǎo)的基因表達(dá)。進(jìn)一步研究證實(shí)LNCap細(xì)胞過(guò)表達(dá)IL-6，可增加前列腺特異性抗原mRNA的表達(dá)水平，降低LNCap細(xì)胞因雄激素阻斷引起的凋亡[13-15]。同時(shí)，可誘導(dǎo)癌細(xì)胞的上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)生，與細(xì)胞間通訊功能有一定的關(guān)系[16-17]，目前機(jī)制不清楚。Cx43和IL-6均作用于腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞，可能使Cx43的羧基端S325與酪蛋白激酶1結(jié)合后磷酸化，影響VEGF和IL-6的表達(dá)。

沙利度胺作為抗腫瘤血管生成劑之一，能抑制相關(guān)血管生成因子如VEGF、bFGF的作用[18]，根據(jù)本課題組前期臨床經(jīng)驗(yàn)，在肺癌放化療應(yīng)用中具有良好的療效[19]。本研究提示，沙利度胺作用于PC3細(xì)胞48 h后，凋亡率明顯高于對(duì)照組（P<0.05），誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能是其抑制PC3細(xì)胞增殖的機(jī)制之一；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著沙利度胺濃度的增加，Cx43的表達(dá)增強(qiáng)，與腫瘤增殖明顯成負(fù)相關(guān)；而IL-6的表達(dá)量減少，腫瘤增殖也減少。進(jìn)一步闡明沙利度胺作用前列腺癌的機(jī)制，通過(guò)上調(diào)Cx43和抑制IL-6表達(dá)，恢復(fù)PC3細(xì)胞GJIC的功能來(lái)抑制前列腺癌生長(zhǎng)。

在長(zhǎng)期應(yīng)用沙利度胺治療肺癌的病例中，本課題組發(fā)現(xiàn)沙利度胺可以抑制IL-6的表達(dá)，但其最常見(jiàn)不良反應(yīng)為心律失常，主要表現(xiàn)為房室傳導(dǎo)阻滯和心動(dòng)過(guò)緩[19]。Cx43分布于心房和心室[20]；沙利度胺在腫瘤治療過(guò)程中，可能導(dǎo)致心肌Cx43的細(xì)胞縫隙連接的數(shù)量并使功能出現(xiàn)異常，引起心律失常，從這一個(gè)側(cè)面印證了沙利度胺對(duì)Cx43的作用。這提示沙利度胺對(duì)IL-6和Cx43作用機(jī)制比較復(fù)雜，可能通過(guò)多條信號(hào)通路完成。本實(shí)驗(yàn)初步研究沙利度胺對(duì)PC3細(xì)胞中IL-6和Cx43的表達(dá)產(chǎn)生一定的影響，對(duì)于其作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Siegel RL，Miller KD，Jemal A.Cancer Statistics，2010[J].CA Cancer J Clin，2010，67（1）：7-30.

[2]Detchokul S，Elangovan A，Edmund J，et al.Network analysis of an in vitro model of androgen-resistance in prostate cancer[J].BMC cancer，2015，60（2）：883-895.

[3]韓蘇軍，張思維，陳萬(wàn)青，等.中國(guó)前列腺癌發(fā)病現(xiàn)狀和流行趨勢(shì)分析[J].臨床腫瘤學(xué)雜志，2013，18（4）：330-334.

[4]韓仁強(qiáng)，武鳴，陳萬(wàn)青，等.2003～2007 年中國(guó)前列腺癌發(fā)病與死亡分析[J].中國(guó)腫瘤，2012，21（11）：805-811.

[5]Arlen PM，Gulley JL，Parker C，et al.A randomized phase Ⅱ study of concurrent docetaxel plus vaccine versus vaccine alone in metastatic androgen-independent prostate cancer[J].Clin Cancer Res，2006，12（8）：1260-1269.

[6]Calabro F，Sternberg CN.Current indications for chemotherapy in prostate cancer patients[J].Eur Urol，2007，51（1）：17-26.

[7]Chung TD，Yu JJ，Spiotto MT，et al.Characterization of the role of IL-6 in the progression of prostate cancer[J].Prostate，1999，38（3）：199-207.

[8]Cohen T，Nahari D，Cerem LW，et al.Interleukin-6 induces the expression of vascular endothelial growth factor[J].J Biol Chem，1996，271（2）：736-741.

[9]Habermann H，Bay V，Habermann W，et al.Alterations in gap junction protein expression in human benign prostatic byperplasia and prostate cancer[J].J Urol，2002，167（2）：655-660.

[10]Fukushima M，Hattori Y，Yoshizawa T，et al.Combination of none-viral connexin 43 gene therapy and docetaxel inhibits the growth of human prostate cancer in mice[J].Int J Oncol，2007，30（1）：225-231.

[11]Tate AW，Lung T，Radhakrishnan A，et al.Changes in gap junctional connexin isoforms during prostate cancer progression [J].Prostate，2006，66（1）：19-31.

[12]陳小珂，張峰，鄭航，等組織學(xué)前列腺炎在前列腺癌伴尿潴留中的臨床意義[J].中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥，2015，22（19）：79-81.

[13]Bao B，Ahmad A，Kong D，et al.Hypoxia induced aggressiveness of prostate cancer cells is linked with deregulated expression of VEGF，IL6 and miRNAs that are attenuated by CDF[J].PLoS One，2012，7（8）：e43726.

[14]Lee SO，Chun JY，Nadiminty N，et al.Interleukin 6 undergoes transition from growth inhibitor associated with neuroendocrine differentiation to stimulator accompanied by androgen receptor activation during LNCaP prostate cancer cell progression[J].Prostate，2007，67（7）：764-73.

[15]袁芳，任黔川.VEGF-C對(duì)宮頸癌凋亡影響的研究進(jìn)展[J].中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥，2014，21（33）：188 -193.

[16]張開(kāi)平，梁朝朝，陳先國(guó)，等.IL-6、NF-ΚΒ在前列腺癌組織中表達(dá)及其臨床意義[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，51（6）：893-896.

[17]章國(guó)亮，姜慶，江軍.二甲雙胍抑制IL-6誘導(dǎo)LNCaP增殖及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，35（13）：1337-1340.

[18]于靜萍，孫志強(qiáng)，倪新初，等.沙利度胺聯(lián)合照射對(duì)人食管癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)和腫瘤血管生成的影響[J].中華放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)雜志，2013，33（6）：584-587.

[19]尹衛(wèi)華，聶春華，夏紅梅，等.沙利度胺對(duì)放射性肺損傷的實(shí)驗(yàn)研究[J].現(xiàn)代腫瘤學(xué)雜志，2016，19（8）：3031-3034.

[20]宣麗穎，陶謝鑫，趙雅君，等.黃芪總黃酮對(duì)柯薩奇B3病毒感染乳鼠心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及Calumenin蛋白和縫隙連接蛋白CX43的作用[J].中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志，2016， 32（4）：51-54.

（收稿日期：2016-12-28 本文編輯：方菊花）

[作者簡(jiǎn)介]尹衛(wèi)華（1976-），博士，副主任醫(yī)師，主要從事腫瘤免疫研究

通訊作者：羅小瑾（1981-），碩士，副主任醫(yī)師，主要從事泌尿外科疾病研究