大頭典竹葉片蛋白質(zhì)組學(xué)雙向電泳技術(shù)體系的優(yōu)化

陳思凱+瞿印權(quán)++楊德明+陳劍成+宋鯤鵬++劉家琪+何天友++榮俊冬++鄭郁善++陳禮光

摘 要：目的：為了獲得清晰的蛋白凝膠圖譜，建立適用于大頭典竹蛋白組學(xué)雙向電泳的優(yōu)化體系。方法：對(duì)大頭典竹蛋白提取方法、膠條的水化運(yùn)行方式、等電聚焦（IEF）程序的設(shè)置、蛋白上樣量等步驟進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果：大頭典竹的蛋白斑點(diǎn)主要分布在pH5～8的范圍；三氯乙酸-丙酮法與酚抽結(jié)合法更適合大頭典竹蛋白的提取；IPG膠條膠面向上、被動(dòng)水化方式、蛋白上樣量為50μL，效果更好。結(jié)論：通過(guò)建立雙向電泳（2-DE）的優(yōu)化體系，獲得的蛋白點(diǎn)均勻、清晰、橫縱條紋少的凝膠圖譜，提高了分辨率，為大頭典竹差異蛋白組學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：大頭典竹；雙向電泳；蛋白組學(xué)

中圖分類號(hào) Q946-33 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2017）05-0041-05

Abstract：[Objective]In order to obtain a clear protein gel electrophoresis，the optimal two-dimensional electrophoresis system suitable for D.beecheyana var. pubescens was established. [Methods]The total protein extraction method，hydration operation mode of strip， program arguments setting of isoelectric focusing and protein amount were optimized to establish an optimal two-dimensional electrophoresis system suitable for D.beecheyana var.pubescens. [Results] Bamboo protein spots were mainly distributed in the scope of the pH5-8. Using trichloroacetic acid - acetone method combined with phenol extraction method is more suitable for the extraction of the D.beecheyana var. pubescens protein. Placing the surface of strip up-side down， passive hydration mode，50μL amount of protein is benefit to obtain optimal effect of gel electrophoresis.[Conclusion] Through the establishment of two-dimensional electrophoresis （2 DE） the optimization of the system， obtaining protein point uniform，clear， map of transverse and less longitudinal stripes gel electrophoresis and improving the resolution，provided the basis for further studies of the proteomics for D.beecheyana var.pubescens.

Key words：D.beecheyana var. pubescens；Two-dimensional electrophoresis；Proteomics

大頭典竹（Dendrocaiamopsis beecheyana Var pubescens P.F.Li）別名新竹、大頭竹，屬禾本科竹亞科綠竹屬。大頭典竹具有成活率高、生長(zhǎng)快、適應(yīng)能力強(qiáng)等特點(diǎn)，大型的叢生竹大頭典竹已成為福建漳州東山島主要的蓄水防風(fēng)樹(shù)種，具有很強(qiáng)的土層固沙能力[1]，完全適合在沿海沙地生長(zhǎng)[2]。目前，對(duì)大頭典竹的研究停留在生理水平上，而從分子水平上研究大頭典竹的機(jī)理至關(guān)重要。

蛋白質(zhì)是構(gòu)成生物體細(xì)胞、組織的重要組成部分之一，是生命活動(dòng)主要的承當(dāng)者[3]。蛋白質(zhì)在生命過(guò)程中扮演著重要的角色，是生命代謝活動(dòng)的體現(xiàn)者，協(xié)助參與完成生命中的各項(xiàng)活動(dòng)。隨著植物基因組研究的不斷深入，有關(guān)蛋白質(zhì)組學(xué)的研究逐漸成為了人們關(guān)注的重點(diǎn)。構(gòu)建一個(gè)可行、可信的蛋白質(zhì)技術(shù)的優(yōu)化體系，來(lái)分析蛋白質(zhì)組學(xué)的差異性研究是至關(guān)重要的。蛋白質(zhì)組學(xué)（Proteomics）的概念最早是于1994年由Wilkms和Williams等首次提出[4]，并于1995年在Electrophoresis雜志中提到蛋白質(zhì)學(xué)的概念。蛋白質(zhì)組學(xué)是一門(mén)從整體蛋白質(zhì)水平上去研究生命重要活動(dòng)的學(xué)科。隨著蛋白組概念的提出，蛋白質(zhì)學(xué)已經(jīng)為基因表達(dá)類復(fù)雜問(wèn)題提供了相當(dāng)有效的解決方法[5]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 供試材料 從福建省漳州東山島赤山林場(chǎng)截取大頭典竹1～2年生側(cè)枝扦插培育，以大頭典竹長(zhǎng)出的新葉作為實(shí)驗(yàn)的材料。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 17cm的干膠條、碘乙酰胺（lodoacetamide）、1.5MTris-HCl8.8、1.0MTris-HCl6.8、兩性電解質(zhì)（Bio-Lyte，3-10，5-7）、硫脲（Thiourea）、過(guò)硫酸銨（AP）、尿素（Urea）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、二硫代蘇糖醇（DTT）、十二烷基硫酸鈉（SDS）購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司；礦物油（Mineral-oil）、二甲氨基丙磺酸內(nèi)鹽（chaps）、四甲基乙二胺（TEMED）、低熔點(diǎn)瓊脂糖（low-Agarose）、硫代硫酸鈉（Sodium thiosμLfate）購(gòu)于美國(guó)GE公司；β-巰基乙醇（β-Mercaptoethano）、溴酚藍(lán)、無(wú)水乙醇、冰乙酸、無(wú)水糖酸鈉、甘油、三氯乙酸（TCA）等為國(guó)產(chǎn)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大頭典竹全蛋白的提取 本實(shí)驗(yàn)采用了TCA丙酮法[6]、酚抽法[7]、參改良的SDS酚抽法[6]進(jìn)行微動(dòng)修改。稱取大頭典竹新鮮葉片0.2g，剪碎加入到球磨儀配套的2mL的離心管中，每管0.2g，并在管中加入少量的交聯(lián)聚維酮（PVPP）。液氮中冷卻后放入球磨儀中研磨成粉末。轉(zhuǎn)移至2mL的離心管中，放入液氮中冷卻。加滿10%TCA/丙酮溶液，渦旋震蕩。4℃的條件下，1RPM的轉(zhuǎn)速，離心10min，去除上清液。重復(fù)用80%甲醇和0.1mol醋酸銨溶液、80%丙酮溶液清洗。風(fēng)干干燥30min加入Tris-飽和酚和SDS提取液，渦旋震蕩，離心，吸取上層酚相，加滿甲醇醋酸銨溶液，-20℃冰箱靜置，待沉淀后離心，去除上層清液，風(fēng)干干燥。分別依次加入100%的甲醇和80%丙酮渦旋、震蕩、離心。重復(fù)2次，直至洗干凈。風(fēng)干干燥30min，即得到白凈的蛋白干粉。

1.2.2 蛋白的裂解 稱取10mg的蛋白干粉，以1mg加50μL裂解液的比例，加入500μL的裂解液，渦旋震蕩10min。超聲5min，冰浴5min。4℃、17000×g條件下離心10min后，吸取上層清液，即純凈的蛋白。

1.2.3 蛋白的定量 Brafford法測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)含量，以牛血清蛋白（BSA）作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.2.4 雙向電泳分析

1.2.4.1 IEF 從超低溫冰箱中拿出17cm的IPG干膠條放置在濾紙上15min左右，以恢復(fù)室溫。從-80℃冰箱中取出保存好的樣品蛋白，加入到配置好的水上樣緩沖液中。小心吸取混合均勻的水化上樣液緩緩地加入到水化盤(pán)中。剝開(kāi)固相PH梯度（IPG）干膠條保護(hù)膜，將準(zhǔn)備好的膠面向下輕蓋于上樣液上。來(lái)回晃動(dòng)IPG膠條，確保膠條與水化液充分接觸。放置室溫條件讓IPG膠條吸收10min，在水化盤(pán)的凹槽中沿著邊沿加5mL的礦物油，水化24h后，進(jìn)行等點(diǎn)聚焦。

1.2.4.2 膠條的平衡 等點(diǎn)聚焦后，將IPG膠條直立在濾紙上2min，待膠條上甘油吸盡后，轉(zhuǎn)移至干凈的水化盤(pán)中，加入平衡液1（36g尿素、2Gsds、25mL Tris、20mL甘油），平衡15min后，在濾紙上吸干平衡液1后，轉(zhuǎn)移至平衡2液中，平衡15min。再將膠條轉(zhuǎn)移至第二向SDS-PAGE膠上。

1.2.4.3 SDS-PAGE 分離膠濃度為10%，蛋白分析軟件為PDQURST8.0.1。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蛋白提取方法的比較 在大頭典竹蛋白組學(xué)的研究中，蛋白樣品的制備是研究蛋白組學(xué)基礎(chǔ)而核心的步驟之一，是獲得清晰蛋白點(diǎn)的重要技術(shù)手段[6]。全蛋白的提取質(zhì)量直接或間接地影響到雙向電泳凝膠圖譜的結(jié)果[7]。因此，為了減少大頭典竹蛋白提取過(guò)程中蛋白的丟失，提高蛋白的濃度和純度，選擇和優(yōu)化一套適合大頭典竹蛋白的提取方法是至關(guān)重要的。本實(shí)驗(yàn)稱取0.2g的大頭典竹葉片，研磨粉碎后采用3種不同的蛋白樣品制備方法，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)后，結(jié)果見(jiàn)圖1。TCA丙酮法蛋白的條帶模糊，分子量在65kD以上的條帶基本看不清。Tris-酚抽法和SDS酚抽法獲得的蛋白條帶沒(méi)有明顯的差異，SDS酚抽法得到的條帶顏色相對(duì)更深些，蛋白分子量在15kD條帶有所差異。

TCA丙酮法是提取蛋白樣品較為常見(jiàn)的方法之一，方法簡(jiǎn)單，易操作，但存在沉淀蛋白質(zhì)互溶問(wèn)題，樣品中非蛋白成分很難除去，造成蛋白丟失且殘留著較多的雜質(zhì)[8]。通過(guò)對(duì)比3個(gè)凝膠圖像，可以很明顯看出，TCA丙酮法提取蛋白的電泳圖譜并不太理想，蛋白斑點(diǎn)少，丟失嚴(yán)重（圖2）。經(jīng)PDQUEST8.0.1軟件檢測(cè)，TCA丙酮法提取大頭典竹蛋白得到的蛋白斑點(diǎn)僅為168個(gè)。從圖2-B可以清晰的看出，Tris-酚抽法提取大頭典竹相比于TCA丙酮法蛋白斑點(diǎn)明顯增多。根據(jù)相似相溶原理，酚抽法能溶解大部分水溶性蛋白，提出的蛋白純度較高[9]。該方法在處理含大量干擾物質(zhì)的植物樣品中非常有效。經(jīng)PDQUEST8.0.1軟件檢測(cè)，酚抽法提取大頭典竹蛋白得到401個(gè)蛋白斑點(diǎn)。三氯乙酸-丙酮法與酚抽結(jié)合法得到的蛋白斑點(diǎn)為647個(gè)，蛋白斑點(diǎn)多而均勻。該方法有效地降低了提取蛋白中的雜質(zhì)，提高了蛋白的獲取數(shù)量。因此，三氯乙酸-丙酮法和酚抽結(jié)合法更適合大頭典竹蛋白的提取。

2.2 不同IPG膠條水化方式的比較 雙向電泳的技術(shù)優(yōu)化目的是為了更好地分離蛋白點(diǎn)，得到較為清晰的凝膠圖像。而膠條的水化和運(yùn)行方式會(huì)直接影響到蛋白水化液上樣的均勻程度，進(jìn)而影響蛋白的上樣結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)采用膠面向上和膠面向下兩種等電聚焦模式，并以主動(dòng)水化和被動(dòng)水化兩種運(yùn)行方式作比較，優(yōu)化出最適合大頭典竹蛋白上樣的方式。

經(jīng)軟件pdquest8.0.1檢測(cè)，膠面向下被動(dòng)水化（圖3-A）、膠面向上被動(dòng)水化（圖3-B）、膠面向下主動(dòng)水化（圖3-C）的蛋白點(diǎn)數(shù)分別為647個(gè)、718個(gè)、362個(gè)。從圖片也可以明顯地看出，膠面向上聚焦方式（圖3-B）相比于膠面向下聚焦方式（圖3-A），蛋白斑點(diǎn)更多且更清晰。在第一向電泳IEF聚焦過(guò)程中，膠面向上聚焦方式能減少膠條在聚焦時(shí)氣泡的產(chǎn)生。因此，在膠條的運(yùn)行方式上，選擇膠條膠面向上的等電聚焦方式更加適合大頭典竹蛋白組學(xué)的研究。

對(duì)比于膠面向上被動(dòng)水化（圖3-B）和主動(dòng)水化（圖3-C）的運(yùn)行方式，主動(dòng)水化的蛋白點(diǎn)明顯少于被動(dòng)水化方式的蛋白點(diǎn)。主動(dòng)水化蛋白點(diǎn)丟失嚴(yán)重，經(jīng)檢測(cè)蛋白點(diǎn)數(shù)只有362個(gè)。選用膠面向上被動(dòng)水化的運(yùn)行方式分離效果最佳，得到更加清晰的蛋白點(diǎn)。因此，我們選用膠面向上被動(dòng)水化的運(yùn)行方式進(jìn)行蛋白組學(xué)雙向電泳技術(shù)優(yōu)化的進(jìn)一步研究的手段。經(jīng)驗(yàn)證，IPG膠條膠面向上、主動(dòng)水化的效果最優(yōu)的結(jié)果與丁鵬[10]研究的結(jié)果保持一致。

2.3 等電聚焦（IGE）程序的確定 為了得到最佳的雙向電泳結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)對(duì)電泳聚焦程序進(jìn)行了優(yōu)化。參照BIO-RAD雙向電泳默認(rèn)的2-DE程序，采取多種參數(shù)組合方式設(shè)置了5個(gè)不同聚焦參數(shù)的程序設(shè)置，詳見(jiàn)表1。

3 結(jié)論與討論

要獲得純度濃度較高的大頭典竹葉片全蛋白，實(shí)驗(yàn)用了3種不同全蛋白提取方法，TCA/丙酮法操作相對(duì)簡(jiǎn)易，得到的蛋白純濃度較低。酚是一個(gè)很好的蛋白質(zhì)溶劑，SDS-酚抽法不僅提高大頭典竹葉片的蛋白提取效率，而且能得到純凈度較高的蛋白質(zhì)；IPG膠條膠面向上的65 000hv的聚焦方式得到的較好的凝膠圖譜，等點(diǎn)聚集程序聚焦時(shí)間不充分或是過(guò)度聚焦，凝聚圖譜都有可能產(chǎn)生橫條紋和縱條紋，不利于后續(xù)軟件匹配分析；大頭典竹的蛋白點(diǎn)主要分布在pH4.5～8.5，選擇pH5～8的膠條，低分度蛋白主要集中在pH8附近，選擇pH5～8的膠條更有利大頭典竹蛋白點(diǎn)的分析；50μL的蛋白上樣量凝膠蛋白點(diǎn)均勻、清晰。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大頭典竹葉片蛋白的雙向電泳的優(yōu)化體系，旨在獲得蛋白丟失較少，蛋白斑點(diǎn)均勻、清晰凝膠圖譜，為大頭典竹蛋白組學(xué)的深入研究奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1]林愛(ài)玉，涂志華，上官保國(guó)，等.沿海沙地引種竹子和木麻黃固沙功能比較研究[J].福建林學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，01：28-33.

[2]張梅.濱海沙地竹林生態(tài)系統(tǒng)特性的研究[D].福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2004.

[3]Wasinger VC，Cordwell S，J，Cerpa}'oljak A，et al. Progress with gene-product mapping of the Mollicutes：Mycoplasma gerritaliuua[J].L，lectro-phoresis，1995，16：1090-094.

[4]Zivy M，Devienne D.Proteomics：a link between genomics，genetics and physiology[J].Plant Mol Biol，2000，44：75-80.

[5]Canovas F M，Dumas-Gaudot E，Recorbet G，Et al.Plant nroteome analysis[J].Proteomics，2004，4：285-298.

[6]Shaw M M，Riederer B M. Sample preparation for two-dimensional gel electrophoresis[J].Proteomics，2003，3（8）：1408-1417.

[7]陳晶瑜，郭寶峰，何付麗，等.適合雙向電泳的植物全蛋白提取方法比較[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，26（23）：97-100.

[8]Damerval C，Vienne D D，Zivy M，et al.Technical improvement in two-dimensional electrophoresis increase the level of genetic variation detected in wheat-seedling protein[J].Research Gate，1986，7（1）：52-54.

[9]陳晶瑜，郭寶峰，何付麗，等.適合雙向電泳的植物全蛋白提取方法比較[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，26（23）：97-100.

[10]丁鵬.不同鹽度脅迫下綠竹差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D].福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2015.

[11]Wang X N，Zhuo-Fuli L I.Optimization of Two Dimensional Electrophoresis System of Proteins in the Seedling Rhizom in Wheat[J].China Biotechnology，2008，28（12）：66-71.

（責(zé)編：張宏民）