廣藿香葉片總蛋白雙向電泳體系的建立

何麗平+吳友根+張軍鋒+胡新文

摘要： 比較2種方法提取廣藿香葉片總蛋白質(zhì)的得率與聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）蛋白條帶，同時(shí)對(duì)廣藿香葉片總蛋白質(zhì)雙向電泳條件進(jìn)行了優(yōu)化，利用MALDI-TOF-TOF和Swiss-Prot軟件對(duì)部分蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。結(jié)果表明：使用TCA/丙酮法提取廣藿香葉片總蛋白，在10萬Vhs聚焦強(qiáng)度下，可獲得高分辨率雙向電泳圖譜，BPP酚抽法獲得的蛋白不適用于雙向電泳分析；經(jīng)質(zhì)譜成功鑒定了9個(gè)蛋白點(diǎn)，鑒定成功率90%。

關(guān)鍵詞： 廣藿香；葉片；雙向電泳；蛋白質(zhì)提取

中圖分類號(hào)： S567.23+9.01 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2016）03-0306-04

廣藿香[Pogostemon cablin （Blanco） Benth.]為唇形科刺蕊草屬植物，是我國常用中藥，具有芳香化濁、開胃止嘔、發(fā)表解暑等功效[1]，是著名國家中藥保護(hù)品種藿香正氣丸（膠囊、水）和抗病毒口服液的重要原料，也是其他30多種中成藥的主要原料[2]。但是廣藿香連作障礙現(xiàn)象十分突出，造成產(chǎn)量和品質(zhì)明顯下降，每茬收獲后必須間種其他農(nóng)作物后方可再種，嚴(yán)重影響了廣藿香規(guī)范化生產(chǎn)與種植、藥農(nóng)種植積極性和區(qū)域經(jīng)濟(jì)發(fā)展，從而難以保障廣藿香藥材的質(zhì)量及其標(biāo)準(zhǔn)化、現(xiàn)代化的實(shí)施。據(jù)報(bào)道，廣藿香連作障礙的原因可歸結(jié)為根系分泌物質(zhì)的自毒作用[3]和根際微生物群落多樣性變化[4]，但無論何種機(jī)制，連作障礙現(xiàn)象都最終在廣藿香植株上表現(xiàn)出來。近年來，隨著現(xiàn)代系統(tǒng)生物學(xué)的快速發(fā)展，差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)逐漸成為研究連作障礙機(jī)理的有力工具，其中蛋白質(zhì)雙向電泳（2-DE）圖譜的建立是進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析的前提和基礎(chǔ)，而蛋白樣品的制備則是雙向電泳技術(shù)的核心與關(guān)鍵。本研究比較不同的廣藿香葉片總蛋白提取與分離方法，旨在為廣藿香葉片差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析奠定基礎(chǔ)，進(jìn)而為揭示廣藿香連作障礙機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

廣藿香植物材料于2014年4月種植于海南大學(xué)園藝園林學(xué)院廣藿香種質(zhì)資源圃。當(dāng)年11月采集植株葉片，液氮速凍保存，用于總蛋白質(zhì)提取。

1.2 試劑

三氯乙酸（TCA）、尿素（urea）、硫脲（thiourea）、3-[（3-膽酰胺丙基）-二乙胺]-丙硫酸（CHAPS）、十二烷基磺酸鈉（SDS）、二硫蘇糖醇（DTT）、硫酸銨、考馬斯亮藍(lán)G-250，購自美國Sigma公司。24 cm IPG膠條（pH值4～7）和瓊脂糖，購自瑞典GE Healthcare公司。丙烯酰胺（Acr）、甲叉雙丙烯酰胺（Bis）、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮（PVPP），購自美國Bio-Rad Labs公司。其他藥品均為國產(chǎn)分析純，購自北京化工廠。

1.3 方法

1.3.1 蛋白質(zhì)樣品的制備 分別稱取廣藿香葉片2份，每份1 g，分別放于預(yù)冷研缽中，加入適量PVPP，用液氮研磨至粉末，裝入離心管，-80 ℃冰箱中保存待用。廣藿香葉片總蛋白提取流程按照TCA/丙酮法、BPP（四硼酸鈉/交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮/苯酚Borax/PVPP/Phenol）酚抽法進(jìn)行。

1.3.1.1 TCA/丙酮法 參照Wang等提取頑拗植物組織蛋白的方法[5]，并略有改動(dòng)。將1 g材料粉末加入10 mL預(yù)冷的含10%TCA、0.07%巰基乙醇的丙酮中，充分混勻后，-20 ℃沉淀過夜，4 ℃、15 000 g離心30 min，棄上清液。加入10 mL 預(yù)冷的含0.07 %巰基乙醇的丙酮，混勻后-20 ℃放置1 h，4 ℃、15 000 g離心30 min，棄上清液。以上步驟重復(fù)2次。將沉淀用甲醇洗滌2次，丙酮洗滌2次，室溫干燥后溶解于蛋白裂解液（7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，2%CHAPS，13 mmol/L DTT）中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.2 BPP酚抽法 采用BPP法[6]提取蛋白質(zhì)。1 g材料粉末中加入5 mL BPP蛋白提取液[100 mmol/L EDTA，10 mmol/L Tris，50 mmol/L硼砂，50 mmol/L維生素C，1%PVPP（W ∶ V），1%Triton-100（V ∶ V），2% 2-巰基乙醇（V ∶ V）、30%蔗糖（W ∶ V），pH值 8.0]。在室溫下渦旋混勻10 min，再加入等體積的Tris飽和酚（pH值>7.8）。室溫渦旋10 min，4 ℃、15 000 g離心 15 min。轉(zhuǎn)移上層酚相至另一個(gè)新離心管，加入等體積蛋白提取液，室溫渦旋5 min，4 ℃、15 000 g離心15 min。吸取上層清液轉(zhuǎn)入另一個(gè)新離心管，并加入5倍體積冰冷的過飽和硫酸銨甲醇溶液，混勻后在-20 ℃沉淀6 h以上。4 ℃、15 000 g離心15 min，去除上清液，收集沉淀。將沉淀用甲醇洗滌2次，丙酮洗滌2次，室溫干燥后溶解于蛋白裂解液（7 mol/L 尿素，2 mol/L硫脲，2%CHAPS，13 mmol/L DTT）中，-20 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 蛋白定量 蛋白質(zhì)定量主要參考Bradford的方法[7]，在紫外分光光度計(jì)上進(jìn)行蛋白濃度測定，用牛血清蛋白（BSA）作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定樣品在波長 595 nm處的吸光度，每個(gè)樣品至少重復(fù)3次，計(jì)算樣品蛋白濃度。

1.3.3 聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳

1.3.3.1 一維凝膠電泳（1-DE） 1-DE主要采用不連續(xù)膠SDS-PAGE法[8]，用4%濃縮膠和12.5%分離膠進(jìn)行電泳分離，蛋白梯度上樣分別為10、20、30 μg，電泳參數(shù)設(shè)置為 5 W/gel 50 min，7 W/gel 2 h。

1.3.3.2 二維凝膠電泳（2-DE） 第1向等電點(diǎn)聚焦在Ettan IPGphorⅡ等電聚焦儀（GE Healthcare）上完成。使用24 cm的pH值4～7線性IPG（GE Healthcare）干膠條，每根膠條上樣量為1 300 mg蛋白，上樣體積455 μL，常溫水化18 h，每根膠條上覆蓋5 mL礦物油防止樣品揮發(fā)。采用2種聚焦程序，設(shè)定為：250 V，3 h；500 V，2 h；1 kV，1 h；8 kV，3 h；8 kV下進(jìn)行10萬 Volt hour（Vhs）和11萬 Vhs聚焦，每根膠條限流50 μA。第2向電泳前進(jìn)行膠條平衡，將聚焦好的膠條放入平衡緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 值8.8，6 mol/L尿素，30%甘油，2%SDS，0.02%溴酚藍(lán)）中平衡，先后浸泡在1%DTT的膠條平衡液和含4%碘乙酰胺的膠條平衡液中，各15 min。平衡結(jié)束后，轉(zhuǎn)移膠條垂直放于12.5%聚丙烯酰胺凝膠的上端，用含有適量溴酚藍(lán)的1%瓊脂糖封住膠條，保證膠條與凝膠充分接觸，在Ettan Daltsix電泳儀（GE Healthcare）中進(jìn)行電泳，電泳參數(shù)設(shè)置為5W/gel 1 h，7 W/gel 3.5 h。

1.3.4 凝膠染色及圖像采集分析 凝膠染色主要采用考馬斯亮藍(lán)（G-250）染色液進(jìn)行染色[9]。脫色干凈的凝膠采用Image ScannerⅢ掃描儀（GE Healthcare）進(jìn)行掃描，掃描設(shè)置為灰階256，投射掃描，分辨率為300 dpi，圖像以TIF格式保存，用ImageMaster 2D Platinum軟件（Amersham Bioscience）進(jìn)行圖像分析。

1.3.5 蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定 挖取感興趣的蛋白點(diǎn)，使用簡化膠內(nèi)酶解法進(jìn)行酶解[10]。酶解得到的肽段混合物質(zhì)譜鑒定（MALDI-TOF MS）采用AB SCIEX公司的基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（5800 MALDI-TOFMS/MS）。將獲得的胰蛋白酶解肽段信息通過Mascot引擎搜索NCBI中的綠色植物數(shù)據(jù)庫，獲得蛋白鑒定信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法獲得的總蛋白量及SDS-PAGE電泳單向條帶比較

由圖1-a可知，采用TCA/丙酮法可從1 g廣藿香葉片材料中提取4.61 mg蛋白，采用BPP酚抽法可以得到7.79 mg蛋白。利用2種方法提取所得的廣藿香葉片總蛋白SDA-PAGE電泳條帶見圖1-b。結(jié)果表明，采用梯度上樣量10、20、30 μg蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，TCA/丙酮法與BPP酚抽法提取的蛋白質(zhì)條帶數(shù)量差別不大，但在條帶清晰度上有較大差異。TCA/丙酮法所得蛋白產(chǎn)量低于BPP酚抽法所得蛋白產(chǎn)量，但是其電泳條帶清晰；而BPP酚抽法在30～42 ku 處以及52～75 ku處條帶較為模糊。說明BPP酚抽法所提取的蛋白質(zhì)純度不夠，含有干擾物質(zhì)等雜質(zhì)，可直接影響其蛋白定量和SDS-PAGE電泳過程。

2.2 廣藿香葉片蛋白的2-DE分析

如圖2所示，利用BPP酚抽法得到的樣品蛋白2-DE圖譜中蛋白點(diǎn)數(shù)量較少（183個(gè)），形狀不圓滑，橫條紋、縱條紋也較多，說明該方法得到的樣品中確實(shí)有大量干擾物質(zhì)存在，與SDS-PAGE電泳蛋白條帶反映的結(jié)果一致。所以，盡管通過BPP酚抽法得到的樣品蛋白量較多，但因其質(zhì)量無法滿足雙向電泳的要求，不能用于廣藿香葉片蛋白質(zhì)組學(xué)分析。TCA/丙酮法得到的2-DE圖譜中蛋白點(diǎn)數(shù)量較多（579個(gè)），形狀多數(shù)圓滑，尤其集中在pH值5～6范圍內(nèi)。TCA/丙酮法所得圖譜分辨率比BPP酚抽法好，可見TCA/丙酮提取法可減少廣藿香葉片總蛋白質(zhì)在提取過程中的蛋白質(zhì)損失，有效去除廣藿香葉片中次生代謝物質(zhì)等雜質(zhì)，表現(xiàn)為所獲得電泳圖譜中蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)量多，蛋白點(diǎn)清晰，無拖尾現(xiàn)象。

對(duì)TCA/丙酮法所得總蛋白進(jìn)行不同聚焦強(qiáng)度比較，由圖3可以看出，聚焦10萬Vhs條件下，中高分子量處蛋白點(diǎn)的聚焦情況有明顯改善，蛋白點(diǎn)的分離效果相對(duì)較好，蛋白點(diǎn)數(shù)明顯多于聚焦11萬Vhs，這可能與聚焦過度引起部分蛋白點(diǎn)丟失有關(guān)。

2.3 質(zhì)譜鑒定與功能分析

對(duì)利用TCA/丙酮法獲得的10個(gè)高分辨率蛋白點(diǎn)（圖4）進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，其中9個(gè)蛋白點(diǎn)被成功鑒定（蛋白得分>49），鑒定成功率90%（表1），表明該方法所得蛋白點(diǎn)具有良好的質(zhì)譜兼容性。蛋白點(diǎn)1為熱激蛋白70，是熱激蛋白家族的一員，在細(xì)胞內(nèi)主要參與新生肽的折疊與成熟、損傷蛋白的降解和蛋白運(yùn)輸。蛋白點(diǎn)3為預(yù)測蛋白——谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶 L3狀 X1異構(gòu)亞型，是谷胱甘肽代謝的膜相關(guān)蛋白，在植物的初級(jí)代謝和二級(jí)代謝、脅迫耐受和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中行使功能，從而影響植物生長發(fā)育。蛋白點(diǎn)5為預(yù)測蛋白——二氫硫辛酸脫氫酶，它以FAD為輔基，是參與丙酮酸形成乙酰-CoA以及α -酮戊二酸脫氫形成琥珀酰-CoA過程中多酶體系的一種酶。蛋白點(diǎn)10為光合系統(tǒng)Ⅰ反應(yīng)中心第4單元葉綠體蛋白，其功能是穩(wěn)定PsaC與光合反應(yīng)中心之間的相互作用，協(xié)助鐵氧還原蛋白與光合系統(tǒng)的對(duì)接，與鐵氧還原蛋白——NADP還原酶互作。

3 結(jié)論與討論

樣品制備是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要因素，樣品質(zhì)量好壞直接決定電泳圖譜進(jìn)行軟件分析的結(jié)果。最優(yōu)的樣品制備方法應(yīng)該能有效除去影響蛋白質(zhì)可溶性和電泳分離結(jié)果的各種雜質(zhì)，防止蛋白變性，保持其活性，減少蛋白質(zhì)的降解、磷酸化和甲基化修飾，并有高的分辨率和良好的重復(fù)性。

然而廣藿香葉片組織中含有大量揮發(fā)油、黃酮類、倍半萜類、萜類、蒽醌類等次生代謝物[11-13]，這些不利因素將直接導(dǎo)致難以獲得無污染、無修飾、完整、高質(zhì)量的植物細(xì)胞蛋白質(zhì)，嚴(yán)重影響蛋白質(zhì)的提取效果、等電聚焦及雙向電泳圖譜的分辨率。TCA/丙酮法、BPP酚抽法是2種常用的蛋白質(zhì)提取方蛋白點(diǎn)7經(jīng)質(zhì)譜鑒定，未鑒定成功（蛋白得分小于49分）。匹配肽段數(shù)括號(hào)內(nèi)數(shù)值代表總匹配肽段數(shù)中可信值大于95%的肽段數(shù)。

法。TCA/丙酮法可有效沉淀蛋白[14]，能夠抑制蛋白酶活性，消除蛋白質(zhì)水解作用和其他蛋白酶的修飾作用，有效降低蛋白樣品中鹽、糖、脂類、核酸等雜質(zhì)對(duì)試驗(yàn)的干預(yù)[15]。BPP酚抽提法雖然被廣泛應(yīng)用于植物組織蛋白質(zhì)提取，但對(duì)于廣藿香葉片材料并不適用。在影響等電聚焦的因素中，等電聚焦強(qiáng)度對(duì)獲得理想的2-DE圖譜至關(guān)重要[16]。不同植物甚至同一植物不同組織的蛋白樣品分離所需的等電聚焦強(qiáng)度不同，同一樣品不同膠條長度所需的等電聚焦強(qiáng)度也有差別。本研究使用的膠條長24 cm，承載的蛋白量多，聚焦充分，蛋白點(diǎn)分離效果好，便于進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。比較不同聚焦強(qiáng)度下的廣藿香葉片蛋白的2-DE圖譜后，發(fā)現(xiàn)在10萬Vhs聚焦強(qiáng)度下，蛋白點(diǎn)最多，可達(dá)613個(gè)蛋白點(diǎn)，且分離效果好。從2-DE凝膠選取的10個(gè)蛋白點(diǎn)中鑒定出9個(gè)蛋白點(diǎn)，這些蛋白質(zhì)參與光合反應(yīng)、代謝及能量代謝，表明使用TCA/丙酮法提取廣藿香葉片總蛋白，聚焦強(qiáng)度為10萬Vhs時(shí)，不僅能得到理想的2-DE圖譜，而且分離的蛋白點(diǎn)具有良好的質(zhì)譜兼容性。本研究為廣藿香葉片蛋白質(zhì)組學(xué)研究奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，也為其他中藥材的葉片總蛋白提取提供了依據(jù)。

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