雙向電泳中不同樣品裂解液對水稻葉片疏水蛋白溶解效果比較

王琳+范云峰+粱建生

摘要：為更好地溶解水稻葉片疏水蛋白，比較4種常用裂解液{分別含有4% 3-[（3-膽酰胺丙基）二甲胺]-1-丙磺酸（CHAPS）、2% CHAPS+2% SB3-10、4% ASB-14、4% TritonX-100去垢劑}配方對水稻葉片疏水蛋白溶解性的影響。結(jié)果表明，含有4% CHAPS去垢劑的裂解液對水稻葉片疏水蛋白的溶解效果最佳。

關(guān)鍵詞：雙向電泳；裂解液；疏水蛋白；溶解效果

中圖分類號： S188；S511.01 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）18-0054-02

收稿日期：2017-3-23

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號：31271622）；揚(yáng)州大學(xué)科技創(chuàng)新培育基金（編號：2016CXJ087）。

作者簡介：王 琳（1978—），女，江蘇徐州人，博士，講師，主要從事植物生理和生化研究。E-mail：wanglin@yzu.edu.cn。

通信作者：梁建生，博士，教授，主要從事植物逆境生理與分子生物學(xué)研究。Tel：（0514）87979054；E-mail：jssliang@163.com。 雙向電泳（2-DE）中樣品裂解液發(fā)展最大的限制來源于既要盡可能充分地溶解樣品，又要保證不影響等電聚焦（isoelectric-focusing，簡稱IEF）。對于膜蛋白，用脲和硫脲組合作為離液劑已成共識[1-5]，所以選擇恰當(dāng)?shù)娜ス竸┦歉倪M(jìn)裂解液配方的突破口。去垢劑主要有離子型、非離子型和兼性離子型3類。離子型去垢劑一般不用于IEF，以十二烷基硫酸鈉（SDS）為代表。傳統(tǒng)的非離子型去垢劑多以聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）和脂肪醇聚氧乙烯醚（NP-40）為代表，兼性離子型以3-[（3-膽酰胺丙基）二甲胺]-1-丙磺酸（CHAPS）為代表。CHAPS有較強(qiáng)的溶解疏水蛋白的能力，現(xiàn)在較為常用。此外，一些新的兼性離子去垢劑如SB3-10、氨基磺酸甜菜堿-14（ASB-14）也越來越多地被應(yīng)用到2-DE中。有研究認(rèn)為，SB3-10、ASB-14溶解膜蛋白的效果更好一些[6]。另外有研究發(fā)現(xiàn)，ASB-14溶解膜蛋白的效果優(yōu)于SB3-10和CHAPS的組合[7]。但對于水稻葉片疏水蛋白的溶解效果，哪種去垢劑最好，目前的研究還沒有確定的答案。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以水稻品種日本晴（Oryza sativa L. cv. Nipponbare）為試驗(yàn)材料。

1.2 試劑

雙向電泳系統(tǒng)（Bio-RAD）、線性固相pH梯度（immobilize pH gradients，簡稱IPG）預(yù)制膠條（Bio-RAD），IPG緩沖液、覆蓋液、3-[（3-膽酰胺丙基）二甲胺]-1-丙磺酸購自Amersham pharmacia公司；尿素、四甲基乙二胺（TEMED）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、二硫蘇糖醇（dethilthreitol，簡稱DTT）、甘氨酸、過硫酸銨、甲叉雙丙烯酰胺均購自Amresco公司；其他常用試劑為國產(chǎn)分析純；所有溶液和緩沖液均使用MilliQ系統(tǒng)提供的電阻不小18.2 MΩ的去離子水。

1.3 水稻葉片疏水蛋白的制備、沉淀與保存

取水稻鮮葉約10 g，凍干，用粉碎機(jī)粉碎凍干葉片，篩出葉片粉末，加入40 mmol/L Tris-HCl（pH值8.4），振蕩 10 min，超聲波處理1 min，4 ℃、21 697 r/min離心1 h，取上清，留沉淀，反復(fù)多次，直至Bradford法測得的上清液蛋白質(zhì)濃度為0，最終沉淀中所含的蛋白質(zhì)即為水稻葉片的疏水蛋白，將沉淀真空凍干，于-78 ℃保存。

在水稻葉片疏水蛋白凍干粉中加入250 μL 4種不同的裂解液A（含7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4% CHAPS）、裂解液B（含7 mol/L尿素，2 mol/L 硫脲，2% CHAPS和2% SB3-10）、裂解液C（含7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4% ASB-14）和裂解液D（含 7 mol/L 尿素，2 mol/L硫脲，4% TritonX-100），30 ℃水浴 1 h，其間充分振蕩，超聲波處理3次（50 s/次），20 ℃、14 953 r/min 離心15 min，取上清，用Bradford法測上清液的蛋白質(zhì)濃度。

1.4 雙向電泳

配制含150 μg蛋白質(zhì)的水化液，重水化pH值4～7的IPG膠條，等電聚焦35 000 Vh。平衡膠條。將膠條移至二向12.5%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）膠上，進(jìn)行二向電泳，電泳結(jié)束后剝膠，銀染法染色顯示蛋白質(zhì)點(diǎn)[8]。掃描儀掃描雙向電泳凝膠圖并進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

目前針對膜蛋白質(zhì)的溶解有多種方法，在不同情況下其溶解效果不同，但在特定情況下卻各有優(yōu)勢。在2-DE中，對膜蛋白的溶解用脲和硫脲的組合作為離液劑已成共識，所以各種膜蛋白質(zhì)裂解液的最大不同來自于對不同的非離子型或兼性離子型去垢劑的使用。本試驗(yàn)比較了目前在2-DE膜蛋白質(zhì)溶解中應(yīng)用較為普遍的4種裂解液[9-12]的蛋白溶解效果。

從圖1可以看出，雖然是相同的上樣量 100 μg，但是A、B、C、D 4種裂解液的結(jié)果卻是有差別的。A和B要好于C和D，因?yàn)锳和B的2-DE圖譜上有更多蛋白質(zhì)點(diǎn)（接近1 500個），C和D只有1 200個左右的蛋白質(zhì)點(diǎn)。在本試驗(yàn)中 ASB-14會使分子量較低的蛋白質(zhì)在酸性端模糊難辨（圖1-C的Ⅰ區(qū)域）。這種結(jié)果不但使2-DE的覆蓋率大大降低，而且會影響到2-DE的重復(fù)性，從而增大了變異系數(shù)和分析難度，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。圖1-D的區(qū)域Ⅱ、Ⅲ與圖1-A和圖1-B中的相同區(qū)域相比，不但蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)少，而且相同蛋白質(zhì)的灰度值也不及圖1-A和圖1-B，但是圖1-D的這2個區(qū)域與圖1-C相比，結(jié)果較好。因此認(rèn)為在2-DE中，用裂解液A和B溶解水稻葉片的疏水蛋白的效果要好于D，D的效果優(yōu)于C。endprint

2-DE是全面分析蛋白質(zhì)的技術(shù)，比較A和B，雖然兩者都有高效溶解蛋白質(zhì)的能力，但是兩者對特定蛋白質(zhì)的溶解能力卻是不同的。在圖1-A、圖1-B中示意了對應(yīng)的區(qū)域1、2、3和4，在這些區(qū)域中可以發(fā)現(xiàn)A和B的溶解效力還是有細(xì)微差異的。如在區(qū)域1和4，A要優(yōu)于B；在區(qū)域3，B要優(yōu)于A；在區(qū)域2，兩者各自溶解了不同的蛋白質(zhì)?？偟膩碚f，含有4%CHAPS去垢劑的裂解液對水稻葉片疏水蛋白的溶解效果最佳。

3 討論與結(jié)論

目前有研究認(rèn)為SB3-10、ASB-14溶解膜蛋白的效果較好[6]，而ASB-14的溶解能力相對于SB3-10/CHAPS則更強(qiáng)[7]。本試驗(yàn)通過比較了幾種常用的裂解液對水稻葉片疏水蛋白的溶解效果后發(fā)現(xiàn)，CHAPS（4%）的溶解效果最好，CHAPS（2%）和SB3-10（2%）的組合次之，TritonX-100（4%）溶解效果較差，而ASB-14（4%）由于易造成酸性端低分子量區(qū)域模糊，因此效果最差。

參考文獻(xiàn)：

[1]Pasquali C，F(xiàn)ialka I，Huber L A. Preparative two-dimensional gel electrophoresis of membrane proteins[J]. Electrophoresis，1997，18（14）：2573-2581.

[2]Rabilloud T，Adessi C，Giraudel A，et al. Improvement of the solubilization of proteins in two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients[J]. Electrophoresis，1997，18（3/4）：307-316.

[3]Rabilloud T. Use of thiourea to increase the solubility of membrane proteins in two-dimensional electrophoresis[J]. Electrophoresis，1998，19（5）：758-760.

[4]Molloy M P，Herbert B R，Walsh B J，et al. Extraction of membrane proteins by differential solubilization for separation using two-dimensional gel electrophoresis[J]. Electrophoresis，1998，19（5）：837-844.

[5]Musante L，Candiano G，Ghiggeri G M. Resolution of fibronectin and other uncharacterized proteins by two-dimensional polyacrylamide electrophoresis with thiourea[J]. Journal of Chromatography. B，Biomedical Sciences and Applications，1998，705（2）：351-356.

[6]Chevallet M，Santoni V，Poinas A，et al. New zwitterionic detergents improve the analysis of membrane proteins by two-dimensional electrophoresis[J]. Electrophoresis，1998，19（11）：1901-1909.

[7]Molloy M P，Herbert B R，Williams K L，et al. Extraction of escherichia coli proteins with organic solvents prior to two-dimensional electrophoresis[J]. Electrophoresis，1999，20（4/5）：

701-704.

[8]Yan J X，Wait R，Berkelman T，et al. A modified silver staining protocol for visualization of proteins compatible with matrix-assisted laser desorption/ionization and electrospray ionization-mass spectrometry[J]. Electrophoresis，2000，21（17）：3666-3672.

[9]O Farrell P H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins[J]. Journal of Biological Chemistry，1975，250：4007-4021.

[10]Perdew G H，Schaup H W，Selivonchick D P. The use of a zwitterionic detergent in two-dimensional gel electrophoresis of trout liver microsomes[J]. Analytical Biochemistry，1983，135（2）：453-455.

[11]Rabilloud T，Blisnick T，Heller M，et al. Analysis of membrane proteins by two-dimensional electrophoresis：comparison of the proteins extracted from normal or Plasmodium falciparum-infected erythrocyte ghosts[J]. Electrophoresis，1999，20（18）：3603-3610.

[12]Santoni V，Molloy M，Rabilloud T. Membrane proteins and proteomics：un amour impossible？[J]. Electrophoresis，2000，21（6）：1054-1070.郭 芳，劉海鵬，李保國，等. 應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化紅樹莓組培苗增殖培養(yǎng)條件[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（18）：56-59.endprint