不同生長年限園參根的雙向電泳分析

麻銳++馮凱++姜銳++陳偉++靳雯棋++徐曉浩++畢英飛++孫立偉

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.019

摘要：為了解園參根在生長過程中的蛋白質(zhì)組學(xué)變化，利用雙向電泳技術(shù)分離1～5年園參根蛋白，重點(diǎn)分析園參根生長（3年）、成熟（5年）之間的蛋白質(zhì)組學(xué)差異，并利用MALDI-TOF/TOF鑒定差異顯著的81個蛋白點(diǎn)。結(jié)果表明：有19個差異蛋白點(diǎn)在成熟期表達(dá)量下調(diào)，62個蛋白點(diǎn)表達(dá)量上調(diào)，針對其與園參根生長發(fā)育的潛在關(guān)系進(jìn)行分類與討論；園參根在逐漸成熟的過程中與抗脅迫相關(guān)的過氧化氫酶、單脫氫抗壞血酸還原酶等，以及與能量代謝相關(guān)的ATP酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶等表達(dá)量增加，而與生長相關(guān)的果膠酯酶表達(dá)量減少，這些蛋白質(zhì)的變化對于探討人參根的生長發(fā)育規(guī)律有重要意義。

關(guān)鍵詞：園參；生長年限；雙向電泳；蛋白質(zhì)組學(xué)

中圖分類號：S567.5+10.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：1002-1302（2016）10-0084-04

收稿日期：2015-09-02

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號：81373932）；吉林省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目[編號：吉教科合字（2014）第193號]；吉林省科技計(jì)劃（編號：20150520138JH、20130522045JH、20140519016JH、YYZX201268）。

作者簡介：麻銳（1982—），女，吉林吉林人，博士，講師，主要從事人參蛋白質(zhì)組學(xué)研究。E-mail：maruijilin@163.com。

通信作者：馮凱，碩士，講師，主要從事植物生物科學(xué)研究。E-mail：fengk544@163.com。人參（Panax ginseng C A May，Araliaceae）為五加科多年生草本植物，其根部作為補(bǔ)氣圣品，有悠久的藥用歷史。人參的品質(zhì)多受其生長年限的影響，需要生長5年以上才可收獲藥用。研究表明，人參根中含有多種皂苷、揮發(fā)油、多糖、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、促進(jìn)大腦對能量物質(zhì)的利用、改善心臟功能、降低血糖、增強(qiáng)人體免疫力、抗腫瘤等作用[1]，并且這些物質(zhì)含量會隨著參齡的增長而遞增，進(jìn)入成熟期（5年）后趨于穩(wěn)定[2-3]。也就是說，進(jìn)入成熟期的人參質(zhì)量好，藥效價值顯著，并且在這過程中的生理生化轉(zhuǎn)變皆可由基因調(diào)控的蛋白質(zhì)差異表達(dá)而得以反映。因此，研究人參根生長期與成熟期的蛋白質(zhì)組學(xué)變化對于揭示人參生長發(fā)育特性有重要意義。

近年來，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的快速發(fā)展，高通量、高靈敏度的雙向電泳和質(zhì)譜等蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已經(jīng)可以快速鑒定上千種蛋白質(zhì)，為監(jiān)測植物生長代謝過程中蛋白質(zhì)的動態(tài)變化提供了可能。本研究應(yīng)用比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，建立不同生長年限園參的蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜，分析其差異表達(dá)蛋白的功能，探討園參參根的生長發(fā)育規(guī)律，對認(rèn)識園參藥效形成有一定意義。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

75株試驗(yàn)樣品采自吉林省撫松縣露水河鎮(zhèn)，分別為1、2、3、4、5年生園參各15株。新鮮園參用超純水洗凈后，切成碎塊，用液氮研磨成精細(xì)粉末后存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2蛋白提取

園參根蛋白質(zhì)的提取方法采用改進(jìn)后的酚提法[4]。取0.2 g液氮研磨的園參根粉末，加入7倍體積、含0.07% β-巰基乙醇的丙酮溶液（-20 ℃預(yù)冷），-20 ℃靜置1 h后，于4 ℃、15 000 r/min離心15 min，棄上清，重復(fù)3次；將沉淀置于 4 ℃ ，待丙酮完全揮發(fā)后，加入4倍體積樣品裂解液{含 7 mol/L 尿素、2 mol/L硫脲、2% 3-[（3-單酰胺丙基）-二乙胺]-1-丙磺酸（CHAPS）、1%植物蛋白抑制劑}，旋渦混勻，100 W超聲40 min后，于15 000 r/min、4 ℃離心 15 min，收集蛋白上清液；加入等體積Tris-飽和酚（pH值=7.8）振蕩30 min，于4 ℃、10 000 r/min離心10 min，取中層、下層，加7倍體積含0.1 mol/L乙酸銨的甲醇溶液沉淀過夜，于4 ℃、15 000 r/min離心15 min，棄上清；沉淀用含 0.1 mol/L 乙酸銨的甲醇溶液洗滌2遍，再用預(yù)冷的丙酮洗滌3遍，將沉淀物干燥，于-80 ℃貯存。參照Bradford的方法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量[5]。

1.3雙向電泳（2-DE）

取1 000 μg蛋白，加入再水化液[含5 mol/L 尿素、2 mol/L 硫脲、2% CHAPS、2%磺基三甲基胺乙內(nèi)酯3-10（SB3-10）、0.65% pH值3～10固相pH值梯度緩沖液（IPG buffer）、0.35% pH值4～7固相pH值梯度緩沖液（IPG buffer）][6]至終體積450 μL。等電聚焦采用24 cm、pH值3～10預(yù)制干膠條（GE Healthcare），Ettan IPGPhorII等電聚焦儀（Amersham Biosciences）聚焦。聚焦程序：（1） 30 V 10 h；（2）200 V 2 h；（3）500 V 2 h；（4）1 000 V 2 h；（5）8 000 V 3 h；（6）8 000 V 72 000 V·h。等電聚焦完成后，將IPG膠條放入含有1%二硫蘇糖醇（DTT）平衡緩沖液[75 mmol/L Tris-HCl，pH值=8.8，6 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，30%甘油，2%十二烷基硫酸鈉（SDS），0.002%溴酚藍(lán)]中平衡15 min后，再將膠條置于含有2.5%碘乙酰胺的平衡緩沖液中平衡 15 min。最后采用12.5%聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）膠進(jìn)行雙向電泳。

1.4圖像掃描及分析

凝膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后，使用掃描儀（Amersham Biosciences）進(jìn)行圖像掃描，最后利用Image Master 2D Platinum Software Version 6.0（Amersham Biosciences）進(jìn)行處理、分析（包括蛋白點(diǎn)的檢測、匹配等），找出各樣品凝膠的差異點(diǎn)。在3次重復(fù)試驗(yàn)中確保差異點(diǎn)間體積變化均在1.5倍以上。

1.5蛋白質(zhì)的鑒定

挖取差異蛋白點(diǎn)，分別轉(zhuǎn)入0.5 mL Eppendorf離心管中，通過復(fù)旦大學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)室的4 700串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀[4700 Proteomies Analyzer （TOF/TOFTM） （Applied Biosystems，USA）]進(jìn)行MALDI-TOF-MS/MS鑒定，所得結(jié)果用GPS（Applied Biosystems，USA）-MASCOT（Matrix Science，UK）進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索。數(shù)據(jù)庫為NCBI綠色植物庫；檢索的方式為combined，即指紋圖譜和串級聯(lián)合檢索；最大允許漏切位點(diǎn)為1；酶為胰蛋白酶；質(zhì)量誤差范圍設(shè)置：PMF，0.3 u；MS/MS，0.4 u。匹配肽段數(shù)目大于2的蛋白將被接受。最后利用NCBI和SWISS-PROT數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白質(zhì)功能的查詢。

2結(jié)果與分析

2.1不同年份園參根的蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜

本研究利用雙向電泳技術(shù)，重點(diǎn)分析成熟期（5年）、生長期（3年）園參的根蛋白質(zhì)表達(dá)情況（圖1），每例樣品重復(fù)3張膠。本研究得到差異表達(dá)的81個蛋白點(diǎn)，它們在不同膠中的相對體積相差1.5倍以上。在5年園參根中有33個蛋白點(diǎn)（5T1～5T33）特異表達(dá)，29個蛋白點(diǎn)（5C1～5C29）表達(dá)量上調(diào)。3年園參根中有5個蛋白點(diǎn)（3T1～3T5）特異表達(dá)，14個蛋白點(diǎn)（3C1～3C14）表達(dá)量上調(diào)。

2.2差異表達(dá)蛋白的鑒定

研究表明，不同生長年限園參根的圖譜中蛋白質(zhì)豐度發(fā)生改變。其中低豐度蛋白表達(dá)不同，而中、高豐度蛋白點(diǎn)分布很相似。有趣的是，在不同年限園參根圖譜中，20～30 ku區(qū)域內(nèi)均有8個不同pI值的高豐度蛋白點(diǎn)，經(jīng)MALDI-TOF/TOF MS分析，為類核糖核酸酶儲存蛋白（表1）。據(jù)報(bào)道，此高豐度蛋白的含量也會隨著季節(jié)的變化而變化[7]，是一類人參生長儲存蛋白，為人參在自然環(huán)境中生存提供能量。

通過搜索NCBI綠色植物蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，從81個差異蛋白點(diǎn)中成功鑒定52個蛋白（鑒定率64.2%），鑒定結(jié)果見表1。

依據(jù)GO數(shù)據(jù)庫的描述，將成熟與生長期園參差異表達(dá)蛋白按其生物功能分為6類（圖2），其中與抗逆、能量代謝相關(guān)的蛋白在園參生長發(fā)育過程中表達(dá)差異明顯。

3結(jié)論與討論

蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法和技術(shù)的發(fā)展提供了一種從表達(dá)蛋白整體水平揭示生命活動規(guī)律的新策略和新思路，為認(rèn)識園參生長過程中蛋白質(zhì)組學(xué)的改變提供了強(qiáng)有力的研究手段。本研究通過比較不同生長年限園參根的差異表達(dá)蛋白，發(fā)現(xiàn)其中大多數(shù)蛋白質(zhì)是與抗氧化、抗脅迫及能量代謝相關(guān)的酶，這提示園參根由生長到成熟的轉(zhuǎn)變過程中導(dǎo)致抗脅迫、能量代謝相關(guān)途徑發(fā)生改變。

3.1抗脅迫相關(guān)蛋白

園參根長年埋于地下，是發(fā)生抗逆反應(yīng)的主要部位。為了對脅迫信號作出相應(yīng)的應(yīng)答，隨著參齡的增長，園參根內(nèi)發(fā)生一系列抗逆相關(guān)蛋白表達(dá)上調(diào)，以適應(yīng)不利的環(huán)境條件。差異表達(dá)中的過氧化氫酶（5T20～ST22） 在5年園參中特異表達(dá)。過氧化氫酶是生物體內(nèi)主要的抗氧化酶類，催化細(xì)胞內(nèi)過氧化氫的分解，從而使細(xì)胞免受過氧化氫的毒害[8]，保護(hù)人參免受氧化脅迫。此外還有一些抗逆相關(guān)蛋白表達(dá)上調(diào)，單脫氫抗壞血酸還原酶（5T15、5C22）在5年園參中也特異表達(dá)，它對于維生素C的再生具有重要作用[9]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合蛋白（5C35～5C37）屬于熱休克蛋白Hsp70亞家族，對于維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和防止細(xì)胞凋亡具有重要作用。在植物體內(nèi)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合蛋白可能通過調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的未折疊蛋白應(yīng)答、Ca2+信號反應(yīng)等調(diào)節(jié)植物的抗旱澇脅迫能力[10-11]。在本研究中還發(fā)現(xiàn)一些參與次生代謝相關(guān)的酶，它們的表達(dá)也會受到脅迫反應(yīng)的影響，如紫檀堿還原酶（5C17）、異黃酮還原酶（5C18）等在5年園參中表達(dá)量高于3年園參，提高了成熟園參的抗脅迫能力。更重要的是此類抗脅迫相關(guān)蛋白往往也具有藥效作用，如在腫瘤細(xì)胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合蛋白的產(chǎn)生與防止凋亡、免疫系統(tǒng)攻擊、抗腫瘤藥物耐藥性產(chǎn)生有關(guān)[12]。對此類蛋白的深入研究將為研究園參藥效形成機(jī)制提供理論依據(jù)。

3.2能量代謝相關(guān)蛋白

在成熟的園參根中不僅抗脅迫相關(guān)蛋白表達(dá)量上調(diào)，也伴隨著與能量代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)差異。植物在抗脅迫過程中體內(nèi)的代謝途徑會發(fā)生改變，與能量代謝相關(guān)的酶活性的提高可為有利于提高抗逆能力的物質(zhì)合成提供能量（NADPH2、ATP）。能量代謝與抗脅迫過程的關(guān)系密不可分。ATP酶（5C11、5C16）是一種功能性蛋白，在5年園參中表達(dá)量上調(diào)，它與各種膜體系和細(xì)胞器有著廣泛聯(lián)系，同時在能量代謝、物質(zhì)的吸收與運(yùn)輸?shù)壬砉δ苌暇哂兄匾饔?。研究表明，低溫脅迫會引起質(zhì)膜ATP酶含量和活性的提高，從而釋放出更多能量（以熱能形式為主）來抵御低溫的侵襲[13]。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（5T25、5C21）是糖酵解過程中的重要酶，參與糖酵解過程中第1個ATP的形成。近年來已發(fā)現(xiàn)，植物甘油醛-3-磷酸脫氫酶也可被鹽、旱、冷、熱、缺氧脅迫、缺鐵脅迫、植物激素、病菌侵染等多種環(huán)境脅迫所誘導(dǎo)表達(dá)，參與植物的抗脅迫反應(yīng)[14]。同時，在本研究中還有一些與能量代謝相關(guān)的酶如蘋果酸脫氫酶（5T15、5C22）、磷酸甘油酸變位酶（5T7）、稀醇酶（5C13、5C15）等在5年成熟園參中表達(dá)量較高。

3.3生長發(fā)育相關(guān)蛋白

在差異表達(dá)蛋白中果膠酯酶（3C8）在3年園參中表達(dá)量上調(diào)，它作為催化果膠的甲氧酯水解產(chǎn)生果膠酸和甲醇反應(yīng)的酶，普遍存在于高等植物的不同組織器官中，在細(xì)胞壁組成和降解、細(xì)胞游離、花粉發(fā)育、種子萌發(fā)、根尖延伸、種子開裂、果實(shí)軟化成熟、抗病等方面具有重要作用[15]。在根中，該酶與根邊緣細(xì)胞的啟動有密切的相關(guān)性，Wen等關(guān)于豌豆的試驗(yàn)表明：果膠酯酶基因表達(dá)與根邊緣細(xì)胞發(fā)育有密切的正相關(guān)性[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，果膠酯酶在園參生長階段的表達(dá)量要高于成熟園參，說明該酶在根的伸長過程中發(fā)揮著重要的生物學(xué)活性。

絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶（5T18）存在于成熟園參根中，而在快速生長期其含量極低或檢測不到。絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶在植物的一碳代謝和光呼吸中起著非常重要的作用。已有研究表明，在蘋果葉片中絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶參與光合作用，促進(jìn)葉片的生長，并且只存在于營養(yǎng)生長期的葉片中，而在幼年期的葉片和生殖生長期的葉片中含量極低或檢測不到[17]。成熟園參代謝能力增強(qiáng)，需要大量的一碳單位化合物用來合成多種產(chǎn)物，如DNA、RNA、輔酶、甲硫氨酸等，因此絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)量增高。由于絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶在植物中有多種重要而又普遍的生理功能，目前圍繞它的研究越來越多。

在園參生長發(fā)育的過程中，許多酶差異表達(dá)。在未來的研究中，以這些差異表達(dá)蛋白為研究對象，對認(rèn)識園參根的生長發(fā)育規(guī)律、有效利用人參資源有重要意義。

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