核酸適配體功能化的稀土上轉(zhuǎn)換納米材料在生物檢測中的應(yīng)用

劉 夢， 何 月， 劉昕雯， 袁 荃

(教育部生物醫(yī)學(xué)分析化學(xué)重點實驗室，武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430072)

1 前言

稀土上轉(zhuǎn)換納米材料是一種能夠吸收長波長光并發(fā)射出短波長光的發(fā)光材料，它能連續(xù)吸收兩個或多個低能量的光子，并通過系列非線性光學(xué)過程將其轉(zhuǎn)換成一個高能量光子輻射出來[1 - 2]。稀土上轉(zhuǎn)換納米材料具有光學(xué)穩(wěn)定性好、發(fā)射波長可調(diào)控、生物相容性好等優(yōu)點[3 - 5]，更重要的是其可以被近紅外光激發(fā)，能有效地抑制背景熒光的干擾，在生物分析檢測中得到廣泛應(yīng)用[6 - 8]。然而，單純的上轉(zhuǎn)換納米材料用作檢測時對目標(biāo)物沒有選擇性，因此將其與具有特異性識別功能的分子結(jié)合是實現(xiàn)對目標(biāo)物高選擇性檢測的關(guān)鍵[9 - 10]。

核酸適配體是具有選擇性識別功能的單鏈DNA或RNA序列[11 - 12]，它能夠與小分子、蛋白質(zhì)、核酸和細(xì)胞等靶標(biāo)物進(jìn)行高效、高特異性結(jié)合，被稱為“化學(xué)抗體”[13 - 15]。與抗體相比，核酸適配體具有設(shè)計靈活、易于化學(xué)合成和修飾、成本低廉、生物化學(xué)穩(wěn)定性高等優(yōu)點，在生物分析檢測等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[16 - 19]。將核酸適配體與稀土上轉(zhuǎn)換納米材料相結(jié)合，能夠發(fā)展一系列靈敏、高選擇性、高效、簡便的分析檢測平臺[20 - 22]。本文主要綜述了近幾年核酸適配體功能化的稀土上轉(zhuǎn)換納米材料在小分子、蛋白質(zhì)、核酸、病原微生物、細(xì)胞等生物分子檢測中的應(yīng)用，并展望了其在分析檢測領(lǐng)域的發(fā)展前景。

2 核酸適配體功能化的稀土上轉(zhuǎn)換納米材料在生物檢測中的應(yīng)用

2.1 小分子檢測

2.1.1ATPATP是各項生命活動所需能量的提供者，是生物體內(nèi)能量代謝和轉(zhuǎn)換的重要樞紐[23]，與細(xì)胞中的各種生命活動息息相關(guān)。ATP的檢測在疾病預(yù)防與診斷、食品分析等領(lǐng)域具有重要作用[24]。目前多個研究小組利用核酸適配體功能化的稀土上轉(zhuǎn)換納米材料實現(xiàn)了對ATP的檢測。Song等[25]將上轉(zhuǎn)換納米顆粒作為供體，羧基四甲基羅丹明(TAMRA)作為受體設(shè)計了核酸適配體生物傳感器，利用供受體之間的能量共振轉(zhuǎn)移實現(xiàn)了對ATP的檢測，檢測限為20 μmol/L。He等[26]基于SiO2包裹的上轉(zhuǎn)換納米顆粒和兩段核酸適配體片段構(gòu)建了一種高靈敏度的共振能量轉(zhuǎn)移體系，用于ATP的檢測，檢測限為1.70 μmol/L。為了進(jìn)一步提高檢測靈敏度，Liu[27]等采用氧化石墨烯作為能量受體，基于核酸適配體功能化上轉(zhuǎn)換納米材料和氧化石墨烯之間的能量共振轉(zhuǎn)移構(gòu)建了高靈敏度的生物傳感平臺，實現(xiàn)了對ATP的檢測，檢測限達(dá)到80 nmol/L。在這個設(shè)計中，核酸適配體與氧化石墨烯之間的吸附作用使NaYF4∶Yb,Er的上轉(zhuǎn)換發(fā)光幾乎全被猝滅，加入ATP后，核酸適配體與ATP結(jié)合從氧化石墨烯表面脫離，上轉(zhuǎn)換發(fā)光恢復(fù)，從而達(dá)到檢測ATP的目的。這些基于共振能量轉(zhuǎn)移的核酸適配體功能化上轉(zhuǎn)換納米探針實現(xiàn)了對ATP的快速、高特異性、高靈敏度檢測，能夠被應(yīng)用于細(xì)胞生命活動的研究和疾病診斷中。

2.1.2真菌毒素真菌毒素是真菌在食品或飼料中生長所產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，對人和動物都有極大的危害[28]。直接或間接方式攝入真菌毒素會產(chǎn)生急慢性中毒、致癌性等危害，若長期被人們攝入，具有潛在的致肝癌、胃癌、腎癌等的可能性[29]。江南大學(xué)王周平教授課題組開展了一系列利用核酸適配體修飾的上轉(zhuǎn)換納米顆粒檢測毒素物質(zhì)的研究工作，拓展了上轉(zhuǎn)換納米材料在分析檢測中的應(yīng)用。該課題組利用上轉(zhuǎn)換納米顆粒與納米金之間的共振能量轉(zhuǎn)移實現(xiàn)了伏馬菌毒素B1(FB1)的檢測[30]。他們將上轉(zhuǎn)換納米顆粒修飾在分子信標(biāo)一端，納米金修飾在分子信標(biāo)的另一端導(dǎo)致上轉(zhuǎn)換發(fā)光猝滅，當(dāng)存在待測物時上轉(zhuǎn)換發(fā)光恢復(fù)，從而實現(xiàn)FB1的檢測。此外，該課題組還通過雙色上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒-氧化石墨烯共振能量轉(zhuǎn)移實現(xiàn)了FB1和赭曲霉毒素A(OTA)的同時檢測[31]。具體設(shè)計是將FB1和OTA的核酸適配體分別與兩種上轉(zhuǎn)換納米顆粒連接作為供體探針，該探針通過非共價鍵與氧化石墨烯相連，上轉(zhuǎn)換發(fā)光被猝滅，當(dāng)加入靶標(biāo)物FB1和OTA后，上轉(zhuǎn)換探針與靶標(biāo)物結(jié)合，上轉(zhuǎn)換發(fā)光恢復(fù)，實現(xiàn)對兩種毒素的同時檢測。將核酸適配體功能化的稀土上轉(zhuǎn)換納米材料用于真菌毒素的檢測，拓展了上轉(zhuǎn)換納米材料在食品分析、環(huán)境檢測中的應(yīng)用，對解決食品安全和環(huán)境污染問題起到了一定的推動作用。

2.1.3激素激素是一類由高度分化的內(nèi)分泌細(xì)胞合成并直接分泌入血的化學(xué)信息物質(zhì)，它通過調(diào)節(jié)各種組織的代謝活動影響人體的生理活動[32 - 33]。Guo等[34]構(gòu)建了基于上轉(zhuǎn)換納米材料和核酸適配體的電致化學(xué)發(fā)光適配體傳感器，實現(xiàn)了對環(huán)境雌激素雙酚A的檢測。此外，多種激素的同時檢測也非常重要。雌二醇和孕酮是一類重要的雌性類固醇激素，兩者的濃度及比值可以用來進(jìn)行先兆流產(chǎn)、異位妊娠等疾病的評估?；诖?，我們課題組設(shè)計合成了核酸適配體功能化的上轉(zhuǎn)換納米探針，結(jié)合光子晶體基底，構(gòu)建了對雌二醇及孕酮兩種激素同時檢測的集成性微器件。除了雙酚A、雌二醇和孕酮等激素之外，諸多其他的激素也在生物體中發(fā)揮了不可替代的功能，核酸適配體功能化的稀土上轉(zhuǎn)換納米材料也將為其他激素的檢測提供一種高靈敏、高特異性的傳感平臺。

2.2蛋白質(zhì)檢測

蛋白質(zhì)是生命活動的主要載體，是生物功能的主要執(zhí)行者[35]。蛋白質(zhì)的檢測對生命科學(xué)研究具有重大意義[36]。劉志洪教授課題組[37]首次利用核酸適配體修飾的上轉(zhuǎn)換納米材料和碳納米顆粒之間的共振能量轉(zhuǎn)移實現(xiàn)了人血漿中凝血酶的檢測。該小組利用共價作用將核酸適配體修飾在上轉(zhuǎn)換納米顆粒表面，當(dāng)無靶標(biāo)物凝血酶存在時，上轉(zhuǎn)換納米顆粒與碳球通過π-π相互作用靠近，上轉(zhuǎn)換發(fā)光被猝滅；靶標(biāo)物存在時，適配體與靶標(biāo)物結(jié)合，上轉(zhuǎn)換納米顆粒與碳球的距離增大，上轉(zhuǎn)換發(fā)光恢復(fù)，從而實現(xiàn)對凝血酶的檢測。此外，該課題組還利用上轉(zhuǎn)換納米材料和碳納米顆粒之間的共振能量轉(zhuǎn)移實現(xiàn)了對癌胚抗原和免疫球蛋白的檢測。除了以碳納米顆粒作為受體，Chen等[38]將金納米棒作為受體，上轉(zhuǎn)換納米材料作為供體，構(gòu)建了用于凝血酶檢測的共振能量轉(zhuǎn)移體系。Lin等[39]基于上轉(zhuǎn)換納米顆粒和金納米棒之間的共振能量轉(zhuǎn)移實現(xiàn)了對血清中血小板源生長因子的檢測。相較于溶液體系中蛋白質(zhì)的檢測，基底上蛋白質(zhì)的檢測時基底容易受到背景熒光的干擾，從而影響檢測靈敏度。為了解決這一問題，我們課題組[40]開發(fā)了基底上潛指紋中溶菌酶的檢測方法，將氨基修飾的溶菌酶核酸適配體修飾到上轉(zhuǎn)換納米顆粒表面，構(gòu)建了高特異性和無背景熒光干擾的指紋中溶菌酶檢測探針。由于基底中的熒光物質(zhì)不能被近紅外光激發(fā)，故該探針能有效消除背景熒光的干擾。此外，通過改變核酸適配體的種類，該探針還適用于指紋中其它標(biāo)志物的檢測。我們開發(fā)的方法有效解決了傳統(tǒng)指紋中標(biāo)志物檢測方法所面臨的特異性差和易受背景熒光干擾這兩方面的問題，有望在醫(yī)療診斷、刑事偵查等領(lǐng)域得到更進(jìn)一步的應(yīng)用。

2.3 核酸檢測

核酸是生命的最基本物質(zhì)之一，廣泛存在于所有動植物細(xì)胞、微生物體內(nèi)，既是生物的基本遺傳物質(zhì)，也是基因表達(dá)的基礎(chǔ)[41]。核酸分子與生物的生長、發(fā)育、疾病、衰老等活動息息相關(guān)，其檢測對多種疾病的診斷、基因治療、藥物篩選等領(lǐng)域有著非常重要的意義[42]。Cristobal等[43]基于上轉(zhuǎn)換納米顆粒和氧化石墨烯的共振能量轉(zhuǎn)移構(gòu)建了高靈敏度的DNA傳感器。在該設(shè)計中，上轉(zhuǎn)換納米顆粒表面的單鏈DNA可以與氧化石墨烯結(jié)合使得上轉(zhuǎn)換發(fā)光被猝滅，當(dāng)靶標(biāo)DNA存在時，上轉(zhuǎn)換納米顆粒表面的DNA單鏈與靶標(biāo)物雜交形成雙鏈，氧化石墨烯與上轉(zhuǎn)換顆粒分離，上轉(zhuǎn)換的發(fā)光恢復(fù)，實現(xiàn)對DNA的檢測。Laurenti等[44]基于石墨烯量子點和單鏈DNA修飾的上轉(zhuǎn)換納米顆粒構(gòu)建了特定miRNA序列的檢測平臺。無目標(biāo)miRNA序列時，單鏈DNA修飾的上轉(zhuǎn)換納米顆粒與石墨烯量子點結(jié)合，增強(qiáng)了上轉(zhuǎn)換發(fā)光；目標(biāo)miRNA序列存在時，其與單鏈DNA雜交形成雙鏈DNA，阻礙了上轉(zhuǎn)換納米顆粒和石墨烯量子點的結(jié)合，上轉(zhuǎn)換發(fā)光強(qiáng)度降低，從而實現(xiàn)了對目標(biāo)miRNA序列的檢測，檢測限低至10 fmol/L。我們課題組[45]基于不同激發(fā)和發(fā)射波長的稀土上轉(zhuǎn)換納米材料構(gòu)建了可以同時檢測多種疾病相關(guān)mRNA的可視化檢測平臺。我們將靶向兩種mRNA的上轉(zhuǎn)換納米探針負(fù)載在光子晶體基底上，利用上轉(zhuǎn)換顆粒表面DNA分子與氧化石墨烯的結(jié)合作用猝滅上轉(zhuǎn)換納米探針的發(fā)光。在靶標(biāo)mRNA存在條件下，相應(yīng)的上轉(zhuǎn)換納米探針表面的DNA分子與mRNA雜交形成雙鏈，探針與氧化石墨烯分離，上轉(zhuǎn)換發(fā)光得到恢復(fù)，實現(xiàn)了對兩種疾病相關(guān)mRNA的同時檢測，該工作對癌癥早期的診斷以及生命科學(xué)具有重要意義。

2.4 病原微生物檢測

病原微生物是一類能引起人類和動植物病害的微生物[46]，它會引起感染甚至傳染病，對人類和動植物的健康造成極大的危害，開發(fā)快速、靈敏、成本低的病原微生物檢測方法對人類健康至關(guān)重要[47]。Jin等[48]基于上轉(zhuǎn)換納米顆粒和金納米棒之間的共振能量轉(zhuǎn)移構(gòu)建了檢測大腸桿菌的適體傳感器，無靶標(biāo)物時，上轉(zhuǎn)換納米顆粒表面的DNA單鏈與金納米棒表面的核酸適配體雜交，上轉(zhuǎn)換發(fā)光被猝滅，加入靶標(biāo)物后，核酸適配體與靶標(biāo)物結(jié)合，上轉(zhuǎn)換發(fā)光恢復(fù)，實現(xiàn)對大腸桿菌的檢測。王周平教授課題組[49]首次展開了多色上轉(zhuǎn)換發(fā)光顆粒同時標(biāo)記檢測多組分毒素物質(zhì)的研究，利用雙色上轉(zhuǎn)換發(fā)光標(biāo)記-磁分離適配體識別技術(shù)實現(xiàn)了對鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的同時檢測。該設(shè)計中將上轉(zhuǎn)換納米材料標(biāo)記的適配體作為顯示探針，適配體功能化的磁性材料作為捕獲探針，構(gòu)建了一種“三明治”夾心型同時檢測鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的新方法。此外，該課題組還建立了利用雙色上轉(zhuǎn)換發(fā)光標(biāo)記-磁分離技術(shù)同時檢測兩種手足口病病毒的方法[50]，將兩種上轉(zhuǎn)換納米顆粒與特定核酸序列連接構(gòu)成信號探針，同時將磁性納米顆粒分別與特定核酸序列連接構(gòu)成捕獲探針，實現(xiàn)了對手足口病病毒EV-71和CV-A16的同時檢測。病原微生物具有種類繁多、遺傳變異快等特點，與操作復(fù)雜、檢測周期長的傳統(tǒng)檢測方法相比，利用核酸適配體功能化的稀土上轉(zhuǎn)換納米顆粒檢測病原微生物具有操作簡單、靈敏度高等優(yōu)勢。

2.5 細(xì)胞檢測

細(xì)胞是構(gòu)成生物體的基本結(jié)構(gòu)單元，同時也是疾病形成過程中致病的基本單元[51]。細(xì)胞的分析檢測對于生物工程、疾病診斷具有重要意義[52]。劉莊教授課題組[53]首次提出了將上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料與核酸適配體結(jié)合作為納米探針檢測循環(huán)腫瘤細(xì)胞CTCs(CCRF-CEM細(xì)胞)，并且利用磁性納米材料將檢測到的循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行了有效分離。他們首先在上轉(zhuǎn)換納米材料表面修飾了PEG-PMHC18后，再結(jié)合上生物素和核酸適配體，形成能特異性識別循環(huán)腫瘤細(xì)胞的共聚物，進(jìn)一步利用生物素和親和素的特異性結(jié)合，加入修飾親和素的超順磁Fe3O4，最后用磁鐵分離出循環(huán)腫瘤細(xì)胞。Wang等[54]基于稀土上轉(zhuǎn)換納米材料和核酸適配體構(gòu)建了一個近紅外光驅(qū)動的光電適配體傳感器，實現(xiàn)了對乳腺癌細(xì)胞MCF-7的檢測。將核酸適配體功能化的稀土上轉(zhuǎn)換納米顆粒用于癌細(xì)胞的檢測，是一種有潛力的、具有高特異性和高靈敏度、簡便可行的方法，對未來腫瘤臨床診斷具有重大的意義。

3 展望

近年來，核酸適配體功能化的稀土上轉(zhuǎn)換納米材料在生物檢測領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，表現(xiàn)出靈敏度高、選擇性好、簡便、快速等優(yōu)勢，然而還存在一些問題有待解決：

(1)稀土上轉(zhuǎn)換納米材料的發(fā)光效率低，并且隨著顆粒尺寸減小，發(fā)光效率降低，限制了其在分析檢測以及熒光成像等方面的應(yīng)用。

(2)為了提高稀土上轉(zhuǎn)換納米材料水溶液體系中的分散性，擴(kuò)展其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，對顆粒表面進(jìn)行修飾是非常必要的，目前常用的表面修飾方法有表面配體交換法、包裹法等，在顆粒表面修飾一層或多層官能基團(tuán)，使得修飾后的納米顆粒具有親水/疏水性或便于連接DNA、抗體/抗原等以實現(xiàn)特殊的生物功能。然而目前要實現(xiàn)在顆粒表面定量可控地修飾配體仍比較困難。此外，通過在上轉(zhuǎn)換納米顆粒表面修飾多種配體以實現(xiàn)材料的多功能化仍然存在著很大挑戰(zhàn)。

(3)目前用于構(gòu)建適配體傳感器的核酸適配體種類仍十分有限，大部分研究工作都限制于一些常見的核酸適配體，這限制了其在生物傳感領(lǐng)域的應(yīng)用。隨著SELEX等生物技術(shù)的發(fā)展，越來越多種類的核酸適配體將被篩選出來，大大促進(jìn)其在生物傳感領(lǐng)域的發(fā)展。

隨著這些問題的解決和完善，核酸適配體功能化的稀土上轉(zhuǎn)換納米材料將會進(jìn)一步提高檢測靈敏度、擴(kuò)展更寬的檢測對象范圍，在生物分析領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)更加廣泛、深入的應(yīng)用。