5′核酸外切酶特異性熒光探針的設(shè)計和應(yīng)用

方思敏， 李夢圓， 趙美萍

(北京分子科學(xué)國家實驗室，北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，北京 100871)

5′核酸外切酶是一類重要的核酸損傷修復(fù)酶，具有5′～3′方向的外切活性，參與DNA的復(fù)制、重組和修復(fù)過程，對于維持基因組的穩(wěn)定性具有非常重要的作用[1 - 5]。人類核酸外切酶1(hEXO1)是人體中主要的5′外切酶，它參與堿基錯配修復(fù)(MMR)、雙鍵斷裂修復(fù)(DSBR)等多種DNA損傷修復(fù)途徑[6]，同時對于轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)的端粒結(jié)構(gòu)重組中端粒的維持具有重要意義[7]。hEXO1的活性缺陷可導(dǎo)致堿基錯配修復(fù)不及時，會對人體健康造成嚴重的危害，如導(dǎo)致自發(fā)性變異[8 - 10]、遺傳性非息肉性結(jié)腸直腸癌[11 - 12]以及15%～25%散發(fā)性腫瘤的發(fā)展[13]；而雙鍵斷裂修復(fù)不及時則會導(dǎo)致染色體重排或消失、癌癥或過早老化[14]。5′外切酶活性的異常與疾病密切相關(guān)，因此，開發(fā)其特異性熒光探針，用于生物樣品中該酶活性的一步快速檢測具有重要的生物學(xué)研究和臨床診斷的意義。

目前關(guān)于5′核酸外切酶參與DNA損傷修復(fù)的機理方面已開展了大量研究[1 - 7]，但關(guān)于生物樣品中5′外切酶活性及含量定量檢測方法的報道非常缺乏。DNA熒光探針法由于具有靈敏度高、成本低、設(shè)計靈活、操作簡單和響應(yīng)迅速等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于核酸酶的分析檢測和成像[15 - 16]。本工作以與hEXO1具有序列同源性、酶切性質(zhì)相近且易獲得的T5外切酶作為模型酶[17]，根據(jù)其與DNA底物反應(yīng)的特性設(shè)計了對5′外切酶具有高選擇性、高靈敏度的DNA熒光探針。該探針具有3′突出末端，5′末端磷酸化修飾以及連續(xù)三對錯配堿基的雙鏈內(nèi)環(huán)狀發(fā)夾結(jié)構(gòu)，能有效抑制其它核酸外切酶和內(nèi)切酶的非特異性水解作用，避免其干擾檢測。此外，研究中發(fā)現(xiàn)輔助蛋白和非離子表面活性劑的存在能夠明顯提高探針對目標酶的響應(yīng)。該探針成功用于人血清樣品中5′外切酶的一步快速測定，這是首例報道的可用于人血清中5′外切酶一步快速定量檢測的熒光探針方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Nano Drop 2000c 分光光度計(美國，Thermo)；Rotor-Gene Q 實時熒光PCR儀(德國，QIAGEN)；E -Centrifuge離心機(德國，Wealtec)；MLS-3020高壓滅菌器(日本，Sanyo)；渦旋混合器(海門市其林貝爾儀器(中國)制造有限公司)。

T5外切酶(T5 Exo)、脫氧核糖核酸酶Ⅰ(DNase Ⅰ)、外切酶Ⅰ(Exo Ⅰ)、外切酶Ⅲ(Exo Ⅲ)及其對應(yīng)緩沖溶液(表1)，均購自美國NEB；TE緩沖溶液(10 mmol/L Tri-HCl,1 mmol/L EDTA,pH=8.0)；人血清白蛋白(HSA,≥96%)、牛血清白蛋白(BSA,≥98%)，均購自美國Sigma-Aldrich；鏈霉親和素(>17 U/mg,1 U 結(jié)合1 μg D -生物素，pH=8.9)購自中國生工；Triton X-100購自中國西隴化工。

表1 各種核酸酶對應(yīng)的最適緩沖溶液組成及pH值

本文中使用的寡核苷酸探針由上海生工生物工程有限公司合成，經(jīng)過高效液相色譜(HPLC)純化。各探針序列如表2所示。

表2 寡核苷酸探針序列

abold represents mismatched bases;the stem part of the hairpin probe is underlined;FAM is 6-carboxy-fluorescein and Texas red is 7-amino-4-methylcoumarin;BHQ1 and BHQ2 are Black Hole Quenchers 1 and 2;*represents phosphorothioated nucleotides.

1.2 探針結(jié)構(gòu)優(yōu)化

酶切反應(yīng)均在200 μL封閉PCR管中進行，反應(yīng)體系的總體積為50 μL，探針終濃度為100 nmol/L 或200 nmol/L。熒光強度的檢測由Rotor-Gene Q完成，程序設(shè)置為在37 ℃每5圈測定一次熒光強度，共循環(huán)250圈，增益值設(shè)為10。熒光基團FAM的激發(fā)和發(fā)射波長分別為470 nm和510 nm，熒光基團Texas Red的激發(fā)和發(fā)射波長分別為595 nm和620 nm。根據(jù)熒光曲線初始上升階段直線部分的斜率計算熒光上升的速率。

1.3 探針的線性范圍和選擇性

將T5酶的標準品(0.25～12.5 U/mL)與100 mg/mL BSA以及0.5%Triton X-100預(yù)混。然后取1.0 μL酶標樣加入含有200 nmol/L探針P-6的緩沖溶液(67 mmol/L Glycine -KOH、6.7 mmol/L MgCl2、10 mmol/L 2-Mercaptoethanol)中，終體積為50 μL，實時監(jiān)測熒光強度隨時間的變化。由熒光強度隨時間變化的直線部分線性擬合得出熒光上升的速率再與酶濃度作圖，得到檢測的線性范圍。

將200 nmol/L探針P-6分別與T5、DNase Ⅰ、Exo Ⅲ、Exo Ⅰ 在其對應(yīng)的緩沖溶液(表1)中反應(yīng)，實時監(jiān)測熒光上升信號。T5、DNase Ⅰ、Exo Ⅲ、Exo Ⅰ的終濃度分別為2.0 U/mL、10 U/mL、10 U/mL、10 U/mL。

1.4 新鮮人血清中5′外切酶含量的測定

取4.0 μL人血清樣品，加入含200 nmol/L探針P-6的反應(yīng)緩沖溶液(67 mmol/L Glycine -KOH、6.7 mmol/L MgCl2、10 mmol/L 2-Mercaptoethanol、2.0 mg/mL BSA和0.01% Triton X-100)中，反應(yīng)體系的終體積和熒光測定方法同上。加標回收實驗中T5酶標準品的濃度為0.01 U/mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 探針結(jié)構(gòu)優(yōu)化

圖1 DNA雙鏈末端結(jié)構(gòu)對T5外切酶切割速率的影響。P-3、P-4和P-5的3′末端突出堿基個數(shù)分別為5、10、20；探針濃度：100 nmol/L；T5外切酶濃度：10 U/mL。F表示熒光基團，Q表示猝滅基團Fig.1 Effects of different terminal structures(P-1 and P-2) and overhang bases(P-3,P-4 and P-5) on the cleavage rate of T5 exoThe probe concentration is 100 nmol/L and the concentration of T5 Exo is 10 U/mL.F and Q represent FAM and BHQ1,respectively.

5′核酸外切酶可沿5′至3′方向移除位于線性或環(huán)狀雙鏈DNA的5′末端、切口或缺口處的核苷酸[18]。以T5外切酶作為5′核酸外切酶的模型酶，我們首先研究了不同雙鏈DNA末端結(jié)構(gòu)對酶切速率的影響。如圖1和表2所示，當(dāng)雙鏈DNA中標有熒光基團和猝滅基團的單鏈5′末端為平末端(P-1)或突出末端(P-2)時，T5核酸外切酶對探針的切割速率非常慢。而當(dāng)標記單鏈為5′凹末端時，酶切反應(yīng)的速率明顯加快(P-3、P-4 和P-5)。推測這一現(xiàn)象是由于互補鏈的3′突出結(jié)構(gòu)更有利于T5外切酶與雙鏈底物穩(wěn)定地結(jié)合，從而使酶對標記單鏈的切割能更快速地發(fā)生[19 - 20]。我們進一步比較了互補鏈3′末端突出的堿基個數(shù)對酶切速率的影響。實驗結(jié)果表明，3′末端突出堿基的個數(shù)改變時(從5個增加到15個)，酶對探針的切割速率變化不大?？紤]到實際生物樣品中除了目標酶外，還可能同時存在其他3′外切酶。根據(jù)已有的研究報道，當(dāng)雙鏈DNA的3′末端突出4個以上堿基時，可以不受雙鏈3′外切酶(如Exo Ⅲ)的影響。而3′單鏈外切酶(如Exo Ⅰ)則需要與3′末端至少6個堿基結(jié)合才能對底物有效切割[21]。綜合以上實驗結(jié)果和非目標外切酶的特性，5′外切酶適合的DNA探針底物3′末端的突出堿基個數(shù)為5。

除上述核酸外切酶外，在生物樣品如血液和細胞環(huán)境中，還可能同時存在含種核酸內(nèi)切酶，如非限制性核酸內(nèi)切酶(DNase Ⅰ)、各種限制性核酸內(nèi)切酶和脫堿基核酸內(nèi)切酶(Ape1)等。未經(jīng)保護的核酸熒光探針極易受到核酸內(nèi)切酶，尤其是DNaseⅠ的攻擊，發(fā)生水解和產(chǎn)生假陽性信號[22 - 23]。雖然通過對磷酸骨架的硫?；梢宰柚惯@些內(nèi)切酶的切割作用，但若在靠近5'末端的區(qū)域?qū)α姿峁羌苓M行修飾，也會同時抑制目標酶對探針的水解作用。在我們之前報道的Ape1 檢測方法中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在天然的DNA雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部引入兩個連續(xù)的錯配堿基對時，可有效減慢DNaseⅠ的水解作用，而繼續(xù)增加一對含空位的錯配堿基對可使探針被DNaseⅠ水解的速率進一步減小到只有上述連續(xù)兩錯配結(jié)構(gòu)的10%左右[16]，這一結(jié)果表明第三對錯配堿基對的引入對提高探針的選擇性具有至關(guān)重要的作用。為使5′外切酶探針不受各種核酸內(nèi)切酶的非特異性水解的影響，應(yīng)在探針的雙鏈區(qū)域設(shè)計至少連續(xù)3個錯配堿基對形成的內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)。

圖2 5′核酸外切酶的特異性熒光探針P-6的結(jié)構(gòu)和檢測原理示意圖Fig.2 Schematic representation of P-6 for measurement of the activity of 5′ exonuclease

綜上，如圖2所示，我們將5′外切酶的探針結(jié)構(gòu)設(shè)計為具有3′突出末端的發(fā)夾式結(jié)構(gòu)，并對5′末端進行磷酸化修飾，以利于5′外切酶識別并結(jié)合底物[24]。3′突出末端的突出堿基個數(shù)為5，探針莖部靠近5′末端第7～9個堿基的位置設(shè)計了連續(xù)三錯配堿基形成的內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)，而在內(nèi)環(huán)的另一側(cè)，對莖部骨架均進行了硫代保護。為了使酶切底物后迅速產(chǎn)生熒光信號，我們將熒光基團標記在5′末端第1個核苷酸的堿基上，而猝滅基團BHQ2標記在距5′末端的第10位堿基上，既能有效猝滅熒光又能避免產(chǎn)生空間位阻影響5′外切酶的酶切反應(yīng)。當(dāng)體系中無目標酶存在時，由于熒光基團與猝滅基因之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移作用，熒光被猝滅；當(dāng)體系中加入目標酶時，位于5′末端的第一個核苷酸迅速被切除，堿基上標記的熒光基團被釋放到自由溶液中，熒光信號快速上升。

2.2 反應(yīng)緩沖溶液組成的優(yōu)化

在我們之前的研究工作中發(fā)現(xiàn)，在酶與DNA熒光探針的反應(yīng)液中加入HSA對加快反應(yīng)速率和提高檢測的回收率有顯著的作用[16]。利用上述設(shè)計合成的探針(P-6)我們研究了在反應(yīng)液中加入HSA對T5酶切反應(yīng)的影響。隨著反應(yīng)溶液中HSA濃度的增加，酶切反應(yīng)速率逐漸增大，但熒光上升速率與酶濃度之間的線性關(guān)系并不理想。我們進一步嘗試了在反應(yīng)液中加入BSA或非離子表面活性劑Triton X-100，考察對反應(yīng)速率的影響，同樣也觀察到了加速現(xiàn)象，且當(dāng)將高濃度蛋白或表面活性劑先與T5外切酶預(yù)混，再加入含有探針的反應(yīng)液中時，熒光上升速率更快。在兩種反應(yīng)條件下，方法的最佳線性范圍均為0.1～1.0 U/mL，靈敏度為0.1 U/mL。在此基礎(chǔ)上，我們先將BSA和Triton X-100混合，然后再與目標酶預(yù)混，之后再加入到含有探針的反應(yīng)液中，實驗發(fā)現(xiàn)，探針對目標酶的響應(yīng)靈敏度進一步顯著提高，表明BSA和Triton X-100對酶切反應(yīng)的加快機理可能不同，并且二者之間可能還存在協(xié)同作用，其確切的作用機理目前還需進一步研究。經(jīng)過詳細優(yōu)化，當(dāng)BSA和Triton X-100在反應(yīng)液中的終濃度分別為2.0 mg/mL和0.01%時，方法的靈敏度最高，對目標酶的檢測限可達到0.005 U/mL，線性范圍為0.005～0.1 U/mL，見圖3。

圖3 (A)不同T5外切酶濃度下探針P-6被水解過程的熒光強度隨時間的變化；(B) 探針P-6的標準工作曲線，線性范圍：0.005～0.1 U/mL,R2=0.998(內(nèi)插圖為在T5外切酶低濃度范圍的熒光曲線圖)Fig.3 (A)Time courses of the hydrolytic reaction of P-6(200 nmol/L) by T5 at different concentrations;(B) Linear working range of the assay: 0.005 to 0.1 U/mL,R2=0.998(Inset:shows the fluorescence curves obtained at low concentration levels of T5 Exo,from 0.005 to 0.025 U/mL)

在上述反應(yīng)條件下，測定了探針P-6對其它可能共存酶(DNaseⅠ、Exo Ⅲ、Exo Ⅰ)的響應(yīng)，并與其在各自最佳緩沖溶液(表1)中的反應(yīng)速率進行了對比。結(jié)果表明，探針P-6與各干擾酶在上述T5的最佳緩沖溶液中的反應(yīng)速率均不及在各自最佳緩沖溶液中測到的結(jié)果。圖4(A)對比了各種干擾酶在自身的最佳緩沖液中對P-6的切割速率與目標酶在上述最優(yōu)反應(yīng)液中與P-6反應(yīng)的熒光上升速率?？梢?，即使干擾酶的濃度高達目標酶濃度的40倍，P-6探針對其的熒光響應(yīng)速率也遠小于對目標酶，表明所設(shè)計的P-6探針結(jié)構(gòu)對目標酶有良好的選擇性。

2.3 人血清樣品中5′外切酶含量的測定

基于以上研究結(jié)果，我們將探針P-6用于測定人血清樣品中5′外切酶的活性，并利用T5外切酶進行了加入回收實驗。共分析兩份人血清樣品，測得原血清中5′外切酶的含量為0.09±0.01 U/mL，加標回收率為100%±5% (n=3)。為了進一步排除血清樣品中可能存在的其他酶的干擾，確保熒光信號確實是由5′外切酶切割探針P-6產(chǎn)生的，我們設(shè)計合成了對照探針P-6-C。該對照探針與P-6序列相同，不同之處是在探針的5′末端標記了生物素，并對該末端的兩個磷酸二酯鍵進行了硫代修飾。這樣得到的探針5′末端能完全抑制目標酶的作用，而由于其他結(jié)構(gòu)與P-6完全一致，因此可以用來檢驗血清樣品中是否含有其他活性物質(zhì)能破壞P-6的結(jié)構(gòu)從而產(chǎn)生假陽性信號。結(jié)果表明，在上述優(yōu)化好的反應(yīng)條件下，只有當(dāng)T5濃度高于0.25 U/mL時，對照探針P-6-C才有微弱的熒光上升信號，其切割速率僅為相同濃度T5對P-6切割速率的約20%。而其它幾種酶即使?jié)舛雀哌_10 U/mL，仍不會產(chǎn)生明顯的熒光信號。將P-6和P-6-C用于對同樣的血清樣品進行測定，如圖4(B)所示，P-6的熒光信號快速上升，而對照探針P-6-C基本沒有產(chǎn)生熒光上升信號。這一結(jié)果有力地證實了探針P-6可用于特異性地定量檢測血清中存在的5′外切酶。

圖4 (A) 探針P-6的選擇性。T5：2.0 U/mL;DNaseⅠ: 10 U/mL;Exo Ⅲ: 10 U/mL;Exo Ⅰ: 10 U/mL;(B) 工作探針P-6和對照探針P-6-C對血清樣品響應(yīng)的熒光強度隨時間的變化Fig.4 (A)Selectivity of P-6(200 nmol/L) to T5(2.0 U/mL) over other nucleases(DNaseⅠ: 10 U/mL;Exo Ⅲ 10 U/mL;Exo Ⅰ 10 U/mL);(B) Time courses of the hydrolytic reaction of P-6(200 nmol/L) and P-6-C(200 nmol/L) by serum samples

3 結(jié)論

本文設(shè)計合成了對5′外切酶具有高選擇性、高靈敏度的DNA熒光探針P-6。該探針為3′末端突出5個堿基，5′末端磷酸化修飾的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，熒光基團和猝滅基團分別標記在距5′末端的第1位和第10位堿基上，并且在雙鏈部分距5′末端第7-9位堿基處引入了由連續(xù)3對錯配堿基形成的內(nèi)環(huán)結(jié)構(gòu)。實驗結(jié)果證實了上述設(shè)計可有效避免探針被3′外切酶及各種內(nèi)切酶破壞，對5′外切酶具有高選擇性。研究還發(fā)現(xiàn)，在外加蛋白BSA與非離子表面活性劑Triton X-100的輔助下，探針P-6對5′外切酶具有很高的靈敏度，線性范圍為0.005～0.1 U/mL，檢測限為0.005 U/mL。利用該探針，我們成功實現(xiàn)了人血清樣品中5′外切酶的一步快速測定，測得血清中5′外切酶的含量為0.09±0.01 U/mL，回收率為100%±5%(n=3)。本文的研究結(jié)果不僅為實時監(jiān)測生物樣品中5′核酸外切酶的含量變化提供了簡便有效的方法，也為臨床疾病診斷、酶抑制劑的高通量篩選和更多功能相關(guān)的DNA修復(fù)蛋白的鑒定提供了非常有用的工具。