N-辛基-2-吡咯烷酮甲磺酸鹽離子液體動態(tài)涂敷毛細(xì)管電泳分離堿性蛋白質(zhì)

李 昀， 郭小峰， 周曉海， 王 紅

(生物醫(yī)學(xué)分析化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430072)

蛋白質(zhì)是氨基酸經(jīng)脫水縮合形成酰胺鍵連接而成的生物大分子，是生命體的重要組成部分和生命活動的基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)的分離分析在食品安全、臨床醫(yī)學(xué)、生物醫(yī)藥、遺傳免疫和生物化學(xué)等領(lǐng)域有著重要意義。毛細(xì)管電泳(Capillary Electrophoresis，CE)具有高效、快速、樣品和溶劑用量少、靈敏度高等特點(diǎn)，是分離分析蛋白質(zhì)等生物大分子的強(qiáng)有力工具[1 - 4]。然而，石英毛細(xì)管內(nèi)壁存在大量硅羥基。在pH大于3.0的溶液中硅羥基解離，使毛細(xì)管內(nèi)壁帶負(fù)電，在毛細(xì)管內(nèi)壁形成帶負(fù)電荷(Si-O)的吸附點(diǎn)。當(dāng)背景電解質(zhì)pH小于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時，這些負(fù)電荷會對帶正電荷的蛋白質(zhì)產(chǎn)生靜電吸附[5]。此外，毛細(xì)管內(nèi)壁與蛋白質(zhì)分子中的疏水區(qū)域存在疏水作用[5]。這些相互作用將導(dǎo)致CE分離蛋白質(zhì)時出現(xiàn)峰形展寬乃至拖尾，導(dǎo)致分離效率降低、遷移時間重現(xiàn)性下降等問題，在相當(dāng)程度上限制了CE在生物醫(yī)學(xué)分析方面的應(yīng)用。為解決這一問題，對毛細(xì)管內(nèi)壁進(jìn)行修飾是一個有效途徑，可以屏蔽毛細(xì)管內(nèi)壁的硅羥基，并使石英表面的性質(zhì)發(fā)生轉(zhuǎn)化(通常轉(zhuǎn)化為親水性表面)[1]。目前，通常采用的修飾方法主要有動態(tài)涂敷、物理吸附或化學(xué)鍵合[2]。動態(tài)涂敷通過在緩沖溶液中加入與毛細(xì)管壁具有強(qiáng)烈相互作用的涂層物質(zhì)，從而形成動態(tài)涂層，具有制備簡單快速、涂層可再生等優(yōu)勢，是CE分離蛋白質(zhì)的一個理想方案[2]，目前常采用的動態(tài)涂敷試劑主要是中性高分子聚合物和陽離子表面活性劑[6]。

離子液體(Ionic Liquids,ILs)蒸氣壓小，不揮發(fā)，電導(dǎo)率強(qiáng)，粘度低，性質(zhì)穩(wěn)定，對無機(jī)物和有機(jī)物有良好的溶解性，在電化學(xué)[7 - 8]、有機(jī)合成[9 - 10]、萃取分離[11 - 12]等化學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。在CE中，ILs常作為動態(tài)涂敷試劑、電泳緩沖液添加劑或者共價鍵合涂層試劑，通過物理吸附、共價鍵合等作用力把ILs的陽離子吸附或者鍵合到在毛細(xì)管壁上，在毛細(xì)管內(nèi)表面形成一均勻的涂層，對毛細(xì)管內(nèi)壁進(jìn)行改性修飾，既可以用于水相，也可以用于非水相分離不同的物質(zhì)，如氨基化合物[13]、抗生素[14]等物質(zhì)。

然而，目前將ILs用于CE分離蛋白質(zhì)的相關(guān)研究和報道很少。Jiang等采用1-烷基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽(1E-3MI-TFB)離子液體作為毛細(xì)管動態(tài)涂敷試劑和緩沖溶液添加劑，對4種堿性蛋白進(jìn)行了分離，理論塔板數(shù)為104N/m左右[15]。Wu等用1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸離子液體(1B-3MI-TFB)用作毛細(xì)管電泳的動態(tài)涂敷試劑和唯一運(yùn)行電解質(zhì)，對3種堿性蛋白和2種酸性蛋白質(zhì)進(jìn)行了分離，得到了較高的分離效率和重現(xiàn)性[16]。Li等首次將聚合物離子液體用于毛細(xì)管電泳，對溶菌酶、細(xì)胞色素c、α-胰蛋白酶原A和核糖核酸酶A四種堿性蛋白質(zhì)進(jìn)行了分離[17]。我們課題組將N-甲基吡咯烷酮磺酸鹽離子液體作為動態(tài)涂敷試劑用于CE分離堿性蛋白，四種堿性蛋白質(zhì)15 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)基線分離，理論塔板數(shù)在2.0～4.5×105N/m[18]。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

AgilentG1600A3D毛細(xì)管電泳儀(USA,Aglent Technology);Delta-320酸度計(jì)(梅特勒-托利多中國(上海)有限公司)；AL 104分析天平(梅特樂-托利多中國(蘇州)有限公司)；熔融石英毛細(xì)管：50 cm×75 μm，有效長度為41.5 cm(河北永年銳灃色譜器件有限責(zé)任公司)。

圖離子液體的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 The structure ionic liquid

1.2 毛細(xì)管電泳動態(tài)涂敷及蛋白質(zhì)分離條件

2 結(jié)果討論

2.1 離子液體動態(tài)涂敷的機(jī)理

使用離子液體作背景電解質(zhì)時或者作為背景電解質(zhì)添加劑時，離子液體的有機(jī)陽離子會通過靜電引力動態(tài)吸附到毛細(xì)管內(nèi)壁,從而改變毛細(xì)管內(nèi)表面的電荷。具有長烷基鏈的N-辛基-2-吡咯烷酮靜電吸附于毛細(xì)管內(nèi)壁后，由于其表面活性作用，可使毛細(xì)管內(nèi)壁覆蓋更為完全。在分離時，帶正電的堿性蛋白質(zhì)與涂敷在毛細(xì)管內(nèi)壁的吡咯烷酮陽離子產(chǎn)生靜電排斥，同時毛細(xì)管內(nèi)壁被N-辛基-2-吡咯烷酮覆蓋，避免了由蛋白質(zhì)與毛細(xì)管內(nèi)壁的直接接觸引起的其它相互作用，從而改善蛋白質(zhì)的CE分離效果。

2.2 離子液體動態(tài)涂敷分離堿性蛋白質(zhì)的研究

圖2 NaAc-HAc緩沖體系中離子液體濃度對溶菌酶分離效果的影響Fig.2 Effect of ionic liquid concentration in NaAc-HAc buffer on separation of lysozyme(1 mg/mL)Buffer:10 mmol/L NaAc-HAc(pH=4.5);voltage:25 kV;injection:hydrodynamic,50 mbar,4 s;detection:214 nm;temperature:25 ℃. concentration:(a) 0 mmol/L;(b) 1 mmol/L;(c) 2.5 mmol/L;(d) 5 mmol/L;(e) 7.5 mmol/L.

圖3 Tris-HCl緩沖體系中離子液體濃度對溶菌酶分離效果的影響Fig.3 Effect of ionic liquid concentration in Tris-HCl buffer on separation of lysozyme(1 mg/mL)Buffer:10 mmol/L Tris-HCl(pH=4.5);voltage:20 kV;injection:hydrodynamic,50 mbar,4 s;detection:214 nm;temperature:25 ℃. concentration:(a) 1 mmol/L;(b) 2.5 mmol/L;(c) 5 mmol/L;(d) 7.5 mmol/L.

圖4 優(yōu)化分離條件下三種堿性蛋白質(zhì)分離的電泳圖Fig.4 Electropherogram of three basic proteins under optimized separation conditionsBuffer:10 mmol/L Tris-HCl(pH=4.5) containing kV;injection:hydrodynamic,50mbar,4 s;detection:214 nm;temperature:25℃.Peaks:(1) lysozyme(0.33 mg/mL);(2) cytochrome c(0.33 mg/mL);(3) α -chymotrypsinogen A(0.33 mg/mL).

2.2.3分析性能在優(yōu)化條件下得到了三種堿性蛋白質(zhì)的最佳電泳譜圖，如圖4所示。溶菌酶、細(xì)胞色素c、α-胰凝乳蛋白酶原遷移時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為4.75%、3.43%和3.61%，說明所建立的方法具有良好重現(xiàn)性。對三種堿性蛋白質(zhì)的分離效率按照公式：N=5.54 ×(tR/W1/2)2進(jìn)行了計(jì)算，其中N為理論塔板數(shù)，tR為相應(yīng)蛋白質(zhì)的遷移時間，W1/2為相應(yīng)蛋白質(zhì)信號峰的半峰寬，結(jié)果見表1。

表1 優(yōu)化分離條件下三種堿性蛋白質(zhì)的理論塔板數(shù)

3 結(jié)論

將同時具有陽離子表面活性劑和離子液體結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的N-辛基-2-吡咯烷酮磺酸鹽離子液體作為毛細(xì)管電泳動態(tài)涂敷試劑，建立了簡單快速分離堿性蛋白質(zhì)的新方法。離子液體形成的動態(tài)涂層有效抑制了堿性蛋白質(zhì)在毛細(xì)管內(nèi)壁上的吸附，分離效率較高，可在8 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)堿性蛋白質(zhì)溶菌酶、細(xì)胞色素c、α-胰凝乳蛋白酶的基線分離，表明此類結(jié)構(gòu)的離子液體作為涂敷試劑在毛細(xì)管電泳分離蛋白質(zhì)中具有較好的應(yīng)用潛力。