中草藥活性成分的高通量篩選技術(shù)研究進(jìn)展

權(quán)寧海， 康英錦， 李東浩， 商海波

(長(zhǎng)白山生物資源與功能分子教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(延邊大學(xué)),延邊大學(xué)理學(xué)院化學(xué)系，吉林延吉 133002)

1 引言

高通量篩選技術(shù)是以含有分子(如酶、受體)和細(xì)胞的微孔板為載體，從大量藥物樣品中篩選出與靶點(diǎn)有相互作用的候選藥物的一種方法，即通過(guò)觀察藥物樣品對(duì)靶點(diǎn)的生物活性或整體細(xì)胞的影響，篩選候選藥物[1]。隨著高通量篩選技術(shù)的不斷發(fā)展，該技術(shù)已經(jīng)成為發(fā)現(xiàn)新藥物的重要途徑[2]。中國(guó)傳統(tǒng)的中草藥是探索和發(fā)展新藥物的豐富來(lái)源[3]。據(jù)記載，直到2010年為止，中國(guó)已經(jīng)記錄了大約有12 807種天然來(lái)源的藥材，其中11 146種是植物來(lái)源，1 581種是從動(dòng)物中提取的，還有80種來(lái)自礦物[4]。因此，具有微量、高效、大批量篩選等優(yōu)點(diǎn)的高通量篩選技術(shù)，已經(jīng)越來(lái)越多地應(yīng)用于中草藥中活性成分的篩選領(lǐng)域[5 - 6]。具體篩選通常使用標(biāo)準(zhǔn)的96孔、384孔、1 536孔等微量滴定板，在短時(shí)間內(nèi)篩選大批量樣品。盡管高通量篩選技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于中草藥活性成分的篩選，但是由于中草藥基質(zhì)的復(fù)雜性、活性成分的分離、凈化等繁瑣的樣品前處理過(guò)程，篩選中草藥中的活性成分仍然是一項(xiàng)挑戰(zhàn)性工作[7]。

2 高通量篩選技術(shù)

目前，高通量篩選技術(shù)分為分子水平和細(xì)胞水平的篩選。它們都是以靶點(diǎn)與活性成分相互作用的原理為基礎(chǔ)而建立的微型體外高通量篩選模型。分子水平主要包括基于酶、受體、離子通道等的高通量篩選模型，它是通過(guò)檢測(cè)經(jīng)藥物樣品處理后靶點(diǎn)的活性而篩選靶點(diǎn)抑制劑的一種方法。細(xì)胞水平則是基于整體細(xì)胞的高通量篩選模型，是根據(jù)藥物樣品對(duì)整體細(xì)胞的影響篩選候選藥物的一種方法。近年來(lái)，以上微型體外高通量篩選模型逐漸應(yīng)用于中草藥中活性成分的篩選領(lǐng)域。本文匯總了分子水平和細(xì)胞水平高通量篩選技術(shù)在中草藥的應(yīng)用實(shí)例(表1)。

2.1 分子水平模型

2.1.1基于酶的高通量篩選技術(shù)對(duì)于目前的多種疾病，通過(guò)中斷細(xì)胞內(nèi)錯(cuò)綜復(fù)雜的酶途徑，可能會(huì)實(shí)現(xiàn)有效的疾病治療。據(jù)報(bào)道，大部分藥物的作用靶點(diǎn)中，酶占20%以上，例如重組人Rho激酶、脂肪酶、α-葡萄糖苷酶、糜酶2、乙酰膽堿酯酶等。因此，有效發(fā)現(xiàn)酶抑制劑是新藥研發(fā)的主要來(lái)源[7]?；诿傅母咄亢Y選模型是通過(guò)檢測(cè)酶的反應(yīng)底物或酶反應(yīng)后產(chǎn)物的含量來(lái)篩選出酶抑制劑的方法。當(dāng)活性成分與酶作用時(shí)，活性成分將激活或抑制酶的活性，從而影響酶水解產(chǎn)物的含量。宮麗麗等[8]建立了基于熒光素酶發(fā)光法的重組人Rho激酶高通量篩選模型。將重組人Rho激酶、待測(cè)樣品、底物、ATP加入到384孔板中孵育，之后加入Kinase-Glo試劑，用熒光素酶發(fā)光法測(cè)定經(jīng)過(guò)化合物或中藥提取物處理后的酶活性。從3萬(wàn)個(gè)化合物和中藥提取物中篩選出對(duì)重組人Rho激酶有作用的4個(gè)化合物和5個(gè)中藥提取物。孫曉麗等[9]選用脂肪酶或α-葡萄糖苷酶為靶點(diǎn)，建立了基于脂肪酶、α-葡萄糖苷酶的高通量篩選模型。將中藥提取物、脂肪酶、4-甲基傘形酮酯(4-Methylumbelliferyl oleate)加入96孔板中進(jìn)行反應(yīng)，通過(guò)測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物4-甲基傘形酮的熒光吸收值，判斷中草藥提取物對(duì)脂肪酶活性的影響。而α-葡萄糖苷酶通過(guò)與底物對(duì)-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)反應(yīng)所生成水解產(chǎn)物的紫外吸收情況，計(jì)算水解產(chǎn)物的含量，最終判斷中草藥提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的影響。從63種中藥提取物中篩選出同時(shí)對(duì)脂肪酶和α-葡萄糖苷酶有抑制作用的5種中藥提取物，分別為荷葉、姜黃、蓽茇、桑枝、桑白皮。上述中藥提取物對(duì)脂肪酶的Ic50值分別為28.00±5.51 mg·L-1、5.24 ±0.51 mg·L-1、14.76±2.58 mg·L-1、4.78±0.58 mg·L-1、3.41±0.67mg·L-1。而對(duì)α-葡萄糖苷酶的Ic50值分別為1.98±0.13 g·L-1、0.18±0.007 g·L-1、0.71±0.08 g·L-1、0.077±0.005 g·L-1、0.089±0.006 g·L-1。

表1 各靶點(diǎn)與中草藥潛在抑制劑匯總表

許芹永等[10]從72種藥食兩用的中藥中篩選α-葡萄糖苷酶抑制劑，發(fā)現(xiàn)大部分中藥提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制作用。在中藥提取物反應(yīng)濃度為0.625 mg·mL-1時(shí)，16種中藥提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制效果達(dá)到100%。Luo等[11]建立了基于高效液相色譜的α-葡萄糖苷酶抑制劑高通量篩選模型。以α-葡萄糖苷酶為靶點(diǎn)，通過(guò)檢測(cè)酶的反應(yīng)產(chǎn)物4-硝基酚的含量，從中草藥川西獐牙菜萃取液中篩選出了對(duì)α-葡萄糖苷酶具有最佳抑制作用的山酮素。王守寶等[12]基于重組倉(cāng)鼠糜酶2建立了熒光方法測(cè)定酶活性的體外高通量篩選模型。由于底物(N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-7-amido-4-methylcoumarin)在糜酶2 作用下水解生成具有熒光的水解產(chǎn)物(7-amido-4-methylcoumarin)，因此通過(guò)該方法測(cè)定經(jīng)中藥作用后糜酶2的活性，從28 060種化合物和12 020種天然物萃取液中篩選倉(cāng)鼠糜酶2的抑制劑。經(jīng)過(guò)初篩，篩選出抑制率大于90%的樣品，最終篩選出Ic50值分別為0.823 μmol·L-1和0.690 μmol·L-1的2種具有較強(qiáng)抑制活性的化合物。周思多等[13]建立了基于乙酰膽堿酯酶的高通量篩選模型。乙酰膽堿酯酶能夠分解碘化硫代乙酰膽堿生成硫代膽堿，再將硫代膽堿與顯色劑DTNB作用，檢測(cè)生成物在405 nm處的光吸收情況，發(fā)現(xiàn)48種不同溶劑中藥提取物中黃柏的乙醇提取物，元胡的乙醇提取物和丹參的乙酸乙酯提取物濃度在76.92 mg·L-1時(shí)，上述3種提取物的Ic50值分別達(dá)到259.12 mg·L-1、229.09 mg·L-1、1 202.26 mg·L-1。

2.1.2基于受體的高通量篩選技術(shù)受體是細(xì)胞膜或細(xì)胞內(nèi)存在的蛋白質(zhì)，它通過(guò)細(xì)胞外配基的結(jié)合，使細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生信號(hào)并引起細(xì)胞內(nèi)不同的生理效應(yīng)。受體的過(guò)表達(dá)或突變導(dǎo)致的信號(hào)傳遞紊亂與多種癌癥發(fā)生息息相關(guān)。因此，有效篩選受體抑制劑或激動(dòng)劑至關(guān)重要?；谑荏w的高通量篩選技術(shù)是根據(jù)配體直接作用于受體后檢測(cè)對(duì)受體的影響而進(jìn)行的篩選?；谑荏w的高通量篩選技術(shù)分為直接篩選和間接篩選。直接篩選方法是通過(guò)檢測(cè)配基與受體的相互作用而篩選的方法，但是此方法不能確定配基為激動(dòng)劑還是拮抗劑。間接篩選方法則是通過(guò)檢測(cè)配基與受體結(jié)合后細(xì)胞生物效應(yīng)的變化而篩選的方法，此方法能夠明確確定配基為激動(dòng)劑還是拮抗劑。

鄧小紅等[14]開(kāi)發(fā)了以多巴胺D5受體為靶點(diǎn)的細(xì)胞模型高通量篩選，從天然產(chǎn)物中篩選該受體的潛在激動(dòng)劑。首先將多巴胺D5受體和報(bào)告基因同時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，G418篩選后，最終的單克隆細(xì)胞系用于多巴胺D5受體的激動(dòng)劑高通量篩選，成功地從200多種天然產(chǎn)物中篩選出3種潛在的激動(dòng)劑。胡毅翔等[15]以TAS2R14受體為靶點(diǎn)，構(gòu)建了細(xì)胞模型高通量篩選。首先將攜帶綠色熒光蛋白GFP的慢病毒載體-TAS2R14基因轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，收集高滴度的慢病毒濃縮液和感染的HEK293T細(xì)胞，建立高度表達(dá)特異性TAS2R14受體的細(xì)胞模型，篩選120種中草藥提取物和化學(xué)單體，并成功地篩選出了具有激動(dòng)作用的天然抗哮喘中藥單體。張慶等[16]以G蛋白偶聯(lián)受體84(GPR84)即中鏈脂肪酸敏感受體為靶點(diǎn)，構(gòu)建了細(xì)胞模型高通量篩選。首先將質(zhì)?；騁PR84和Gα1轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，用抗生素進(jìn)行篩選后，通過(guò)RT-PCR、免疫熒光染色和cAMP分析等方法得到穩(wěn)定表達(dá)GPR84的細(xì)胞株，用于高通量篩選GPR84拮抗劑中。曹婧等[17]以組胺H3受體(H3R)為靶點(diǎn)，構(gòu)建了激活劑的細(xì)胞模型高通量篩選。首先將H3R和報(bào)告基因的質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)H3R的細(xì)胞株，激活劑結(jié)合于H3R，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，調(diào)節(jié)報(bào)告基因的表達(dá)，通過(guò)測(cè)定報(bào)告基因的表達(dá)水平，測(cè)定激活劑對(duì)H3R的影響。利用此細(xì)胞模型成功地篩選出與H3R結(jié)合的中藥組分。

2.1.3基于離子通道的高通量篩選技術(shù)離子通道是一類可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)離子水平的大分子膜蛋白。離子通道參與各種基本的生理過(guò)程，其故障導(dǎo)致很多人類疾病。因此，離子通道是一種重要的藥理分析靶點(diǎn)。離子通道的高通量篩選方法包括配體結(jié)合分析、通量基礎(chǔ)檢測(cè)、熒光基礎(chǔ)檢測(cè)、自動(dòng)電生理分析等[18](圖1)。不同離子通道的高通量篩選方法都不同。囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白(CFTR)是上皮氯通道，Luan等[19]將CFTR和鹵素傳感綠色熒光蛋白YFP-H148Q共同表達(dá)在甲狀腺上皮細(xì)胞上，通過(guò)通量基礎(chǔ)檢測(cè)，對(duì)34 000種TCM萃取液進(jìn)行了篩選，并通過(guò)生物活性分析和核磁共振實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)冬凌草中的貝殼杉烷型二萜-冬凌草甲素Oridonin對(duì)CFTR具有潛在抑制作用。Zhang等[20]基于CFTR介導(dǎo)的碘離子流入分析，建立了CFTR離子通道的高通量篩選模型。首先將CFTR和鹵素傳感綠色熒光蛋白EYFP-H148Q基因轉(zhuǎn)染到FRT細(xì)胞上，將轉(zhuǎn)然后的FRT細(xì)胞與中藥提取物進(jìn)行孵化，最終進(jìn)行熒光檢測(cè)。對(duì)500種中草藥進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)中國(guó)野生葡萄藤中的白藜蘆醇二聚體和白藜蘆醇四聚體對(duì)CFTR氯離子通道具有抑制作用。Ic50值均達(dá)到0.02 mmol·L-1。同上原理， Chen等[21]建立了CFTR離子通道的高通量篩選模型，從傳統(tǒng)中藥中篩選出對(duì)CFTR氯離子通道具有抑制作用的表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯和表兒茶素沒(méi)食子酸酯。

圖1 KCNQ2通道的激活劑的高通量篩選流程圖。利用熒光鉈通量測(cè)定法初篩，其次用384孔IonWorks Barracuda法確認(rèn)先導(dǎo)化合物，驗(yàn)證后用傳統(tǒng)的膜片鉗實(shí)驗(yàn)來(lái)表征探針[32]。Fig.1 Flow-chart of the high-throughput screening route for identifying KCNQ2 activators.The fluorescence-based thallium flux assay was used for the primary screen,followed by the confirmatory 384-well IonWorks Barracuda for hit validation.After the hit validation,a conventional patch-clamp experiment was used for probe characterization[32].

2.2 細(xì)胞水平模型

細(xì)胞水平高通量篩選模型是通過(guò)觀察整體細(xì)胞活性的變化，篩選影響細(xì)胞活性的藥物(圖2)。不同于分子水平模型，細(xì)胞水平高通量篩選模型可以用于難以分離的蛋白質(zhì)和研究不夠充分的靶點(diǎn)。Zhou等[22]以H9c2心肌細(xì)胞為靶點(diǎn)，建立了一種適用于篩選心肌細(xì)胞保護(hù)劑的高通量篩選模型，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒法，初步篩選出了可以提高受損心肌細(xì)胞活性的17種中草藥。經(jīng)過(guò)進(jìn)一步驗(yàn)證，從中篩選出了2種心肌細(xì)胞保護(hù)劑。Gong等[23]建立了一種自然殺傷細(xì)胞與肺癌細(xì)胞和天然產(chǎn)物共培養(yǎng)的高通量篩選模型。根據(jù)分析不同天然產(chǎn)物對(duì)IFN-γ分泌程度的影響和肺癌細(xì)胞的存活率，從502個(gè)天然產(chǎn)物進(jìn)行篩選，鑒定出28個(gè)候選天然產(chǎn)物，通過(guò)進(jìn)一步證實(shí)，分析出具有潛在活性的一種化合物，穿心蓮內(nèi)酯。楊秀穎等[24]以肝癌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞為模板分子建立了MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性的高通量篩選模型。通過(guò)利用224種不同溶劑提取出554個(gè)中草藥提取物，從中篩選出了具有特異性抗腫瘤作用的中草藥提取物，最終確定防己乙醇提取物對(duì)人肝癌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞Ic50值分別為8.27 mg·L-1和19.48 mg·L-1。

圖2 基于靶細(xì)胞生物活性的篩選過(guò)程示意圖[33]Fig.2.Schematic drawing of target cell-based bioactivity screening process.[33]

2.3 其他篩選模型

埃博拉病毒(EBOV)、拉沙病毒(LASV)、禽流感病毒(AIV)等的感染危害全球人類的健康，因此篩選有效的病毒抑制劑至關(guān)重要。Yang等[25]利用人免疫缺陷病毒的篩選手段，基于細(xì)胞模型高通量篩選，從不同中草藥中篩選了對(duì)埃博拉病毒的天然抑制劑，其中草藥包括梔子、酸橙、紫花地丁、夏枯草、薏苡mayuen變種羅馬草、桑等，并提出它們具有潛在的抗埃博拉病毒活性。Garcia等[26]基于細(xì)胞水平高通量篩選模型，采用天然化合物和中藥分子，利用慢病毒顆粒對(duì)HIV-1抑制劑進(jìn)行了篩選，結(jié)果所篩選出的抑制劑屬于非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑。Dai等[27]以A型流感病毒為靶點(diǎn)，利用高通量篩選平臺(tái)從83種中藥中篩選出35種藥用植物，并根據(jù)已有的相關(guān)報(bào)告，發(fā)現(xiàn)矮叢越橘、歐洲葡萄、肉桂有一個(gè)共同活性化合物，原花青素，并發(fā)現(xiàn)原花青素能夠通過(guò)生命周期的幾個(gè)階段抑制流感病毒的復(fù)制。

3 問(wèn)題與展望

經(jīng)數(shù)千年的歷史記載，中草藥作為一種寶貴且天然的資源，已被廣泛應(yīng)用于各種疾病的治療并得到認(rèn)可。許多治療經(jīng)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)表明，通過(guò)中草藥之間的配伍，可以得到更好的療效，且毒副作用較少[28]。在許多中草藥活性成分的篩選技術(shù)中，高通量篩選技術(shù)具有快速、簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)。并且，高通量篩選技術(shù)與目前先進(jìn)的檢測(cè)技術(shù)、計(jì)算機(jī)篩選技術(shù)、微流控芯片技術(shù)[29 - 31]等的有效結(jié)合，加速了中草藥活性成分的篩選進(jìn)程。但是，近年來(lái)“精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)”概念的提出，篩選并研發(fā)靶點(diǎn)明確、療效突出、安全高效、穩(wěn)定可控的多靶點(diǎn)多組分天然藥物已逐漸成為棘手問(wèn)題。然而，高通量篩選技術(shù)在基質(zhì)比較復(fù)雜的中草藥中篩選有效成分的過(guò)程中，需要一系列復(fù)雜的樣品前處理過(guò)程，導(dǎo)致天然藥物研發(fā)周期較長(zhǎng)的問(wèn)題。并且，對(duì)于細(xì)胞水平的高通量篩選技術(shù)，其作用靶點(diǎn)仍不明確，靶點(diǎn)與有效成分作用比例也不明確。因此，在天然產(chǎn)物新藥研發(fā)中篩選技術(shù)需要?jiǎng)?chuàng)新性突破，并在簡(jiǎn)便快速、精準(zhǔn)有效等方面需要進(jìn)一步得到發(fā)展和完善。