兔眼視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層下內(nèi)界膜移植轉(zhuǎn)歸觀察

吳鵬，高榮玉，徐鑫彥，張杰，任建濤，韓海濤，黃旭東

(濰坊眼科醫(yī)院 國家臨床重點專科建設(shè)項目單位，山東濰坊261041)

兔眼視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層下內(nèi)界膜移植轉(zhuǎn)歸觀察

吳鵬，高榮玉，徐鑫彥，張杰，任建濤，韓海濤，黃旭東

(濰坊眼科醫(yī)院 國家臨床重點?？平ㄔO(shè)項目單位，山東濰坊261041)

目的觀察兔眼視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層下人眼內(nèi)界膜移植的轉(zhuǎn)歸情況。方法選擇特發(fā)性黃斑裂孔患者6例，采用常規(guī)23G經(jīng)睫狀體平坦部無縫合三通道玻璃體切割手術(shù)進行內(nèi)界膜剝除，將剝除的內(nèi)界膜置入5- (4,6- 二氯三嗪基)氨基熒光素中染色，磷酸鹽緩沖液漂洗后備用。選擇青紫藍兔6只，速眠新Ⅱ注射液麻醉后行23G無縫合常規(guī)三通道經(jīng)睫狀體平坦部玻璃體切除術(shù)。切除晶狀體，保留晶狀體前囊膜，應(yīng)用4 mg/0.1 mL曲安奈德染色玻璃體后將其切除,然后行人工視網(wǎng)膜脫離，脫離范圍約1 PD范圍，在脫離的視網(wǎng)膜邊緣部作一長約1.5 mm的條形裂孔，將染色好的人眼視網(wǎng)膜內(nèi)界膜填塞入脫離的視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層下方。分別于術(shù)后3、10、30天采集術(shù)眼眼底彩色圖像及光學(xué)相干斷層掃描(OCT)圖像，觀察移植物情況；采集圖像后，各時間點處死內(nèi)界膜移植片在位兔1只，制備快速冰凍病理切片，使用共聚焦顯微鏡觀察神經(jīng)上皮層下的內(nèi)界膜變化。結(jié)果術(shù)后3天眼底彩色圖像及OCT圖像可見4只兔內(nèi)界膜移植片在位、2只兔出現(xiàn)視網(wǎng)膜脫離導(dǎo)致內(nèi)界膜移植片移位，激光共聚焦顯微鏡下可見黃綠色熒光條帶；術(shù)后10天，眼底彩色圖像可隱約觀察到內(nèi)界膜移植成功的4只兔視網(wǎng)膜下淺黃色內(nèi)界膜移植片，OCT圖像可觀察到移植的內(nèi)界膜片段，激光共聚焦顯微鏡下可見黃綠色熒光條帶片段化。術(shù)后30天，眼底彩色圖像及OCT圖像中內(nèi)界膜移植片均已不可辨認，黃綠色熒光條帶消失。結(jié)論移植入兔眼視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層下的人眼視網(wǎng)膜內(nèi)界膜最終被降解吸收，不會在視網(wǎng)膜下形成永久性瘢痕。

特發(fā)性黃斑裂孔；內(nèi)界膜移植；視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮；兔

黃斑裂孔是指黃斑部視網(wǎng)膜內(nèi)界膜至感光細胞層發(fā)生的組織缺損，是一種嚴重損害視功能的疾病。玻璃體切割聯(lián)合內(nèi)界膜剝除術(shù)后惰性氣體填充是目前治療黃斑裂孔最主要的手段，可使黃斑裂孔閉合率達到90%以上。但對于特發(fā)性黃斑裂孔，如巨大黃斑裂孔、高度近視性黃斑裂孔、第一次手術(shù)后未閉合的黃斑裂孔等，如按常規(guī)方法治療，裂孔閉合率較低[1]。研究證實，內(nèi)界膜移植可誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)細胞橋樣增殖，促進黃斑裂孔閉合，并驅(qū)使光感受器細胞復(fù)位，繼而促進視功能恢復(fù)[2，3]。但內(nèi)界膜是muller細胞的基底膜，主要成分是Ⅳ型膠原纖維，可在膠原酶的作用下降解，亦可形成瘢痕組織，故移植入裂孔內(nèi)的內(nèi)界膜轉(zhuǎn)歸情況存在爭議。為此，我們于2016年12月～2017年1月進行了如下研究。

1 材料與方法

1.1 材料 健康青紫藍兔6只，雌雄不限，3月齡，體質(zhì)量(1.3±0.8) kg。Accrus玻切機，美國愛爾康公司；Resight非接觸式廣角系統(tǒng)，德國蔡司公司；Spectralis OCT，德國海德堡公司；直接眼底鏡，蘇州六六視覺科技股份有限公司。速眠新Ⅱ注射液，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所；5- (4，6- 二氯三嗪基)氨基熒光素(5- DTAF)，美國AAT Bioquest公司；磷酸鹽緩沖液、硅油，美國博士倫公司；曲安奈德，昆明積大制藥股份有限公司；OCT膠，重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所；鹽酸羅哌卡因，瑞典阿斯利康制藥有限公司。

1.2 人眼視網(wǎng)膜內(nèi)界膜獲取和制備 選擇經(jīng)裂隙燈、光學(xué)相干斷層掃描(OCT)等檢查確診，需行玻璃體切割聯(lián)合內(nèi)界膜剝除手術(shù)治療的特發(fā)性黃斑裂孔患者，排除重大全身性疾病(如嚴重心力衰竭)而不能承受眼部手術(shù)者，共納入患者6例。所有患者簽署手術(shù)協(xié)議書，由同一名具有豐富經(jīng)驗的眼科醫(yī)師切除視網(wǎng)膜內(nèi)界膜?；颊呓?jīng)鹽酸羅哌卡因球后麻醉，在Resight非接觸式廣角系統(tǒng)下，完成常規(guī)23G經(jīng)睫狀體平坦部無縫合三通道玻璃體切割手術(shù)。于中央玻璃體完全切除后玻璃體腔內(nèi)注射4 mg/0.1 mL曲安奈德染色，剝除以黃斑裂孔中心為圓心約2 PD范圍內(nèi)的內(nèi)界膜。將剝除的內(nèi)界膜置入預(yù)先用0.2 mol/L NaHCO3配置的0.5% DTAF溶液中染色1 min，磷酸鹽緩沖液漂洗后呈淺黃色[4]，說明人眼視網(wǎng)膜內(nèi)界膜制備成功。

1.3 兔視網(wǎng)膜裂孔模型制作及人眼視網(wǎng)膜內(nèi)界膜植入 手術(shù)操作由同一名眼科醫(yī)師完成。所有實驗兔適應(yīng)性喂養(yǎng)7天，術(shù)前臀部肌肉注射速眠新Ⅱ注射液0.01 mg/kg麻醉。麻醉完全后，于Resight非接觸式廣角系統(tǒng)下完成晶狀體切除聯(lián)合常規(guī)23G經(jīng)睫狀體平坦部無縫合三通道玻璃體切割手術(shù)?；静襟E：23G鞏膜穿刺刀作常規(guī)三通道鞏膜穿刺口，放置套管并進行玻璃體腔灌注；玻切頭切除晶狀體，保留晶狀體前囊膜；4 mg/0.1 mL曲安奈德染色玻璃體后將其切除；38G針頭在其下方后極部視網(wǎng)膜下注入灌注液，行人工視網(wǎng)膜脫離，脫離范圍為穿刺點周圍約1 PD；用視網(wǎng)膜剪刀在脫離的視網(wǎng)膜邊緣作一長約1.5 mm的條形裂孔，將人眼視網(wǎng)膜內(nèi)界膜植入脫離的視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層下方；行氣-液交換后在裂孔表面注射粘彈劑，視網(wǎng)膜復(fù)位后注入硅油。術(shù)畢球結(jié)膜下立即注射妥布霉素40 mg、地塞米松2.5 mg，術(shù)后1個月內(nèi)典必殊眼膏涂結(jié)膜囊、4次/d，阿托品眼膏涂結(jié)膜囊、2次/d。

1.4 相關(guān)指標觀察 術(shù)后1個月內(nèi)每2～3天，裂隙燈下檢查眼部情況并觀察眼內(nèi)炎癥反應(yīng)情況，直接眼底鏡觀察眼底情況。術(shù)后3、10、30天采集術(shù)眼眼底彩色圖像及OCT圖像，觀察移植物情況；采集圖像后，每個時間點空氣栓塞處死內(nèi)界膜移植片在位實驗兔1只，取眼球術(shù)區(qū)視網(wǎng)膜和球壁組織，立即制備冰凍切片，切片厚度8 μm，切片經(jīng)4 μg/mL PI溶液常溫避光孵育15 min，PBS沖洗3 min×5次，PBS- 甘油封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察照相。5- DTAF標記的內(nèi)界膜組織呈黃綠色熒光，PI標記的細胞核呈紅色熒光。

2 結(jié)果

術(shù)后1個月內(nèi)，所有實驗兔眼內(nèi)無炎癥反應(yīng)發(fā)生，玻璃體腔內(nèi)硅油安靜。術(shù)后3天直接眼底鏡觀察到4只實驗兔內(nèi)界膜移植片在位、2只實驗兔出現(xiàn)視網(wǎng)膜脫離導(dǎo)致內(nèi)界膜移植片移位，眼底彩色圖像及OCT圖像證實直接眼底鏡觀察結(jié)果。激光共聚焦顯微鏡下可見黃綠色熒光條帶。術(shù)后10天，4只內(nèi)界膜移植成功實驗兔眼底彩色圖像可隱約觀察到視網(wǎng)膜下淺黃色內(nèi)界膜移植片，OCT圖像可見移植的內(nèi)界膜片段，激光共聚焦顯微鏡下可見黃綠色熒光條帶片段化。術(shù)后30天，4只內(nèi)界膜移植成功實驗兔眼底彩色圖像及OCT圖像中內(nèi)界膜移植片均已不可辨認，黃綠色熒光條帶消失。見插頁Ⅱ圖3～5。

3 討論

玻璃體切割手術(shù)聯(lián)合內(nèi)界膜剝除后惰性氣體填充，可使黃斑裂孔閉合率達到90%以上。但對于第一次手術(shù)后未閉合的黃斑裂孔、直徑巨大的黃斑裂孔、高度近視性黃斑裂孔等特發(fā)性黃斑裂孔，常規(guī)手術(shù)裂孔閉合率較低。國內(nèi)外學(xué)者采用多種方法來提高其閉合率，如Alpatov等[5]在玻切手術(shù)中使用機械性推壓黃斑裂孔周圍視網(wǎng)膜使黃斑裂孔縮??；Charles等[6]在手術(shù)中于黃斑顳側(cè)行全層視網(wǎng)膜切開，以達到松解的目的；Reis等[7]在黃斑裂孔邊緣外1 PD范圍作5條向心性切口，切口深度達到視網(wǎng)膜色素上皮細胞層，視網(wǎng)膜切開的目的是松解黃斑裂孔周圍組織的牽拉，促進黃斑裂孔閉合。但上述方法均未取得預(yù)期效果。

目前，內(nèi)界膜移植治療特發(fā)性黃斑裂孔成為臨床研究的熱點[2，8]。其核心技術(shù)是將部分視網(wǎng)膜內(nèi)界膜移到黃斑裂孔內(nèi)，將黃斑裂孔區(qū)域暴露的視網(wǎng)膜色素上皮覆蓋。其促進黃斑裂孔閉合的機制：①黃斑裂孔內(nèi)植入內(nèi)界膜可恢復(fù)原來相對封閉的環(huán)境，通過Na+- K+- ATP酶將視網(wǎng)膜下液體轉(zhuǎn)運到裂孔外，使視網(wǎng)膜恢復(fù)貼附，從而促進裂孔閉合[9]；②巨噬樣細胞激活muller細胞誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)細胞增生[10～12]，而內(nèi)界膜內(nèi)有muller細胞片段，移植的內(nèi)界膜可促進視網(wǎng)膜內(nèi)及內(nèi)界膜移植片表面的膠質(zhì)細胞增殖，利用內(nèi)界膜作為支架，最終促進裂孔閉合。此外，Muller細胞承擔(dān)著傳遞光線從視網(wǎng)膜表層到光感受器細胞層的作用[13，14]。有文獻報道，對直徑大于400 μm的黃斑裂孔患者行內(nèi)界膜移植術(shù)后，裂孔閉合率高于行內(nèi)界膜剝除患者[15]。目前對內(nèi)界膜移植入黃斑裂孔內(nèi)的轉(zhuǎn)歸存在爭議。有研究認為，移植的內(nèi)界膜很快降解，其不僅能促進黃斑裂孔閉合，還可促進視功能恢復(fù)；也有研究認為，內(nèi)界膜移植后，黃斑裂孔區(qū)厚度較未行內(nèi)界膜移植的黃斑裂孔區(qū)厚，說明內(nèi)界膜移植后黃斑裂孔的閉合是瘢痕閉合，可阻礙視功能的恢復(fù)。

文獻報道，人眼黃斑區(qū)視網(wǎng)膜平均厚度為215 μm[16，17]，而兔眼視網(wǎng)膜平均厚度約為113 μm[18，19]，相對較薄，其內(nèi)界膜難以剝除。本研究曾嘗試剝除兔眼視網(wǎng)膜內(nèi)界膜，但未能成功，故選用人眼視網(wǎng)膜內(nèi)界膜代替。本研究結(jié)果顯示，術(shù)后3、10天均發(fā)現(xiàn)兔眼視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層下被染色的內(nèi)界膜移植片，隨時間延長，其呈現(xiàn)片段化，呈現(xiàn)逐漸降解狀態(tài)；而術(shù)后30天時未發(fā)現(xiàn)黃綠色熒光，證明內(nèi)界膜作為Ⅳ型膠原纖維最終被降解。本研究間接證實了填塞入黃斑裂孔的內(nèi)界膜可作為支架，促進膠質(zhì)細胞增殖，待黃斑裂孔閉合后最終被降解。文獻報道，黃斑裂孔的閉合時間一般為3天[20，21]；對于裂孔較小、易于閉合的黃斑裂孔，內(nèi)界膜移植并不能加速閉合，反而可能將其作為異物，阻礙視細胞向裂孔中心復(fù)位，不利于黃斑裂孔閉合及視功能的恢復(fù)，但對于巨大的特發(fā)性黃斑裂孔是有助于裂孔閉合的，這為內(nèi)界膜移植的適應(yīng)證提供了依據(jù)。此外，移植過程中應(yīng)將內(nèi)界膜盡量修理至與裂孔直徑相當(dāng)，這樣可加速黃斑裂孔閉合過程中內(nèi)界膜的降解速度。

總之，我們認為兔眼視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層下植入的人眼內(nèi)界膜可作為膠質(zhì)細胞增殖的臨時支架，最終會被降解吸收，不會在視網(wǎng)膜下形成永久性瘢痕。

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山東省自然科學(xué)基金資助項目(ZR2013HM108)。

黃旭東(E- mail： hxd3333@163.com)

10.3969/j.issn.1002- 266X.2017.36.009

R774.5

A

1002- 266X(2017)36- 0031- 03

2017- 08- 05)

文后參考文獻的著錄方法

按GB/T7714- 2005《文后參考文獻著錄規(guī)劃》采用順序編碼制著錄，依照其在文中出現(xiàn)的先后順序用阿拉伯?dāng)?shù)字加方括號標出。參考文獻中的作者1～3名全部列出，3名以上只列前3名，后加“，等”或其他與之相應(yīng)的文字。外文期刊名稱用縮寫，以《Index Medicus》中的格式為準；中文期刊用全名。論文題目后加文獻類型及標識，如專著[M]、期刊文章[J]等。每條參考文獻均須著錄起止頁。作者必須認真核對參考文獻原文，無誤后將其按引用順序(用阿拉伯?dāng)?shù)字)排列于文末。