逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建過程中的“LTR”和“Ψ”

王麗芬

[摘要]以剖析逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建的一道試題為起點(diǎn)，分析了逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組中“LTR”和“Ψ”的作用，奠定了逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建過程中“LTR”和“Ψ”操作要求的理論基礎(chǔ)，這是對試題的必要補(bǔ)充，同時(shí)有利于學(xué)生對逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建過程的全面理解。

[關(guān)鍵詞]LTR；Ψ；逆轉(zhuǎn)錄病毒；載體；構(gòu)建

[中圖分類號]G633.91 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A [文章編號]1674-6058（2017）05-0107-02

南通市2014屆高三第一次調(diào)研測試第33題以構(gòu)建病毒載體并培育轉(zhuǎn)基因小鼠為情境，主要考查基因工程和胚胎工程的主干知識，又著力考查學(xué)生閱讀理解和分析應(yīng)用的能力，有較好的區(qū)分度，充分體現(xiàn)了多維目標(biāo)考查的價(jià)值取向和“源于教材又高于教材”的命題思想，很好地發(fā)揮了模擬考試的檢測和學(xué)習(xí)功能，使學(xué)生在學(xué)會應(yīng)用所學(xué)知識解決新問題的同時(shí)又學(xué)到了最前沿的科學(xué)知識。

具體試題：逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是目前應(yīng)用較多的動物基因工程載體之一。運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以將外源基因插入到受體細(xì)胞染色體，使外源基因隨染色體DNA一起復(fù)制和表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組（RNA）的核心部分包括三個(gè)基因：gag基因（編碼病毒的核心蛋白）、pol基因（編碼逆轉(zhuǎn)錄酶）、env基因（編碼病毒的表面糖蛋白）。位于這些基因的兩端有LTR序列（含有啟動子、調(diào)節(jié)基因等），控制著逆轉(zhuǎn)錄基因組核心基因的表達(dá)及轉(zhuǎn)移。下圖是構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體及用于培育轉(zhuǎn)基因小鼠的過程?；卮鹣铝袉栴}：

（1）催化過程①的酶是____。

（2）過程②的工具酶有____和____。過程②中，外源基因一定要插入到病毒DNA的LTR序列中的啟動子后，其主要目的是____。

（3）過程③中，導(dǎo)人病毒蛋白編碼基因（gag、pol和env）的目的是____。

（4）過程④中，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染的細(xì)胞一般選擇內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞，因?yàn)檫@類細(xì)胞能____。此時(shí)，早期胚胎處于____期。

（5）在胚胎移植前，需要對代孕母鼠進(jìn)行____處理，使其生殖器官（子宮）適于早期胚胎的植入和正常發(fā)育。

（6）研究中必須對嵌合小鼠進(jìn)行篩選，只有能產(chǎn)生____的嵌合小鼠才能將獲得的新性狀遺傳給子代。

參考答案：（1）逆轉(zhuǎn)錄酶 （2）限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶） DNA連接酶 控制外源基因的表達(dá)與轉(zhuǎn)移 （3）合成組成病毒的蛋白質(zhì) （4）發(fā)育成新個(gè)體的各種組織器官囊胚 （5）同期發(fā)情 （6）含外源基因配子

試題分析：由圖中信息可以知道，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建的基本原理是用外源基因替換病毒基因組中的三個(gè)核心基因，構(gòu)成一個(gè)有缺陷（不能合成包裝蛋白：病毒核心蛋白、逆轉(zhuǎn)錄酶、表面糖蛋白）的逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA，然后導(dǎo)入能合成病毒包裝蛋白的受體細(xì)胞（即包裝細(xì)胞），在包裝細(xì)胞中包裝蛋白將外源DNA轉(zhuǎn)錄的RNA包裝成具有感染能力的逆轉(zhuǎn)錄病毒。但試題所給信息相對有限，學(xué)生們對逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建的理解有一定的障礙。如gag、pol、env這三個(gè)基因在包裝細(xì)胞里是怎樣啟動表達(dá)的？包裝蛋白為何不包裝gag、pol、env轉(zhuǎn)錄的RNA，而包裝了外源DNA轉(zhuǎn)錄的RNA？這些問題是學(xué)生不理解的，影響著學(xué)生對逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建的全面理解。而要解決這些問題就必須清楚病毒基因組中的“LTR”和“Ψ”的作用及構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體時(shí)的操作要求?！癓TR”、“Ψ”及“gag、pol、env”的位置關(guān)系可表示如下：

1.逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組中"LTR"的作用及構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體過程中的操作要求：LTR是長末端重復(fù)序列，分為5'LTR和3'LTR，含有啟動子、調(diào)節(jié)基因等，其主要作用是啟動和調(diào)控基因的表達(dá)。在包裝細(xì)胞中，包裝蛋白包裝的是RNA，所以導(dǎo)入受體細(xì)胞的外源DNA必須能夠轉(zhuǎn)錄，即要求導(dǎo)入包裝細(xì)胞的外源DNA必須帶有LTR。包裝細(xì)胞能成功合成包裝蛋白，就需gag、pol、env基因能夠成功表達(dá)，所以在構(gòu)建包裝細(xì)胞的時(shí)候，導(dǎo)人的gag、pol、env三個(gè)基因也必須帶有LTR，否則不能表達(dá)，實(shí)際操作過程中，導(dǎo)入包裝細(xì)胞的是5LTR-gag-pol-env-3'LTR。

2.逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組中“Ψ”的作用及構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體過程中的操作要求：Ψ序列是包裝信號，包裝蛋白是通過識別RNA中的Ψ序列才對RNA進(jìn)行包裝的，所以需被包裝蛋白包裝的RNA一定含有Ψ序列，而不需被包裝的RNA一定不能含有Ψ序列。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中包裝的是外源DNA轉(zhuǎn)錄的RNA，而非gag、pol、env轉(zhuǎn)錄的RNA。因此，構(gòu)建包裝細(xì)胞導(dǎo)入gag、pol、env三個(gè)基因時(shí)，相應(yīng)的核酸中一定不能含有Ψ序列，而向包裝細(xì)胞導(dǎo)入外源基因時(shí)，相應(yīng)的核酸中一定要含有Ψ序列。

綜上所述，構(gòu)建包裝細(xì)胞時(shí)，導(dǎo)入的相關(guān)基因應(yīng)是5LTR-gag-pol-env-3LTR，向包裝細(xì)胞導(dǎo)入外源基因時(shí)，導(dǎo)入的相關(guān)基因應(yīng)是5LTR-Ψ-外源基因-3'LTR。介于以上介紹，可將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建過程表示為下圖，更改之后的圖示更有利于學(xué)生對逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建過程的全面理解。

（責(zé)任編輯 黃春香）