知母皂苷AⅢ抑制人腦膠質(zhì)瘤增殖生長(zhǎng)的機(jī)制研究

譚希+潘會(huì)君+吳偉達(dá)+章丹丹

[摘要]考察知母皂苷AⅢ抑制人腦膠質(zhì)瘤U87MG細(xì)胞增殖的作用及機(jī)制分析。在裸鼠皮下荷瘤模型中，知母皂苷AⅢ組與模型組相比，顯著降低瘤重。知母皂苷AⅢ呈劑量依賴性抑制U87MG細(xì)胞的體外增殖；呈劑量依賴性降低βCatenin，Cyclin D1，Bcl2的蛋白表達(dá)，同時(shí)升高p21在蛋白和基因水平的表達(dá)；降低ERK磷酸化水平，抑制βCatenin的核轉(zhuǎn)移，同時(shí)提高p38和JNK蛋白的磷酸化水平。聯(lián)用JNK抑制劑SP600125和p38抑制劑SB203580后可逆轉(zhuǎn)知母皂苷AⅢ處理而提高的p21和降低的βCatenin的蛋白表達(dá)。知母皂苷AⅢ部分通過(guò)干預(yù)MAPK及Wnt/βCatenin信號(hào)通路而抑制腦膠質(zhì)瘤U87MG的增殖。

[關(guān)鍵詞]知母皂苷AⅢ；人腦膠質(zhì)瘤U87MG；細(xì)胞增殖；MAPK信號(hào)通路；Wnt/βCatenin信號(hào)通路

[Abstract]To explore the inhibitory effect of timosaponin AⅢ on the proliferation of human glioblastoma cell line U87MG and investigate its related mechanism As compared with the model group， the tumor weight was significantly reduced in timosaponin AⅢtreated group Timosaponin AⅢinhibited the proliferation of U87MG cell line in a dosedependent manner It upregulated the gene and protein expression levels of p21， meanwhile inhibited the protein expression levels of βCatenin， Cyclin D1 and Bcl2 It also inhibited the translocation of βCatenin into nucleus， suppressed the phosphorylation expression of ERK， but increased the phosphorylation expression of p38 and JNK Combined use of JNK inhibitor SP600125 and p38 inhibitor SB203580 could decrease p21 and increase βCatenin protein expressions Timosaponin AⅢ inhibited the proliferation of human glioblastoma cell line U87MG partly by intervening MAPK and Wnt/βCatenin signal pathways

[Key words]timosaponin AⅢ； human glioblastoma cell U87MG； cell proliferation； MAPK signal pathway； Wnt/βCatenin signal pathway

中藥知母是百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides Bge的干燥根莖，具有滋陰潤(rùn)燥、清熱瀉火等功效。其性寒，味苦，歸肺、胃、腎經(jīng)，臨床用于外感熱病、骨蒸潮熱、肺熱燥咳、高熱煩渴等癥狀[1]。其主要藥理活性成分知母皂苷在知母根莖中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為6% [2]。國(guó)內(nèi)外研究人員發(fā)現(xiàn)知母皂苷AⅢ能抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬等[34]，近年來(lái)對(duì)于知母皂苷AⅢ抗腫瘤活性的研究日益深入[57]，有希望將其開(kāi)發(fā)成一種新的抗癌類藥物。

腦膠質(zhì)瘤（腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤）約占顱內(nèi)腫瘤的70%。惡性腦膠質(zhì)瘤是34歲以下腫瘤患者的第二位死亡原因，患者平均存活的中位時(shí)間是14個(gè)月。腦膠質(zhì)瘤多呈侵襲性生長(zhǎng)，總體療效不佳，是神經(jīng)外科治療中最棘手的難治性腫瘤之一[810]。目前尚未有知母皂苷AⅢ抑制腦膠質(zhì)瘤增殖生長(zhǎng)的相關(guān)報(bào)道。該文考察知母皂苷AⅢ體內(nèi)外抑制腦膠質(zhì)瘤增殖生長(zhǎng)的作用并基于MAPK信號(hào)通路和Wnt/βCatenin信號(hào)通路考察其機(jī)制。

1材料

11藥物與試劑知母皂苷AⅢ、淫羊藿苷Ⅱ、紅景天苷、原薯蕷皂苷元均購(gòu)自上海同田生物技術(shù)股份有限公司；人腦惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87MG購(gòu)自美國(guó)ATCC公司；DMEM干粉培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；二甲基亞砜、噻唑藍(lán)購(gòu)自西格瑪奧德里奇（SigmaAldrich）公司；cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Trizol試劑購(gòu)自賽默飛世爾科技（Thermo Fisher Scientific）公司；RealMasterMix（SYBR Green）試劑盒、蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑PhosSTOP均購(gòu)自美國(guó)Roche公司；引物均由生工生物工程（上海）有限公司合成。Marker預(yù)染蛋白購(gòu)自Progema公司；NC膜購(gòu)自英國(guó)沃特曼Whatman公司；一抗βactin，pERK，TERK，pp38，Tp38，pJNK，TJNK，βCatenin購(gòu)自美國(guó)細(xì)胞生物技術(shù)（Cell Signaling Technology）公司；p21、Cyclin D1抗體、二抗山羊抗鼠、二抗山羊抗兔均購(gòu)自美國(guó)abCAM公司。ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自美國(guó)通用公司生命技術(shù)科學(xué)部門（GE）；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、RIPA蛋白強(qiáng)裂解液、Bcl2抗體、HDAC1抗體、細(xì)胞核蛋白細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為分析純。

12儀器生物安全柜（Delta series，Labconco，美國(guó)）；CO2培養(yǎng)箱（HEPA CLASS100，Thermo，美國(guó)）；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（XDS500C，上海蔡康光學(xué)儀器有限公司）；倒置顯微鏡（IX 71，Olympus，日本）；QB9006 恒溫微孔板快速振蕩器（海門市其林貝爾儀器有限公司）；熒光定量PCR儀（7500 Fast System，Applied Biosystems公司，美國(guó)）；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（JY922D，寧波新芝生物股份有限公司）；低溫高速離心機(jī)（Eppendorf Centrifuge 5810R，德國(guó)）；電泳儀（PowerPacTMHC，BIORAD公司，美國(guó)）；脫色搖床（TS8，Kylinbell Lab Instruments，中國(guó)）；凝膠成像系統(tǒng)（Tanon NIM2045，上海天能公司）；Spectra MAX190酶標(biāo)儀（MD公司，美國(guó)）。

2方法

21細(xì)胞培養(yǎng)U87MG細(xì)胞培養(yǎng)于添加了10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃恒溫、5%CO2培養(yǎng)箱中飽和濕度的條件下培養(yǎng)。穩(wěn)定傳2～3代后，選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

22建立裸鼠皮下移植瘤模型在裸鼠左上肢腋下緩慢推注注射02 mL U87MG細(xì)胞混懸液，含2×106個(gè)細(xì)胞。定期觀測(cè)裸鼠成瘤的時(shí)間和瘤體積大小。腫瘤的體積用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的最長(zhǎng)徑（a）及最短徑（b），并根據(jù)公式V= ab2/2進(jìn)行計(jì)算。成瘤后，給予中藥單體1 mg·kg-1腹腔注射14 d，取瘤稱重，免疫組化檢測(cè)Ki67。

23MTT法考察知母皂苷AⅢ對(duì)U87MG腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖能力的影響U87MG細(xì)胞懸液調(diào)節(jié)成密度為5×104個(gè)/mL，每孔接種100 μL于96孔板中，在CO2培養(yǎng)箱中過(guò)夜。為考察知母皂苷AⅢ對(duì)U87MG細(xì)胞增殖能力的影響，預(yù)試驗(yàn)中設(shè)置24，48，72 h時(shí)間點(diǎn)，數(shù)據(jù)差異不大（未顯示），最終選擇24 h為MTT檢測(cè)時(shí)間。知母皂苷AⅢ于125，25，5，10 μmol·L-1劑量處理U87細(xì)胞，孵育24 h后，每孔加入 5 g·L-1 MTT（1×PBS為溶劑）溶液20 μL，繼續(xù)避光培養(yǎng) 4 h，棄上清，每孔加入 150 μL DMSO，37 ℃搖床振搖5～10 min至其充分溶解，于酶標(biāo)儀測(cè)得在490 nm波長(zhǎng)下的吸光度A，計(jì)算用知母皂苷AⅢ不同濃度處理的各組細(xì)胞的細(xì)胞活性。細(xì)胞活性率=（A給藥組-A空白對(duì)照組） / （A對(duì)照組-A空白對(duì)照組） ×100%。每組獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

24QRTPCR考察知母皂苷A Ⅲ對(duì)細(xì)胞凋亡信號(hào)通路中p21 mRNA表達(dá)的影響為考察知母皂苷AⅢ對(duì)細(xì)胞周期的影響，檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞周期阻滯蛋白p21的表達(dá)的影響，文獻(xiàn)報(bào)道知母皂苷AⅢ誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡時(shí)間為4 h[11]，預(yù)實(shí)驗(yàn)中比較了4，6，24 h知母皂苷AⅢ誘導(dǎo)p21基因和蛋白表達(dá)變化（數(shù)據(jù)未顯示），最終確定4 h檢測(cè)p21基因表達(dá)變化，6 h檢測(cè)蛋白表達(dá)變化。U87MG細(xì)胞貼壁過(guò)夜培養(yǎng)后，更換為新鮮的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液，給藥處理組加入知母皂苷AⅢ（5，10 μmol·L-1）繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每組加1 mL Trizol按照Trizol說(shuō)明書提取步驟收集各組細(xì)胞的總RNA，讀取和計(jì)算各組RNA濃度，加DEPC水將全部樣品的RNA調(diào)整至同一質(zhì)量濃度500 mg·L-1。A260/A280在18～20的樣品進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。按照HighCapacity逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書，20 μL逆轉(zhuǎn)錄體系的反應(yīng)條件為：25 ℃ 10 min，37 ℃ 120 min，85 ℃ 5 min，產(chǎn)物置于4 ℃?zhèn)溆?。按照RealMasterMix（SYBR Green） 說(shuō)明書，以20 μL反應(yīng)體系合成模板cDNA，進(jìn)行定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（QRTPCR）。引物序列如下：p21 Forward 5′TGAGCCGCGACTGTGATG3′；Reverse 5′GTCTCGGTGACAAAGTCGAAGTT3′； βactin Forward 5′CTCCTCCTGAGCGCAAGTACTC3′；Reverse 5′CGGACTCGTCATACTCCTGCT3′，由生工生物工程（上海）有限公司合成。反應(yīng)條件為： 95 ℃ 10 min，50 ℃ 2 min，95 ℃預(yù)變性15 s，53 ℃ 1 min，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。每組樣品均做3個(gè)復(fù)孔。知母皂苷AⅢ處理組的相對(duì)含量用2ΔΔCt計(jì)算得出。每組獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

25Western blot考察知母皂苷AⅢ及抑制劑聯(lián)用對(duì)信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白表達(dá)含量的影響為考察知母皂苷AⅢ對(duì)MAPK信號(hào)通路的影響，而蛋白磷酸化水平隨時(shí)間變化而變化，最終確定知母皂苷AⅢ（5，10 μmol·L-1） 處理30 min后，收集蛋白檢測(cè)MAPK主要蛋白的磷酸化水平。細(xì)胞分為空白對(duì)照組、抑制劑聯(lián)用組為抑制劑聯(lián)用預(yù)處理1 h后加入知母皂苷AⅢ（5，10 μmol·L-1）、抑制劑聯(lián)用單獨(dú)處理組、知母皂苷AⅢ（5，10 μmol·L-1）單用組處理6 h，冰鎮(zhèn)1×PBS清洗，加入磷酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑和RIPA強(qiáng)細(xì)胞裂解液后收集細(xì)胞，超聲細(xì)胞粉碎機(jī)超聲破碎（3次，3 s/次），離心機(jī)在4 ℃以12 000 r·min-1離心15 min后取上清。根據(jù)細(xì)胞核蛋白細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒說(shuō)明書，對(duì)細(xì)胞核蛋白和漿蛋白進(jìn)行分離。各組蛋白均用BCA試劑盒測(cè)定總蛋白濃度。電泳前將每組15 μg的蛋白以4∶1的比例加入5×loading buffer，金屬浴95 ℃ 2 min后即用10%或12%的SDSPAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳，用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)到NC膜上后，用5%脫脂牛奶或5%BSA溶液封閉1 h，分別用一抗βactin，βCatenin，Cyclin D1，p21，Bcl2，pERK，TERK，pp38，Tp38，pJNK，TJNK，4 ℃孵育過(guò)夜，用TBST洗膜5 min，6次后加入相應(yīng)二抗（1∶1萬(wàn)）孵育，TBST洗膜5 min，6次后，ECL顯影液顯影。每組獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

26統(tǒng)計(jì)分析本實(shí)驗(yàn)所有計(jì)量資料均以±s表示，兩樣本組間比較采用t檢驗(yàn)，P<005為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3結(jié)果

31知母皂苷AⅢ對(duì)裸鼠皮下荷瘤模型的影響與模型組比較，知母皂苷AⅢ處理組的瘤重呈顯著性降低（P<005）。而淫羊藿苷Ⅱ、紅景天苷、原薯蕷皂苷元處理組的瘤重有一定的下降趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異（圖1）。Ki67的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞增殖密切相關(guān)，臨床上Ki67作為評(píng)價(jià)惡性腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的重要指標(biāo)。與模型組比較，知母皂苷AⅢ處理組的Ki67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著減少（P<005）。其余組與模型組比較，無(wú)顯著性差異（圖1）。

32知母皂苷AⅢ對(duì)U87MG細(xì)胞增殖能力的影響不同劑量的知母皂苷AⅢ（125～10 μmol·L-1）和人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞共孵育24 h，知母皂苷AⅢ在25～10 μmol·L-1呈劑量依賴性抑制人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87MG的細(xì)胞增殖（P<005）（圖2）。

33知母皂苷AⅢ對(duì)U87MG細(xì)胞中 p21 mRNA的影響經(jīng)知母皂苷AⅢ處理4 h后，p21基因水平的表達(dá)呈劑量依賴性提高 （P<001）（圖3）。

34Western blot法檢測(cè)知母皂苷AⅢ對(duì)U87MG細(xì)胞中βCatenin，Cyclin D1，p21，Bcl2，pERK，TERK，pp38，Tp38，pJNK，TJNK蛋白水平的影響經(jīng)知母皂苷AⅢ處理6 h 后，p21的蛋白表達(dá)上調(diào)（P<001），與其基因水平的變化一致。而βCatenin，Bcl2，Cyclin D1經(jīng)干預(yù)后下調(diào)（P<001）（圖4）。經(jīng)知母皂苷AⅢ處理30 min后，ERK蛋白磷酸化水平顯著降低（P<001），而p38和JNK蛋白的磷酸化水平顯著升高（P<001）（圖5）。

35Western blot法檢測(cè)聯(lián)用SP600125和SB203580對(duì)知母皂苷AⅢ干預(yù)p21和βCatenin蛋白水平的影響細(xì)胞分為空白對(duì)照組、知母皂苷AⅢ處理組（5，10 μmol·L-1）、JNK抑制劑SP600125（2 μmol·L-1）和p38抑制劑SB203580（20 μmol·L-1） 聯(lián)用組、抑制劑聯(lián)用組和知母皂苷AⅢ共同處理組。抑制劑聯(lián)用組，與空白對(duì)照組相比，不影響p21和βCatenin在U87中的蛋白表達(dá)；抑制劑聯(lián)用預(yù)處理細(xì)胞1 h 后，知母皂苷AⅢ繼續(xù)處理6 h，抑

與對(duì)照組比較1）P<005，2）P<001；與抑制劑聯(lián)用組比較3）P<005，4）P<001（圖2～7同）。

制劑聯(lián)用和AⅢ 10 μmol·L-1共同處理組與AⅢ 10 μmol·L-1劑量單獨(dú)使用組相比，p21的蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，βCatenin顯著上調(diào)，逆轉(zhuǎn)了AⅢ處理后提高p21和降低βCatenin的蛋白變化趨勢(shì)（圖6）。

36Western blot法檢測(cè)細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中對(duì)知母皂苷AⅢ干預(yù)βCatenin蛋白水平的影響經(jīng)知母皂苷AⅢ處理6 h后，知母皂苷AⅢ處理組與空白對(duì)照組共同進(jìn)行細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)蛋白的分離，檢測(cè)核質(zhì)內(nèi)βCatenin蛋白的表達(dá)變化。U87MG細(xì)胞經(jīng)AⅢ干預(yù)后，βCatenin的核蛋白表達(dá)顯著降低（圖7）。在AⅢ 10 μmolL-1劑量處理組中，該組的細(xì)胞核內(nèi)βCatenin的蛋白表達(dá)相比于空白對(duì)照組有顯著下降（P<005）。而細(xì)胞質(zhì)中的βCatenin蛋白表達(dá)與空白對(duì)照組相比無(wú)顯著變化。

4結(jié)果與討論

Wnt/βCatenin信號(hào)通路與腫瘤發(fā)生等多種疾病的病理過(guò)程相關(guān)，在多個(gè)細(xì)胞過(guò)程（分化、遷移、極性和增殖）中發(fā)揮重要作用。在膠質(zhì)瘤組織中，WNT1表達(dá)比正常腦組織顯著提高，并與Cyclin D1的表達(dá)顯著相關(guān)。Kailiang等基于UCSC癌癥基因數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)βCatenin和Cyclin D1在人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)狀態(tài)[12]。βCatenin作為核轉(zhuǎn)運(yùn)受體，通過(guò)與黏附分子相互作用，獲得協(xié)調(diào)核功能和細(xì)胞黏附的屬性[13]。熊果酸可通過(guò)降低βCatenin的核轉(zhuǎn)移干預(yù)Wnt/βCatenin信號(hào)通路而抑制骨肉瘤的生長(zhǎng)[14]。在本研究中，經(jīng)知母皂苷AⅢ處理后，

U87MG細(xì)胞中βCatenin，Cyclin D1和Bcl2的蛋白表達(dá)水平均呈劑量依賴性降低，且AⅢ 10 μmol·L-1能顯著降低βCatenin的核轉(zhuǎn)移。

周期蛋白依賴性激酶（CDK）抑制劑p21（也稱為p21WAF1/CIP1蛋白）是響應(yīng)于各種刺激促進(jìn)細(xì)胞周期阻滯的一個(gè)因素，在轉(zhuǎn)錄調(diào)控調(diào)節(jié)、抑制細(xì)胞凋亡、DNA修復(fù)中發(fā)揮作用[15]。p21由p53依賴性和p53非依賴性的機(jī)制來(lái)誘導(dǎo)。在p53非依賴性機(jī)制中，在有些情況下，p21具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用[16]。結(jié)果顯示，知母皂苷AⅢ處理后，可于體外顯著提高U87細(xì)胞中p21在基因和蛋白水平的表達(dá)。

絲裂原活化蛋白激酶家族（mitogenactivated protein kinase，MAPK）是一種廣泛存在于真核生物胞漿中高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，由細(xì)胞外信號(hào)引發(fā)細(xì)胞核內(nèi)反應(yīng)的一條經(jīng)典通路，影響著細(xì)胞形成、分化、生長(zhǎng)、增殖及凋亡等多個(gè)生命過(guò)程。研究表明有4條信號(hào)通路存在于MAPK家族中：ERK（extracellular signalregulated kinase）即細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶、JNK （cJun Nterminal kinase）即cJun N端激酶、MAPKp38和ERK5/BMK1通路。在哺乳動(dòng)物中，MKK4（MAP2K4）和MKK7（MAP2K7）磷酸化并激活JNK，而MKK3（MAP2K3），MKK4，MKK6和（MAP2K6）激活p38[17]。ERK是腫瘤細(xì)胞成癮性基因，ERK信號(hào)通路與細(xì)胞增殖生長(zhǎng)密切相關(guān)[18]。JNK和p38調(diào)節(jié)細(xì)胞存活（如Bcl2和Bax），細(xì)胞周期（如P53和Cyclin D1）和細(xì)胞增殖（如JUN和MYC）眾多基因的表達(dá)[17]。JNK通路參與知母皂苷AⅢ對(duì)人黑色素瘤A375細(xì)胞[19]和白血病HL60[11]誘導(dǎo)凋亡作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，知母皂苷AⅢ呈劑量依賴性降低U87MG細(xì)胞中ERK蛋白的磷酸化，同時(shí)呈劑量依賴性提高p38和JNK的磷酸化水平。聯(lián)用JNK抑制劑SP600125（2 μmol·L-1）和p38抑制劑SB203580（20 μmol·L-1）可逆轉(zhuǎn)知母皂苷AⅢ在10 μmol·L-1劑量對(duì)p21蛋白的提升作用和對(duì)βCatenin的抑制作用，而抑制劑聯(lián)用組對(duì)p21和βCatenin的蛋白表達(dá)的影響，與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，結(jié)果提示JNK和p38信號(hào)通路參與知母皂苷AⅢ抑制U87MG細(xì)胞增殖的進(jìn)程。

綜上所述，知母皂苷AⅢ部分通過(guò)MAPK和Wnt/βCatenin信號(hào)通路，提高p38和JNK蛋白的磷酸化水平，抑制ERK蛋白的磷酸化水平，抑制βCatenin的核轉(zhuǎn)移，提高p21和抑制Bcl2，Cyclin D1等抗凋亡蛋白的表達(dá)，從而抑制人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87MG的體外增殖和體內(nèi)生長(zhǎng)。

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