老年性癡呆血瘀證病證結(jié)合樹鼩模型的初步建立及三七總皂苷干預(yù)的評價(jià)

陳奔+覃梅春+黃金蘭+吳登攀+郭爾楚+劉志萍+許哲郝++郭茜茜+鐘振國

[摘要]初步建立老年性癡呆血瘀證病證結(jié)合樹鼩動(dòng)物模型并以三七總皂苷進(jìn)行藥物干預(yù)，以該藥物反證該病證結(jié)合模型的穩(wěn)定性。以5種中醫(yī)表征分析方法及凝血4項(xiàng)指標(biāo)、血漿NO含量、血漿SOD含量評價(jià)各組樹鼩模型的血瘀證水平；以免疫印跡試驗(yàn)（Western blot）檢測各組樹鼩大腦Aβ142蛋白、淀粉樣蛋白前體蛋白（APP）、磷酸化Tau蛋白（PTau）含量；HE染色觀察各組樹鼩大腦海馬神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)，免疫組化法檢測各組樹鼩大腦海馬膽堿乙酰基轉(zhuǎn)移酶（ChAT）與突觸素（SYP）含量。通過實(shí)驗(yàn)得出病證結(jié)合組樹鼩血瘀證中醫(yī)表征較AD組顯著，給藥組樹鼩血瘀證表征較病證結(jié)合組減輕；與空白組相比，AD組樹鼩大腦中Aβ142，APP及PTau含量降低，ChAT及SYP的平均陽性截面積/A降低，病證結(jié)合造模使這一降低加重，而三七總皂苷給藥緩解了這一變化。說明AD血瘀證病證結(jié)合樹鼩模型具有穩(wěn)定性。

[關(guān)鍵詞]老年性癡呆??； 血瘀證； 病證結(jié)合動(dòng)物模型； 樹鼩； 三七總皂苷

[Abstract] To establish the integration of Alzheimer′s disease（AD） and blood stasis syndrome tree shrew model. Panax notoginseng saponins （PNS） was used to intervene the model to testify the stability of the model. The level of blood stasis of each group in the tree shrew model was evaluated by analyzing five traditional Chinese medicine（TCM） characterizations， four blood coagulation indexes， plasma nitric oxide （NO） level， plasma superoxide dismutase （SOD） level in each group. Hematoxylin and eosin（HE） staining was used to observe the morphological changes of brain hippocampal neuron cell of each group. Immunohistochemical staining was used to assay the ChAT and SYP levels in brain hippocampus of each group.The blood stasis characterization of the integration of disease and syndrome group was more obvious than the AD group， and that of the drug administration group was lower than that of the integration of disease and syndrome group. Aβ142， APP， PTau， ChAT and SYP level of AD group were lower than those in the blank group， which were further reduced in the model of integration of disease and syndrome. However， the administration of PNS relieved the reduction， indicating that the AD and blood stasis integration syndrome tree shrew model is stable.

[Key words]Alzheimer′s disease； blood stasis syndrome； integration of disease and syndrome animal model； tree shrew； Panax notoginseng saponins

阿爾茨海默病（Alzheimer′s disease）是一種慢性進(jìn)行性智力損害疾病，被認(rèn)為是在老年群體中最普遍的一種癡呆類型[1]。主要表現(xiàn)為年老者語言、記憶、認(rèn)知、情感、性格和行為的功能性缺失。目前估計(jì)已有3 600萬人患上AD，這個(gè)數(shù)字預(yù)計(jì)到2050年會(huì)變?yōu)?1 800萬[2]。AD已經(jīng)逐漸成為社會(huì)和醫(yī)藥學(xué)科發(fā)展的主要問題。先前的研究顯示了AD的病理特征包括細(xì)胞外沉積老年斑，細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)的形成，產(chǎn)生在大腦皮層、海馬和大腦其他區(qū)域的膽堿能神經(jīng)元損害及突觸改變[3]。而且認(rèn)識(shí)到AD進(jìn)程涉及多種因素包括凋亡、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、炎癥反應(yīng)、能量代謝失衡。近期研究能減慢AD病人病情惡化的方法包括膽堿酯酶抑制劑和N甲基D天冬氨酸（NMDA）受體激動(dòng)劑，但是這些方法沒有一個(gè)能對阻止AD病情發(fā)展起到深遠(yuǎn)意義[45]。中藥已經(jīng)有治療AD很長一段歷史，幾千年的用藥經(jīng)驗(yàn)，傳統(tǒng)中藥已有預(yù)防和治療AD豐富的理論和寶貴的經(jīng)驗(yàn)[6]。傳統(tǒng)中藥很多不同組分組成的處方臨床上都用來治療AD，如六味地黃丸、養(yǎng)心湯、天麻鉤藤飲[7]。課題組前人也研究了三七總皂苷對AD的治療作用[8]。在理論上，傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為，AD是由于年高腎衰精虧、氣虛血少，以至髓海失養(yǎng)，或因脾虛痰濁內(nèi)生而蒙蔽清竅，神識(shí)不清，或氣滯、瘀血內(nèi)阻，臟腑化生之氣血不能上榮于腦，腦海不充而形成。病位在腦，其中腎虛為AD發(fā)病的根本原因，而血瘀是其重要的病理發(fā)病因素?，F(xiàn)研究多從腎虛證入手研究老年癡呆動(dòng)物模型，少有血瘀證與AD的病證結(jié)合動(dòng)物模型研究。樹鼩與人類某些基因具有較高的相似性[11]，與靈長類有較高的親緣關(guān)系，且在生理解剖上與人類具有極高相似度，因此，以樹鼩為對象構(gòu)建的AD模型更能模擬人類AD發(fā)病。本實(shí)驗(yàn)初步建立老年性癡呆血瘀證樹鼩動(dòng)物模型，并以三七總皂苷進(jìn)行干預(yù)，驗(yàn)證該模型的穩(wěn)定性。

1材料

11動(dòng)物

中緬樹鼩滇西亞種普通級，60只，雄性，體重120～140 g，飼養(yǎng)時(shí)間為10～12月齡，由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供，生產(chǎn)許可證號SCXK（滇）K20130002，合格證號SYXK（滇）K20130002。引進(jìn)后飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)清潔級動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，溫度22～25 ℃，濕度50%～60%，每天定時(shí)清掃糞便1次，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

12試劑

角叉菜膠（Sigma公司，批號CAS9000071）；水合氯醛（成都市科龍化工試劑廠，批號20130513）；D半乳糖（Sigma公司，批號G0625）；鵝膏蕈氨酸（Sigma公司，批號BGBC2055VF）；Aβ2535（Sigma公司，批號053M4804V）；三七總皂苷（云南維和藥業(yè)股份有限公司）；BCA蛋白定量試劑盒（Thermo，批號PICPI23223）；Aβ142抗體（Abcam，批號Ab39377）；APP（Sigma公司，批號SAB5200113）；PTau（Santa cruz，批號sc23468）；GAPDH（CST，批號#5174）；羊抗兔HRP標(biāo)記二抗（批號A0208）、驢抗山羊HRP標(biāo)記二抗（批號A0181）、羊抗鼠HRP標(biāo)記二抗（批號A0216）均購于碧云天公司。

13儀器

DW2000腦立體定位儀（成都泰盟軟件有限公司）；微量注射器（上海高鴿工貿(mào)有限公司）；Tanon5200成像系統(tǒng)（Tanon）；CX41正置顯微鏡（OLYMPUS公司）；PPTHK21B石蠟切片機(jī)（徠克公司）；IMS圖像分析系統(tǒng)[基爾頓生物科技（上海）有限公司]；D5100數(shù)碼相機(jī)（NIKON公司）；Sysmex CA7000全自動(dòng)凝血分析儀（日本希森美康株式會(huì)社）。

2方法

21動(dòng)物分組及處理

雄性滇西亞種樹鼩60只，分為4組，每組15只：空白組、AD模型組（以下稱AD組）、AD血瘀證模型組（以下稱病證結(jié)合組）、三七總皂苷給藥組（以下稱給藥組）。將AD組、病證結(jié)合組、給藥組全部樹鼩進(jìn)行大腦定位給藥的三維坐標(biāo)[9]定位，并在雙側(cè)腦室分別緩慢注射孵育好的Aβ25351 μL （10 g·L-1）和鵝膏蕈氨酸1 μL（5 g·L-1）共2 μL的混合溶液。空白組依照三維坐標(biāo)在雙側(cè)腦室分別注射2 μL生理鹽水。待頭部皮膚愈合后，將病證結(jié)合組、給藥組角叉菜膠溶液腹腔注射（75 mg·kg-1），連續(xù)3 d?？瞻捉M、AD組腹腔注射等劑量的生理鹽水，連續(xù)3 d。給藥組于第4天進(jìn)行三七總皂苷溶液灌胃給藥（200 mg·kg-1[10]），其余3組樹鼩以等容量的生理鹽水灌胃，連續(xù)10 d。

陳奔等：老年性癡呆血瘀證病證結(jié)合樹鼩模型的初步建立及三七總皂苷干預(yù)的評價(jià)22樹鼩中醫(yī)表征采集

在血瘀證造模最后一天48 h后給藥組進(jìn)行連續(xù)10 d PNS的灌胃給藥，并在給藥最后一天進(jìn)行所有樹鼩的足爪皮膚、鼻唇部皮膚、舌底的圖像采集，觀察所有樹鼩的精神狀態(tài)以及有無抓捕抵抗。

23凝血4項(xiàng)檢測

以Sysmex CA7000全自動(dòng)凝血分析儀及Sysmex配套試劑盒進(jìn)行檢測。

24血清NO含量及SOD活力的測定

各組血清中的NO含量采用硝酸還原酶法進(jìn)行測定，SOD采用WST1法測定，均按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

25Western blot測定腦組織中Aβ142，APP，PTau含量

將樹鼩腦組織剪成細(xì)小的碎片，加入裂解液，提取總蛋白質(zhì)并進(jìn)行定量。上樣量為80 μg蛋白，Aβ142（1∶1 000），APP（1∶500），PTau（1∶1 000），GAPDH（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，HRP（1∶1 000）標(biāo)記的二抗孵育1 h后顯色分析條帶。

26HE染色及免疫組化法檢測腦神經(jīng)細(xì)胞損傷

HE染色：常規(guī)方法對各組樹鼩大腦海馬部位固定、洗滌與脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、烤片和脫蠟、水化、蘇木素染色、伊紅染色、透明和封片，通過顯微鏡拍照，采集分析樣本相關(guān)部位。免疫組化：各組樣品玻片放在65 ℃恒溫烘箱中烤片30 min后經(jīng)脫蠟、水化、抗原修復(fù)、阻斷，滴加一抗，濕盒孵育，室溫下放置1 h，滴加HRP標(biāo)記廣譜二抗，室溫下放置30 min，DAB染色、蘇木素復(fù)染，將玻片置于二甲苯中透明后中性樹膠封片，放入65 ℃烘箱中15 min。顯微鏡拍照，采集分析樣本相關(guān)部位，計(jì)算陽性面積。

3結(jié)果

31中醫(yī)表征結(jié)果分析

311足爪、舌底、鼻唇部變化用Photoshop CS6計(jì)算某一圖像區(qū)域R（紅色值）、G（綠色值）、B（藍(lán)色值）三分量值，與空白組相比，AD組足爪、舌底、鼻唇部平均值R，G，B有降低趨勢，但無顯著性差異，提示AD組足爪、舌底、鼻唇部顏色與空白組無明顯差別；與AD組相比，病證結(jié)合組足爪、舌底、鼻唇部平均值R，G，B均明顯降低（P<001），提示病證結(jié)合組樹鼩足爪顏色比AD組樹鼩顏色變深，舌底顏色比AD組樹鼩顏色暗紫，鼻唇部皮膚顏色比AD組樹鼩顏色偏黯黑；與病證結(jié)合組相比，給藥組樹鼩足爪平均值R，G，B均明顯升高（P<001），提示給藥組樹鼩足爪顏色與病證結(jié)合組相比由黯黑向肉紅色恢復(fù)，舌底由暗紫向淡紅色恢復(fù)，鼻唇部由黯黑向肉紅色恢復(fù)。各組足爪平均值R，G，B見表1。不同組間樹鼩足爪、舌底、鼻唇部顏色圖像見圖1。

312抓捕抵抗空白組、AD組、病證結(jié)合組的抓捕抵抗率呈上升趨勢，提示大腦雙側(cè)注射給藥的AD造模樹鼩有一定的固定性疼痛，腹腔注射角叉菜膠的血瘀證誘導(dǎo)證型加重了這一表征。與病證結(jié)合組相比，給藥組抓捕抵抗率有下降趨勢，提示三七總皂苷對緩解固定性疼痛有一定作用。各組樹鼩的抓捕抵抗個(gè)數(shù)所占每組動(dòng)物個(gè)數(shù)比率見表2。

313抱頭空白組、AD組、病證結(jié)合組的抓捕抵抗率呈上升趨勢，提示大腦雙側(cè)注射給藥的AD造模樹鼩有個(gè)別精神狀態(tài)萎靡，腹腔注射角叉菜膠的血瘀證誘導(dǎo)證型加重了這一表征。與病證結(jié)合組相比，給藥組抱頭概率有下降趨勢，提示三七總皂苷對抗精神萎靡有一定作用。各組樹鼩抱頭個(gè)數(shù)所占每組動(dòng)物個(gè)數(shù)比率見表3。

314給藥期間給藥組足爪R，G，B的變化在給藥后第2天到第10天，隨著三七總皂苷給藥天數(shù)的增加，三七總皂苷給藥組的足爪顏色平均值R，G，B呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，提示隨著給藥天數(shù)增加，組內(nèi)樹鼩足爪顏色由黯黑向肉紅色轉(zhuǎn)變見表4。

32凝血4項(xiàng)檢測

與空白組比較，AD組的APTT，TT顯著減少（P<005或P<001），PT有減少趨勢，F(xiàn)IB顯著增加（P<001），提示AD組與空白組相比凝血因子活性增高，血液處于高凝狀態(tài)。與AD組相比，病證

結(jié)合組APTT，PT，TT顯著減少（P<005或P<001），F(xiàn)IB有增加趨勢，提示病證結(jié)合組與AD組相比凝血因子活性增高，高凝狀態(tài)增加。與病證結(jié)合組相比，給藥組APTT，PT，TT顯著增加（P<001），F(xiàn)IB顯著降低（P<001），提示三七總皂苷給藥能夠有效減輕AD血瘀證病證結(jié)合造模樹鼩的血液高凝狀態(tài)，見表5。

33血清NO含量及SOD活力的測定

各組血清NO含量及SOD活力見表6。與空白組相比，AD組血清的NO含量無明顯變化。與AD

組相比，病證結(jié)合組血清的NO含量明顯降低（P<005），提示由角叉菜膠造模引起的病證結(jié)合組動(dòng)物血管內(nèi)皮有明顯損傷。與病證結(jié)合組相比，給藥組樹鼩血清中NO含量有升高趨勢，提示三七總皂苷對血管內(nèi)皮有一定的保護(hù)作用。與空白組相比，AD組血清的SOD活力無明顯變化。與AD組相比，病證結(jié)合組血清的SOD活力明顯降低（P<005），側(cè)面佐證血清中由角叉菜膠造模引起的病證結(jié)合組動(dòng)物血管內(nèi)皮可能有損傷。與病證結(jié)合組相比，給藥組樹鼩血清中SOD活力有升高趨勢。

34腦組織中Aβ142，APP，PTau含量

各組樹鼩腦組織中APP，Aβ142，PTau蛋白印跡的定量分析見圖2。Aβ142灰度值顯示，與空白組比較，AD組Aβ142的灰度值有明顯增多（P<001）；與AD組比較，病證結(jié)合組Aβ142灰度值明顯增多（P<005）；與病證結(jié)合組相比，給藥組Aβ142含量顯著減少（P<001）。APP灰度值顯示，與空白組比較，AD組APP的含量顯著增加（P<001）；與AD組比較，病證結(jié)合組APP含量明顯增加（P<005）；與病證結(jié)合組相比，給藥組APP含量顯著減少（P<001）。磷酸化Tau蛋白（PTau）的灰度值顯示，與空白組比較，AD組PTau含量明顯增多（P<001）；與AD組比較，病證結(jié)合組PTau灰度值明顯增多（P<001）；與病證結(jié)合組相比，給藥組PTau含量顯著減少（P<001）。

35大腦皮質(zhì)部HE染色切片

光鏡下，空白組樹鼩大腦皮質(zhì)部神經(jīng)細(xì)胞飽滿，胞體充盈，排列整齊并且緊密。AD組神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)核縮小、凝聚的核固縮狀態(tài)，提示部分細(xì)胞核已經(jīng)停止DNA轉(zhuǎn)錄。病證結(jié)合組神經(jīng)細(xì)胞排列疏松，核固縮嚴(yán)重，部分細(xì)胞處于核碎裂與核溶解狀態(tài)，提示病證結(jié)合組的神經(jīng)細(xì)胞嚴(yán)重凋亡。給藥組神經(jīng)細(xì)胞排列較整齊，胞體較為飽滿，顯示三七總皂苷有一定的治療效果，見圖3。

36大腦皮質(zhì)部免疫組化切片檢測ChAT與SYP

361圖像分析ChAT檢測：空白組可見復(fù)染

與空白組相比1）P<001；與AD組相比2）P<005，3）P<001；與病證結(jié)合組相比4）P<001。

細(xì)胞核排列整齊，存在大量的ChAT陽性神經(jīng)元，其陽性物質(zhì)主要存在于胞漿與包膜內(nèi)，顯黃色，細(xì)胞排列緊密、整齊；AD組細(xì)胞出現(xiàn)核溶解現(xiàn)象，細(xì)胞核分布松散，ChAT陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，胞體破裂縮小，出現(xiàn)核固縮，排列較松散。病證結(jié)合組基本不見復(fù)染的細(xì)胞核，出現(xiàn)大量空泡，ChAT陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，無完整結(jié)構(gòu)，胞體縮小，出現(xiàn)核固縮，染色加深，排列較松散，陽性物質(zhì)較少。給藥組細(xì)胞核復(fù)染較病證結(jié)合組明顯，ChAT免疫陽性產(chǎn)物部分分布于細(xì)胞間，部分細(xì)胞變形，但整體觀察ChAT陽性產(chǎn)物多于病證結(jié)合組，見圖4。SYP檢測：空白組可見復(fù)染細(xì)胞核排列整齊，SYP陽性產(chǎn)物多見于胞漿且均勻分布。AD組細(xì)胞出現(xiàn)核溶解現(xiàn)象，細(xì)胞核分布松散，SYP免疫陽性產(chǎn)物部分溶出，分布不均。病證結(jié)合組出現(xiàn)核深染與核固縮，基本不見完整細(xì)胞形態(tài)，SYP免疫陽性產(chǎn)物黃色區(qū)域基本不見。給藥組細(xì)胞核保留較多，SYP免疫陽性產(chǎn)

物部分分布于細(xì)胞間，部分細(xì)胞變形，但整體觀察SYP陽性產(chǎn)物明顯多于病證結(jié)合組，見圖5。

362平均截面積/A各組ChAT與SYP陽性反應(yīng)平均截面積/A見表7。與空白組比較，AD組的乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶免疫陽性神經(jīng)元細(xì)胞平均截面積/A均有明顯降低，且有顯著性差異（P<001）。與AD組比較，病證結(jié)合組乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶免疫陽性神經(jīng)元細(xì)胞平均截面積/A明顯減少（P<001）。與病證結(jié)合組比較，給藥組的乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶免疫陽性神經(jīng)元細(xì)胞平均截面積/A有所增加（P<001）。與空白組比較，AD組的突觸素陽性反應(yīng)產(chǎn)物平均截面積/A均有明顯降低（P<001）。與AD組比較，病證結(jié)合組突觸素陽性反應(yīng)產(chǎn)物平均截面積/A明顯減少（P<001）。與病證結(jié)合組比較，給藥組的突觸素陽性反應(yīng)產(chǎn)物平均截面積/A有所增加（P<001）。

4討論

王繪山等[11]研究表明從氨基酸序列以及分子

高級結(jié)構(gòu)上看，樹鼩的血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）與人有高度的相似性，基于VEGF進(jìn)化分析顯示，樹鼩與人的親緣關(guān)系較嚙齒目更近。因此以樹鼩作為老年性癡呆病與血瘀證的研究對象比大鼠、小鼠更有意義。根據(jù)2010年全國中西醫(yī)結(jié)合血瘀證及活血化瘀研究學(xué)術(shù)大會(huì)《血瘀證中西醫(yī)結(jié)合診療指南（修訂稿）》其中5個(gè)診斷標(biāo)準(zhǔn)：“舌質(zhì)暗紫或舌體瘀斑、瘀點(diǎn)，舌下靜脈曲張瘀血；面部、唇、齒齦及眼周紫黑；皮下瘀斑；固定性疼痛或刺痛、絞痛；精神異?！保菊n題篩選出與樹鼩相適應(yīng)的中醫(yī)表征——①舌質(zhì)暗紫、②鼻唇部黧黑、③足爪肌膚黯黑、④抓捕抵抗與疼痛抵抗、⑤精神萎靡、抱頭。其診斷方法類似于“四診”中的“望”。但采用人肉眼觀察難免有很大主觀性，難以令人信服，因此課題組自主設(shè)計(jì)了表征分析軟件，以圖像R，G，B為分析原理，將皮膚顏色具象為數(shù)據(jù)，可以進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。而抓捕抵抗與精神萎靡則通過特定動(dòng)作測試，計(jì)算每組出現(xiàn)規(guī)定動(dòng)作的動(dòng)物概率。關(guān)于動(dòng)物分組，實(shí)驗(yàn)前分組每組15只，由于三七總皂苷干預(yù)前對樹鼩造模，進(jìn)行了腦外科手術(shù)導(dǎo)致感染致一部分動(dòng)物死亡，而給藥組與病癥結(jié)合組動(dòng)物死亡較多，因此給藥組與病證結(jié)合組動(dòng)物數(shù)較少。

本實(shí)驗(yàn)中凝血4項(xiàng)、一氧化氮（NO）與超氧化物歧化酶（SOD）的含量檢測是用來判斷是否獲得血瘀證的輔助實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。凝血4項(xiàng)具體是指檢測PT，TT，APTT，F(xiàn)IB 4項(xiàng)凝血指標(biāo)，其中，PT是外源性凝血情況檢測中最常用的一種實(shí)驗(yàn)，可以對凝血因子Ⅱ，Ⅴ和Ⅶ，Ⅹ作出比較客觀的反應(yīng)；TT是對共同的凝血途徑及情況均能準(zhǔn)確反應(yīng)的試驗(yàn)，APTT是內(nèi)源性凝血情況檢測最常用的實(shí)驗(yàn)，可以對凝血因子Ⅷ，Ⅸ及Ⅺ，Ⅻ的活性作出反應(yīng)；FIB是一種急性時(shí)相的反應(yīng)蛋白，凝血功能亢進(jìn)，即高凝狀態(tài)時(shí)，F(xiàn)IB升高的幅度明顯[12]。NO是心血管系統(tǒng)重要的調(diào)節(jié)和保護(hù)因子，在血管內(nèi)皮細(xì)胞中由NOS催化L精氨酸生成，其本質(zhì)是一種反應(yīng)性極強(qiáng)的自由基，在體內(nèi)的半衰期僅1～5 s，產(chǎn)生后可迅速失去生理活性，在有氧條件下生成穩(wěn)定的代謝產(chǎn)物硝酸鹽和亞硝酸鹽。NO的血漿濃度水平，不但可以作為反映內(nèi)皮損傷狀況的可靠指標(biāo)，而且可作為反映心血管疾病輕重的有效指標(biāo)。將其引入中醫(yī)辨證，具有相對特異性。多數(shù)研究結(jié)果表明，NO與血瘀證關(guān)系密切。另有大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)[1314]，體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng)，清除氧自由基能力減弱，造成體內(nèi)自由基反應(yīng)紊亂，可導(dǎo)致微循環(huán)障礙、血瘀證。因此，檢測血清中SOD的活力可以側(cè)面反映血瘀證的程度以及血管內(nèi)皮損傷程度。研究結(jié)果顯示，空白組、AD組、病證結(jié)合組的PT，TT，APTT依組間順序減少，而FIB依組間順序增高，NO含量、SOD活力水平逐漸降低，說明老年性癡呆造模會(huì)引起一定的血液高凝狀態(tài)與血管內(nèi)皮損傷，而附加的血瘀證引導(dǎo)證型會(huì)增加血液的高凝狀態(tài)的程度。在這一方面可以看到，老年性癡呆與血瘀證是有內(nèi)在聯(lián)系的。給藥組的PT，TT，APTT均較病證結(jié)合組升高，且FIB減少，NO含量與SOD活力均較病證結(jié)合組上升，證明三七總皂苷對AD血瘀證病證結(jié)合有一定療效。

目前研究表明，β淀粉樣蛋白（βamyloid protein，Aβ）毒性作用被認(rèn)為是AD發(fā)病的中心環(huán)節(jié)。Aβ是由分泌酶（secretase）水解淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）生成的。分泌酶有α，β和γ 3種，由αsecretase水解APP所產(chǎn)生的sAPPα是可溶性無毒物質(zhì)，具有營養(yǎng)神經(jīng)的作用；而由βsecretase水解APP所產(chǎn)生的sAPPβ，再經(jīng)γsecretase水解生成可溶性Aβ，可溶性Aβ并無神經(jīng)毒性，但其結(jié)構(gòu)異常（如β折疊）則可變成具有神經(jīng)毒性不可溶的沉淀Aβ。Aβ大部分是含40個(gè)氨基酸殘基的Aβ140，而只有小部分是含42個(gè)殘基的變異體Aβ142。Aβ142變異體比Aβ140疏水性更強(qiáng)，更易形成纖維化和沉淀。Aβ沉積造成膽堿能神經(jīng)細(xì)胞損傷、膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶（choline acetyltransferase，ChAT）水平下降和乙酰膽堿遞質(zhì)合成不足[1517]，以及調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)釋放的遞質(zhì)囊泡膜蛋白突觸素（synapsin）水平下降[18]從而影響遞質(zhì)釋放，最終導(dǎo)致記憶減退和行為異常。本實(shí)驗(yàn)以Western blot檢測了各組樹鼩大腦組織中的Aβ142，APP及PTau蛋白，其能有效反映樹鼩大腦淀粉樣蛋白沉積程度以及老年斑形成程度；以免疫組化法研究了各組樹鼩大腦皮質(zhì)細(xì)胞ChAT與SYP含量。

研究表明，病證結(jié)合組樹鼩的足爪、鼻唇部皮膚、舌底顏色較AD組明顯加深，符合血瘀證診斷標(biāo)準(zhǔn)；而給藥組足爪、鼻唇部皮膚、舌底顏色有好轉(zhuǎn)趨勢，逐漸向肉色恢復(fù)。病證結(jié)合組抓捕抵抗概率與抱頭概率均較AD組出現(xiàn)一定概率的基礎(chǔ)上明顯升高，符合血瘀證診斷標(biāo)準(zhǔn)；而給藥組較病證結(jié)合組明顯降低，總體說明了該表征采集方法的穩(wěn)定性?？瞻捉M、AD組、病證結(jié)合組的PT，TT，APTT依組間順序減少，而FIB依組間順序增高，NO含量、SOD活力水平逐漸降低，說明老年性癡呆造模會(huì)引起一定的血液高凝狀態(tài)與血管內(nèi)皮損傷，而附加的血瘀證引導(dǎo)證型會(huì)增加血液的高凝狀態(tài)的程度。在這一方面可以看到，老年性癡呆與血瘀證是有內(nèi)在聯(lián)系的。給藥組的PT，TT，APTT均較病證結(jié)合組升高，且FIB減少，NO含量與SOD活力均較病證結(jié)合組上升，證明三七總皂苷對AD血瘀證病證結(jié)合有一定療效。與空白組相比，AD組樹鼩大腦中NE，Aβ142，APP及PTau含量降低，ChAT及SYP的平均陽性截面積/A降低，病證結(jié)合造模使這一降低加重，而三七總皂苷給藥緩解了這一變化，側(cè)面證明了AD血瘀證病證結(jié)合樹鼩模型的穩(wěn)定性。通過以上指標(biāo)變化也顯示，老年性癡呆病與血瘀證存在機(jī)制上的聯(lián)系，但確切機(jī)制是什么，需要進(jìn)一步的探索。

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