肝、腎機(jī)械灌注保存技術(shù)進(jìn)展

史源，沈中陽 （天津市第一中心醫(yī)院器官移植中心，天津市器官移植臨床醫(yī)學(xué)研究中心，衛(wèi)生部危重病急救醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300192）

器官移植是目前治療終末期器官衰竭最為有效的手段［1］。作為器官移植發(fā)展里程碑的靜態(tài)冷保存（static cold storage， SCS）技術(shù)的迅速發(fā)展，極大地推動(dòng)了器官移植事業(yè)的進(jìn)步。SCS技術(shù)仍是現(xiàn)在器官保護(hù)最常用的技術(shù)，為全球多數(shù)器官移植中心廣泛使用。UW液和HTK液是目前國際上應(yīng)用最廣泛的冷保存液。由于目前供體器官短缺形勢嚴(yán)峻，以及國內(nèi)供體器官捐獻(xiàn)數(shù)量迅速增加，出現(xiàn)越來越多的邊緣供體。導(dǎo)致術(shù)后早期移植物功能不良（delayed graft function，DGF）、原發(fā)性無功（primary nonfunction， PNF）及膽道并發(fā)癥明顯增多［2-6］。SCS技術(shù)已經(jīng)無法滿足臨床需要，理想的器官保存方式應(yīng)該包括功能評(píng)估及修復(fù)，以期提高器官利用率。

目前，器官捐獻(xiàn)供體評(píng)估主要依靠：供體年齡、體重、肝臟酶學(xué)指標(biāo)、膽紅素水平、肝臟影像學(xué)檢查、血清鈉、血清肌酐（serum creatinine，Scr）、重癥監(jiān)護(hù)病房（intensive care unit，ICU） 停留時(shí)間、冷熱缺血時(shí)間及病理學(xué)檢查如脂肪變性等參數(shù)綜合評(píng)價(jià)。熱缺血時(shí)間是衡量熱缺血損傷最直接的標(biāo)志。熱缺血時(shí)間延長會(huì)繼發(fā)術(shù)后移植物失功和肝移植后膽道狹窄等并發(fā)癥，故器官獲取時(shí)須盡量減少熱缺血時(shí)間。目前，熱缺血時(shí)間普遍定義為從功能性熱缺血收縮壓持續(xù)（至少2分鐘）＜50 mmHg（1mmHg＝0.133 kPa）或血紅蛋白氧飽和度低于70%開始直至冷保存液開始灌洗。各個(gè)器官對(duì)熱缺血時(shí)間耐受程度略有不同，一般認(rèn)為供肝＜30分鐘，供腎＜60分鐘。

機(jī)械灌注（machine perfusion， MP）技術(shù)最早由Lindbergh及Carrel于20世紀(jì)30年代提出［7-8］。30年后在Belzer與Starzl的推動(dòng)下，臨床上出現(xiàn)了利用血漿及含紅細(xì)胞循環(huán)液的低溫機(jī)械灌注（hypothermic machine perfusion，HMP）技術(shù)［9-14］。近年來，由于器官短缺形勢嚴(yán)峻及邊緣供體增加，MP技術(shù)再次成為研究熱點(diǎn)，不同于SCS，MP技術(shù)通過連續(xù)動(dòng)態(tài)灌注輸送養(yǎng)分供給，在實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)評(píng)估器官活力的同時(shí)，同步實(shí)現(xiàn)器官保存與修復(fù)。該項(xiàng)技術(shù)對(duì)延長器官的保存時(shí)限，改善器官質(zhì)量具有重要價(jià)值，有助于提高器官利用率。但MP受壓力、灌流速度、氧合情況等參數(shù)綜合影響，其廣泛應(yīng)用還需大樣本量、多中心的臨床驗(yàn)證。

1 不同類型的機(jī)械灌注保存技術(shù)

在MP保存期間，機(jī)械泵將循環(huán)液（無細(xì)胞類型含血液成分）及營養(yǎng)底物經(jīng)器官脈管系統(tǒng)持續(xù)泵入，可以經(jīng)歷氧合或無氧合，接近生理狀態(tài)。溫度控制裝置則維持局部溫度，根據(jù)灌注過程中維持溫度不同，可以分為HMP、亞低溫機(jī)械灌注（midthermic machine perfusion， MTMP）、亞常溫機(jī)械灌注（subnormothermic machine perfusion，SNMP）和常溫機(jī)械灌注（normothermic machine perfusion， NMP），其各自維持的溫度為4～10℃、10～20℃、20～25℃、35～38℃。根據(jù)是否攜氧可分為攜氧灌注系統(tǒng)與非攜氧灌注系統(tǒng)。目前，低溫非攜氧機(jī)械灌注有LifePort肝臟修復(fù)系統(tǒng) （Organ Recovery Systems， Zaventem， 比 利時(shí)），常溫?cái)y氧機(jī)械灌注有Organ Ox（Organ Ox Ltd，Oxford，英國）系統(tǒng)及多功能機(jī)械灌注Liver Assist系統(tǒng)（Organ Assist BV，Gronigen，荷蘭），多處于前臨床階段，國內(nèi)相關(guān)設(shè)備尚處于研發(fā)階段。

HMP可以降低器官代謝速率，降低缺血損害。主要利用無細(xì)胞成分的循環(huán)液，主要使用UW-MP或者KPS機(jī)械型保存液。其核心技術(shù)在于壓力控制，而非流量控制，因?yàn)榈蜏丨h(huán)境下，微循環(huán)毛細(xì)血管床收縮，較高壓力波動(dòng)直接損害器官［15-17］。因此，腎臟低溫灌注壓力維持在25 ～ 30mmHg為佳［18-19］。肝臟也是如此，低溫灌注時(shí)，門靜脈壓力維持在3 ～ 5mmHg為宜［20-21］。雖然蘇黎世大學(xué)提出單獨(dú)門靜脈灌注技術(shù)，但是尚存爭議，肝動(dòng)脈及門靜脈雙重灌注有助于降低術(shù)后膽道并發(fā)癥［22］。因?yàn)閮H肝動(dòng)脈供應(yīng)膽道周圍血管叢，因此應(yīng)該進(jìn)行雙重灌注。

與HMP相比，NMP最接近生理狀態(tài)的局部環(huán)境，可以實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)判斷器官活力，而且具有損傷修復(fù)功能。一般腎動(dòng)脈灌注壓力為70～85mmHg［23-24］，肝動(dòng)脈灌注壓力60～105 mmHg［25-26］。較之流量控制，壓力控制技術(shù)可以更好地保護(hù)腎小球功能及結(jié)構(gòu)。SNMP灌注技術(shù)不僅可以避免低溫?fù)p害，而且代謝速率較NMP緩慢，含紅細(xì)胞及無細(xì)胞循環(huán)液均適用。腎動(dòng)脈灌注溫度為40 mmHg［27］，肝動(dòng)脈25 ～ 70 mmHg，門靜脈 4 ～ 8 mmHg［28］。而控制性氧合復(fù)溫是指將低溫獲取的器官由低溫環(huán)境緩慢向20℃過渡，避免突然地溫度改變，避免“熱休克”，減少線粒體損傷［29］，改善組織能量供應(yīng)。

2 肝臟常溫機(jī)械灌注保存技術(shù)

目前供肝短缺問題日益加劇，但是由于邊緣供體增加，實(shí)際利用率較低，許多供肝遭遇廢棄。2014-2015年，英國1 282例供體中，僅924例（占72%）適合移植，而僅812例（占63%）最后接受了移植。美國同期僅78%（6 312/8 144）的供肝接受了移植，而同期有3 200例患者死亡或錯(cuò)過移植機(jī)會(huì)［30-32］。傳統(tǒng)單純低溫保存技術(shù)已經(jīng)無法滿足保存邊緣供肝的實(shí)際需求。

2.1 NMP技術(shù)保存的臨床研究:英國伊麗莎白女王醫(yī)院嘗試將廢棄肝臟經(jīng)NMP裝置修復(fù)評(píng)估后重新移植。該研究首次報(bào)道經(jīng)過NMP裝置修復(fù)并評(píng)估的臨床廢棄肝臟，重新接受移植。評(píng)估方案包括灌注液分析、膽汁生成、血流及大致外觀。在此之前，供肝均經(jīng)歷不同時(shí)間的低溫保存。4個(gè)心臟死亡器官捐獻(xiàn)（donation after cardiac death，DCD）供肝因熱缺血時(shí)間過長而被棄用，1個(gè)腦死亡器官捐獻(xiàn)（donation after brain death，DBD）供肝因肝功能異常而被棄用。平均保存時(shí)間為798分鐘（725～951分鐘）。移植過程均平穩(wěn)。受者平均住院時(shí)間為10天（6～14天）。至今為止，在平均7個(gè)月（6～19個(gè)月）的隨訪時(shí)間內(nèi)，受者肝功能均處于正常水平。由此可見，邊緣供體接受常溫機(jī)械灌注裝置的活力評(píng)估，可將供肝原發(fā)性無功的風(fēng)險(xiǎn)降至最低，有效提高利用率［33］。牛津大學(xué)開展了NMP保存供肝的臨床一期實(shí)驗(yàn)，利用NMP運(yùn)輸保存供肝后接受移植。在臨床一期實(shí)驗(yàn)中，供肝獲取均為標(biāo)準(zhǔn)流程，獲取后連接到NMP裝置，運(yùn)輸至受體所在醫(yī)院。實(shí)驗(yàn)組為NMP保存運(yùn)輸?shù)墓└?，?duì)照組為低溫保存的，1：2配比。結(jié)果有20例患者接受NMP運(yùn)輸保存后的供肝，NMP平均保存時(shí)間9.3小時(shí)（3.5～18.5小時(shí)），對(duì)照組低溫保存平均時(shí)間8.9小時(shí)（4.2～11.4小時(shí)）。肝移植術(shù)后兩組移植肝30天生存率近似（100%比97.5%，P＝1.00）。術(shù)后7天內(nèi)天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶 （aspartate transaminase， AST）平均峰值NMP組明顯低于對(duì)照組，417 U（84～4 681 U）比902 U（218～8 786 U），P＝0.03。這是世界上首次報(bào)道NMP運(yùn)輸保存后的供肝接受肝移植，驗(yàn)證其安全性及可行性。NMP對(duì)于提高供體肝臟利用率，改進(jìn)移植肝功能具有一定意義［34］。

使用NMP保存廢棄人體肝臟，最長保存時(shí)間可達(dá)24小時(shí)。牛津大學(xué)報(bào)道使用NMP技術(shù)成功保存廢棄人體供肝24小時(shí)。共有13例廢棄人體供肝納入實(shí)驗(yàn)。灌注裝置自動(dòng)控制，循環(huán)液含紅細(xì)胞，經(jīng)過氧合。灌注裝置的溫度、壓力、流量及氧氣流量均可自動(dòng)調(diào)整。所有供肝均灌注保存24小時(shí)，監(jiān)測分析肝功能及供肝病理。供肝根據(jù)供體病史、獲取情況及肉眼情況進(jìn)行預(yù)期活力分層。結(jié)果證實(shí)，24小時(shí)的NMP保存具有可行性，廢棄肝臟可依據(jù)代謝及合成功能進(jìn)行活力評(píng)估，經(jīng)過NMP灌注保存后，具有重新移植的可行性。因此，NMP灌注保存時(shí)限可達(dá)24小時(shí)。潛在益處不僅限于活力評(píng)估 （可付諸臨床實(shí)踐），還可延長邊緣供肝保存時(shí)間，缺血及其他損傷的恢復(fù)（為NMP期間治療提供可能）［35］。

2.2 NMP技術(shù)對(duì)于供肝減體積過程中保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究：天津市第一中心醫(yī)院報(bào)道了NMP技術(shù)在供肝減體積移植（reduced-size liver transplantation，RSLT）過程中的保護(hù)作用。選用24只健康的體重為25 ～ 35 kg的巴馬小型豬作為研究對(duì)象，隨機(jī)分為兩組：A組（NMP組）供肝未經(jīng)歷熱缺血，快速連接至NMP系統(tǒng)，在此環(huán)境中進(jìn)行減體積手術(shù)操作；B組（UW液低溫保存組）供肝同樣未經(jīng)歷熱缺血，獲取后單純低溫保存在UW液中，進(jìn)行減體積手術(shù)操作。減體積后供肝進(jìn)行無靜脈轉(zhuǎn)流條件下的肝移植手術(shù)，記錄一般情況，減體積手術(shù)數(shù)據(jù)，觀察術(shù)后肝功能，移植肝病理等。結(jié)果表明，兩組術(shù)中出血量存在顯著性差異（P＜0.05），術(shù)后3天及5天，A組血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、AST及乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）水平顯著低于B組（P＜0.05），術(shù)后2天及5天，A組血清乳酸水平明顯低于B組（P＜0.05）。移植肝病理提示，A組肝細(xì)胞壞死明顯減輕，肝竇及內(nèi)皮細(xì)胞完整性優(yōu)于B組。因此，NMP對(duì)于減體積手術(shù)操作過程中的供肝具有一定保護(hù)作用［36］。

2.3 對(duì)膽道損傷的保護(hù)作用:對(duì)于DCD供體而言，膽道并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)較高，常溫機(jī)械灌注技術(shù)與低溫保存相比，可以減少膽道損傷，格羅寧根大學(xué)Sanna教授等分別使用NMP及低溫保存，保存大鼠DCD供肝及非DCD供肝3小時(shí)，結(jié)果證實(shí)，DCD供肝開放后NMP組膽道損傷標(biāo)志物γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶及乳酸脫氫酶水平明顯低于低溫保存組，NMP組膽汁碳酸氫鹽水平（反映膽道上皮功能）是低溫組的2倍。投射電鏡及掃描電鏡結(jié)果均提示NMP組膽道上皮受損明顯減輕，因此，與低溫保存相比，NMP為膽道提供形態(tài)及功能的雙重保護(hù)作用［37］。

Liu等［38］使用NMP技術(shù)保存熱缺血60分鐘的DCD豬肝，10小時(shí)的保存過程中NMP組灌注參數(shù)穩(wěn)定，再開放后，NMP組較UW液保存組膽汁量明顯增加，轉(zhuǎn)氨酶水平較低，病理提示肝實(shí)質(zhì)及膽道上皮損傷明顯減輕，Ki67免疫組化染色提示肝外膽道上皮再生明顯，這些均提示NMP保存對(duì)DCD供肝具有一定膽道保護(hù)作用。

2.4 對(duì)脂肪肝修復(fù)作用：Okamura等［39］使用SNP裝置對(duì)50%以上的大鼠脂肪供肝進(jìn)行灌注保存4小時(shí)，并與HTK液單純低溫保存進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果模擬開放后，SNP組不僅丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶水平明顯降低，而且谷氨酸脫氫酶亦明顯降低。而且門靜脈壓力、肝組織三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）含量、膽汁量、高遷移率族蛋白B1（high mobility group box， HMGB-1）水平等指標(biāo)均明顯優(yōu)于其他組。電鏡檢查提示，竇狀隙微循環(huán)及肝細(xì)胞線粒體損傷均明顯減輕。這些均反映了MP保存技術(shù)對(duì)于脂肪供肝的保護(hù)作用。Jamieson等［40］亦報(bào)道了機(jī)械灌注保存技術(shù)對(duì)于豬脂肪肝保護(hù)作用，在60小時(shí)保存過程中，脂肪變性程度減少，肝臟質(zhì)量改善。

2.5 供體器官嚴(yán)重感染的治療：多倫多大學(xué)利用肺常溫機(jī)械灌注裝置（ex vivo lung perfusion，EVLP）治療因感染遭廢棄的肺臟，實(shí)驗(yàn)組使用大劑量抗菌藥物（400 mg環(huán)丙沙星或500 mg阿奇霉素，15 mg/kg萬古霉素，2 g美羅培南） 保存治療12小時(shí)，對(duì)照組未給與抗菌藥物保存12小時(shí)。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組支氣管肺泡灌洗菌落計(jì)數(shù)明顯減少，內(nèi)毒素水平明顯下降，移植后受體氧合明顯改善，肺血管阻力明顯降低。那么肝臟NMP技術(shù)是否可參考借鑒呢［41］？

3 腎臟常溫機(jī)械灌注保存技術(shù)

腎臟HMP主要包括：Life port腎臟修復(fù)系統(tǒng)、脈沖式灌注泵系統(tǒng)（RM3，WatersMedical Systems，Minneapolis， MN，美國）和 Kidney Assist 設(shè)備（Organ Assist BV Gronigen，荷蘭）。自HMP問世以來，腎臟保存方式的選擇一直是爭論焦點(diǎn)。理論上，HMP具有保持血管通暢、提供部分能量和氧氣、清除代謝廢物等優(yōu)勢。低溫?zé)o氧機(jī)械灌注，在較低的25 ～ 30 mmHg灌注壓力下，已經(jīng)被證實(shí)可減少DGF發(fā)生率，提高移植物生存率［42］。根據(jù)一項(xiàng)大規(guī)模隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)證實(shí)，與低溫靜態(tài)保存相比，LifePort可以降低術(shù)后DGF發(fā)生率，提高移植物存活率，特別對(duì)于邊緣供腎［43-44］。該裝置利用滾軸泵，產(chǎn)生持續(xù)脈沖式灌注壓力。大量基礎(chǔ)與臨床研究結(jié)果顯示，無氧HMP可顯著降低腎移植術(shù)后DGF的發(fā)生，減少受者住院費(fèi)用并減輕醫(yī)療痛苦與負(fù)擔(dān)，然而DGF的發(fā)生與受者長期生存時(shí)間無直接相關(guān)。盡管阻力指數(shù)、灌注液損傷標(biāo)志物是術(shù)后DGF的危險(xiǎn)因子，但是無法預(yù)測術(shù)后生存率，無法準(zhǔn)確提供是否廢棄的依據(jù)［45-46］。

腎臟HMP液主要為KPS-1（kidney preservation solution，UW-G）液和HTK液。KPS-1液為國際公認(rèn)的規(guī)范且標(biāo)準(zhǔn)的腎臟機(jī)械灌注液，在國內(nèi)也得到廣泛使用。灌注壓、流量、阻力指數(shù)和溫度是腎臟低溫機(jī)械灌注系統(tǒng)主要參數(shù)，可作為評(píng)價(jià)供腎質(zhì)量的部分依據(jù)。LifePort溫機(jī)械灌注中，高阻力指數(shù)為腎臟質(zhì)量低的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，單腎灌注壓為30～50 mmHg的情況下，灌注流量應(yīng)至少大于40 ml/min；高灌注壓較低灌注壓有可能對(duì)腎臟產(chǎn)生灌注損傷。有研究結(jié)果表明，腎臟平均流量大于156 ml/min，阻力系數(shù)小于 0.27 mmHg/（ml.min）時(shí)（按100 g腎臟質(zhì)量計(jì)算）可能提示移植腎術(shù)后無DGF的發(fā)生。但是，不能單純依據(jù)這些參數(shù)決定供腎的使用或廢棄，應(yīng)結(jié)合臨床綜合考慮［47］。盡管HMP修復(fù)移植腎臟機(jī)制尚未完全明晰，但諸多研究結(jié)果證實(shí)，在灌注充分的情況下（流量、阻力指數(shù)符合標(biāo)準(zhǔn)，灌注參數(shù)穩(wěn)定），盡量減少冷缺血時(shí)間及灌注壓力對(duì)移植腎術(shù)后功能恢復(fù)有積極作用。

劍橋大學(xué)將臨床廢棄供腎，經(jīng)過體外常溫機(jī)械灌注（ex vivo normothermic perfusion，EVNP）修復(fù)評(píng)估后成功接受移植。供者為35歲男性，因心臟死亡后，獲取供腎明顯灌注不均，微血栓形成面積較大，反復(fù)沖洗無明顯改善，因此雙腎均遭棄用。供腎經(jīng)過60分鐘 EVNP修復(fù)，使用氧合的紅細(xì)胞為主的循環(huán)液，在35.2℃條件下。EVNP過程中，供腎灌注不均之處均消失。100 g左腎平均血流量及尿量為68.0 ml/min及560 ml，右腎為59.9 ml/min及430 ml?；贓VNP灌注參數(shù)，雙腎均適合移植。在腎移植后，兩個(gè)供腎均未出現(xiàn)相關(guān)并發(fā)癥，移植腎功能良好，術(shù)后3個(gè)月左腎血肌酐水平106.08μmol/L，右腎143.21μmol/L。因此，EVNP技術(shù)可用于評(píng)估、挽救修復(fù)臨床廢棄腎臟［18］。

綜上所述，肝、腎機(jī)械灌注保存技術(shù)通過提供氧氣、血液供應(yīng)及能量供應(yīng)，不僅可以在保存器官的同時(shí)進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)的活力監(jiān)測，更重要的是可以進(jìn)行受損器官的進(jìn)行修復(fù)，但是具體修復(fù)機(jī)制尚未明確，可以通過添加特定藥物（例如抗感染治療、溶栓治療等）、基因修飾或者干細(xì)胞治療提高修復(fù)效果，提高器官利用率及安全性。此外，器官機(jī)械灌注裝置還應(yīng)考慮便攜性、通用型及穩(wěn)定性，以及中國器官捐獻(xiàn)的具體情況。

縱觀機(jī)械灌注保存機(jī)器或技術(shù)，可分為6個(gè)評(píng)估層次：保存、運(yùn)輸、活力評(píng)估、修復(fù)、基因或干細(xì)胞等治療、多器官通用便攜，目前世界上尚未出現(xiàn)同時(shí)滿足這些要求的機(jī)器，我們需更加努力研究國產(chǎn)的保存機(jī)器，提高保存質(zhì)量，提高器官移植患者的安全性及預(yù)后，推動(dòng)中國器官移植的持續(xù)發(fā)展。