新型常溫機械灌注裝置保存豬DCD供腎的實驗研究

史源，宋文利，陳靜，鄭虹，沈中陽（天津市第一中心醫(yī)院器官移植中心，天津市器官移植臨床醫(yī)學(xué)研究中心，衛(wèi)生部危重病急救醫(yī)學(xué)重點實驗室,天津 300192）

目前，腎臟移植已成為治療終末期腎病的主要手段，由于供體的嚴(yán)重短缺，在現(xiàn)有的法律法規(guī)條件下，越來越多的心臟死亡器官捐獻（donation after cardiac death，DCD）應(yīng)用于臨床［1-3］。但是，對于經(jīng)歷了較長熱缺血時間的DCD供腎而言，腎移植術(shù)后原發(fā)性移植物無功能（primary graft nonfunction，PNF）、移植物功能延遲恢復(fù)（delayed graft function，DGF）等發(fā)生率均明顯增加［3-7］，目前常用的UW液單純低溫保存方法已不能滿足臨床需求，而活力判斷主要依靠臨床評分、活檢組織學(xué)檢查、低溫機械灌注參數(shù)等［7-10］。常溫機械灌注（normothermic machine perfusion，NMP）可以更好地模擬供腎的生理條件，維持腎臟組織正常的生理機能及代謝環(huán)境。常溫機械灌注潛在的器官修復(fù)能力引起了許多人的關(guān)注［11］。本研究擬構(gòu)建新型NMP系統(tǒng)，利用豬自體腎移植模型，探討NMP對豬DCD供腎活力評估、減輕熱缺血損傷，改善供腎保存質(zhì)量的意義及其機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與分組：10只雄性巴馬小型豬（天津薊縣實驗動物基地提供），年齡8～12個月，體重30～40 kg，清潔飼養(yǎng)。術(shù)前24小時禁食，12小時禁水；隨機將實驗動物分為兩組：A組（NMP組，n＝5）：原位阻斷腎動脈模擬熱缺血，30分鐘后切取右側(cè)供腎，連接NMP保存裝置常溫保存8小時后，以4℃的HTK液沖洗后行自體腎移植術(shù)；B組（UW液組，n＝5）：原位阻斷腎動脈模擬熱缺血，30分鐘后切取右側(cè)供腎， 4℃UW低溫保存8小時，HTK液沖洗后行自體腎移植術(shù)。

本實驗所有過程中對巴馬小型豬的處置符合《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》要求。

1.2 實驗方法

1.2.1 麻醉方法：麻醉開始前15分鐘臀部肌肉注射氯胺酮10 mg/kg、地西洋0.4 mg/kg、阿托品0.03 mg/kg，進行基礎(chǔ)麻醉?；A(chǔ)麻醉后稱重，仰臥位固定，備皮，豬尾連接血氧飽和度探頭，胸前連接5導(dǎo)心電監(jiān)護，耳緣靜脈套管針建立靜脈通路。面罩吸純氧5分鐘，其后通過耳緣靜脈麻醉誘導(dǎo)；氣管插管，麻醉機維持麻醉，潮氣量10～12 ml/kg，呼吸頻率18～20次/分鐘，吸呼比（I/E）1：2，間斷靜脈注射維庫溴銨維持肌肉松弛。

1.2.2 術(shù)中監(jiān)護：麻醉成功后豬尾連接血氧飽和度探頭，胸前連接5導(dǎo)心電監(jiān)護，監(jiān)測心率（heart rate，HR）、脈搏、血氧飽和度（SpO2）及呼氣末二氧化碳分壓（PETCO2）。雙側(cè)頸部鋪巾，沿右鎖骨上3 cm，氣管旁3 cm縱行切口分離頸動外靜脈，解剖置管，分別建立有創(chuàng)動脈壓（invasive arterial blood pressure，IABP）、中心靜脈壓（central venous pressure，CVP）監(jiān)測及補液通路。術(shù)中間斷監(jiān)測動脈及靜脈血氣分析。置入氣囊導(dǎo)尿管計尿量。

1.2.3 供腎獲取及修整：取右側(cè)肋緣下切口，長度15～20 cm，逐層切開皮膚、皮下組織及肌層，注意避免損傷尿道，放置腹腔自動拉鉤，充分暴露手術(shù)野。開腹后以濕紗布墊保護腸管，鈍性分離腎周脂肪囊，插管引流后切斷，解剖出腎動脈及腎靜脈，注意變異腎動、靜脈保護。腎臟游離完畢后經(jīng)中心靜脈導(dǎo)管行全身肝素化（12 500 U），10分鐘后阻斷右腎動脈及腎靜脈， 4℃乳酸林格液快速灌注供腎，腎周置入冰屑協(xié)助腎臟快速降溫。待流出液清亮無血后換用4℃UW液（200 ml）繼續(xù)灌注。

1.2.4 受體手術(shù)：切口選擇和游離過程與供體手術(shù)基本一致。以阻斷鉗貼近腎門依次阻斷左側(cè)腎動脈、腎靜脈。修剪各血管斷端以備吻合。將供腎置入受體腹膜外，以腎袋及冰屑包裹，以6-0 Prolene線連續(xù)吻合腎動脈（圖1a），其后以6-0 Prolene線連續(xù)吻合腎靜脈（圖1b），打結(jié)時注意保留生長因子，嚴(yán)密監(jiān)測學(xué)流動力學(xué)變化，適當(dāng)補液以維持平均動脈壓（mean arterial pressure， MAP）不低于60 mmHg（1 mmHg＝0.133 kPa），一般情況下不需加用血管活性藥物。以7-0 Prolene線端端吻合重建輸尿管（圖1d）。確切止血并放置腎周引流管，逐層關(guān)腹。

1.2.5 術(shù)后管理：受體術(shù)后禁食48小時，自由進水。術(shù)后第1天開始每天靜脈給予頭孢呋辛鈉（0.75 g每12小時給藥一次）預(yù)防細(xì)菌感染治療3天，根據(jù)每天尿量調(diào)整補液量，術(shù)后第3天開始停止補液，實驗動物自由進食進水。

圖1 供腎灌注后（a）、腎動脈重建（b）及血流開放（c、d）

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析，所有定量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組樣本均數(shù)比較使用t檢驗及方差分析。計數(shù)資料比較使用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 手術(shù)基本情況及術(shù)后存活率（表1）：供體豬體重、受體豬體重、腎臟重量、實際熱缺血時間、實際保存時間、手術(shù)時間等各項指標(biāo)，兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

表1 兩組小型豬自體腎移植的基本情況

經(jīng)過30分鐘熱缺血后灌注，供腎顏色變深變暗且灌注不均勻（圖2a）， NMP保存的開始腎臟灌注亦不均勻，尤其外周部分顏色較暗，隨時間延長灌注效果很快改善，約60分鐘后腎臟顏色均勻一致，經(jīng)NMP保存8小時后以乳酸林格液沖洗供腎，腎臟顏色均勻一致（圖2b），行自體腎移植再灌注后腎臟顏色紅潤，灌注均勻（圖2c、圖2d）。

B組動物全部于術(shù)后72小時內(nèi)死亡，其中3只于術(shù)后48小時內(nèi)死亡，1只于術(shù)后70小時后死亡，1只存活超過5天，術(shù)后5天存活率為20%。A組動物存活均超過5天，術(shù)后5天存活率為100%，與B組相比存在顯著性差異（P＜0.05）。

圖2 a為熱缺血30分鐘后灌注的腎臟；b為NMP8小時的腎臟；c和d為A組再灌注后的腎臟

2.2 血清學(xué)檢查（表2）：開腹前，A組與B組動物血清肌酐（serum creatinine， SCr）水平均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。自體移植腎動脈開放后，兩組動物SCr水平均升高，而B組SCr水平較A組明顯升高，兩組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

表2 兩組之間Scr水平的比較

2.3 病理結(jié)果（圖3，圖4）：供腎熱缺血前呈正常組織結(jié)構(gòu)，熱缺血30分鐘后，腎小管呈中度水樣及空泡變性，可見腎小管灶性凝固性壞死。NMP組1～2小時后水樣及空泡變性明顯減輕，有一定程度恢復(fù)。3～8小時損傷加重不明顯，空泡變性輕度加重，腎小管無明顯改變。UW液低溫保存組1～2小時后水樣及空泡變性加重。3～8小時損傷加重明顯，出現(xiàn)彌漫性空泡變性及滴狀變性，出現(xiàn)腎小管擴張。

圖3 a為開腹后的腎臟；b為熱缺血30分鐘的腎臟（HE染色 低倍放大）

圖4 NMP修復(fù)（1～8 h）及UW低溫保存（1～8 h）病理結(jié)果（HE染色 低倍放大）

表3 腎動脈開放后1h腎組織TNF-α、Caspase-3、ET-1表達情況及TUNEL法凋亡檢測凋亡細(xì)胞陽性表達率（±s）

表3 腎動脈開放后1h腎組織TNF-α、Caspase-3、ET-1表達情況及TUNEL法凋亡檢測凋亡細(xì)胞陽性表達率（±s）

注：與B組相比，aP＜0.05；TNF-α為腫瘤壞死因子-α；Caspase-3為天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3；ET-1為內(nèi)毒素-1

組別 動物數(shù)（只） TNF-α（%） Caspase-3（%） ET-1（%） 凋亡細(xì)胞陽性表達率（%）A 組 5 18.1±4.3a 16.1±4.0a 15.3 ±3.9a 21.9±5.8a B 組 5 31.2±6.5 27.3±5.8 20.91±6.4 33.5±9.6

2.4 腎組織免疫組化（表3）：B組腎動脈開放后1小時腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的陽性表達率為（31.2±6.5）%，A組開放后1小時陽性表達率為（18.1±4.3）%，較B組明顯降低，兩組之間相比差異也有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。B組腎動脈開放后1小時天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3（cysteinyl aspartate specific proteinase-3， Caspase-3） 陽 性 表 達 率 為（27.3±5.8）%，A組開放后1小時陽性表達率為（16.1±4.0）%，較B組明顯降低，兩組之間相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。B組腎動脈開放后1小時內(nèi)毒素（endotoxin-1， ET-1）陽性表達率為（20.91±6.40）%，A組開放后1小時陽性表達率（15.3±3.9）%，較B組明顯降低，兩組差異也有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。腎動脈開放后1小時腎組織TUNEL法凋亡檢測再灌注后1小時腎組織TUNEL法凋亡檢測結(jié)果如表3所示， B組開放后1小時凋亡細(xì)胞陽性表達率為（33.5±9.6）%，A組開放后1小時凋亡細(xì)胞陽性表達率為（21.9±5.8）%，較B組明顯降低，兩組之間相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.5 血清細(xì)胞因子檢測（表4）：再灌注后血清中TNF-α、Caspas-3含量，A組均低于B組，兩組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表4 開放后6 h血清細(xì)胞因子的含量

3 討 論

3.1 DCD供腎活力評估：供腎質(zhì)量的判斷是DCD供腎腎移植的一個重要前提。判斷供腎質(zhì)量的方法主要包括：臨床評分、活檢組織學(xué)檢查、體外機器灌注的灌注參數(shù)和灌注液中腎臟損傷標(biāo)志物水平。臨床評分主要根據(jù)危險因素的多少來判斷，如年齡、高血壓病史、糖尿病病史、SCr水平等判斷。組織學(xué)檢查主要評估有無血栓形成、皮質(zhì)壞死和慢性病變，包括腎小球硬化、間質(zhì)纖維化、腎小管萎縮、動脈內(nèi)膜增厚和小動脈玻璃樣變。導(dǎo)致DCD供腎損傷的原因復(fù)雜，包括基礎(chǔ)疾病、腦死亡相關(guān)的器官損傷、心臟死亡后的熱缺血損傷、住院期間的腎損傷，如血容量不足引起的腎前性腎損傷、甘露醇腎損害和肌紅蛋白導(dǎo)致的腎小管阻塞等，各種腎損傷原因的疊加使得器官質(zhì)量判斷比較困難。而組織學(xué)檢查又經(jīng)常因為器官捐獻時間的不確定性變得難以常規(guī)進行。根據(jù)機器體外灌注的灌注參數(shù)判斷供腎質(zhì)量顯得很有價值。

3.2 NMP對DCD供腎的保護作用：NMP是在正常體溫的條件下保存供體器官，徹底改變了傳統(tǒng)低溫保存的理論［12］。與單純低溫保存不同，NMP在保存期間模擬器官的生理環(huán)境，維持細(xì)胞代謝，避免了缺血性損傷。實驗表明，NMP通過連續(xù)提供氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)恢復(fù)供能量儲備，逆轉(zhuǎn)熱缺血過程中ATP供應(yīng)中斷引起的損傷，而且可避免保存過程中細(xì)胞的進一步損傷。動物實驗表明，NMP對于DCD供腎具有明顯的修復(fù)作用，但是對供腎修復(fù)效果較差［13-16］。

本研究結(jié)果與文獻報道一致，相對于常規(guī)低溫保存，NMP對DCD供腎的保存具有明顯的優(yōu)勢。經(jīng)過30分鐘熱缺血和8小時保存后，NMP組和UW液組術(shù)后5天存活率分別為100%和20%，具有顯著差異。腎臟再灌注后NMP組SCr水平明顯低于UW液組，常規(guī)病理、免疫組化及TUNEL凋亡檢測也都表現(xiàn)出同樣的結(jié)果。上述結(jié)果說明，NMP可減輕豬DCD供腎的熱缺血損傷。

NMP技術(shù)不僅能改善能量供應(yīng)，提高三磷酸腺苷（adenosine triphosphate， ATP）含量，減輕腎組織水腫，而且可避免低溫導(dǎo)致腎臟損傷，減少TNF-α以及Caspas-3等炎癥因子的產(chǎn)生，改善微循環(huán)。從而減輕腎臟缺血/再灌注損傷。