維生素C對(duì)乳腺癌細(xì)胞紫杉醇化療的增敏作用

賈國(guó)叢，李陽，王堯河，常慶龍，陳雨婷 ，支慧娟

（1. 鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院 乳腺二科，河南 鄭州 450052；2. 鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)院，河南 鄭州 450052）

乳腺癌是女性常見腫瘤之一[1-2]，約占女性全身腫瘤的7%～10%，是30～59歲中國(guó)女性發(fā)病率第一的惡性腫瘤[3]。化療是乳腺癌的重要治療手段之一，但是許多患者在進(jìn)行化療時(shí)出現(xiàn)了惡心、脫發(fā)、感覺異常、骨髓抑制等化療反應(yīng)，這些副作用阻礙了臨床治療的進(jìn)行[4]，也同時(shí)加大了患者對(duì)化療的恐懼心理。據(jù)文獻(xiàn)[5]報(bào)道，維生素C（VitC）對(duì)腫瘤化療藥具有增敏的效應(yīng)，該效應(yīng)可以減少紫杉醇（paclitaxel，PTX）的用量以及化療反應(yīng)，同時(shí)可以提高化療藥物的療效，該效應(yīng)在乳腺癌中鮮有報(bào)道。本研究采用的實(shí)驗(yàn)材料是臨床上已經(jīng)確診為乳腺癌的癌組織，進(jìn)行體外培養(yǎng)[6]，來研究VitC對(duì)PTX的增敏效應(yīng)，進(jìn)一步探索臨床使用VitC對(duì)PTX提高療效降低毒副作用的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 腫瘤細(xì)胞 由鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院乳腺二科提供乳腺癌標(biāo)本。標(biāo)本收集已征得患者本人及家屬同意，符合醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)要求。

1.1.2 主要試驗(yàn)藥物及試劑 VitC購(gòu)自上海現(xiàn)代哈森（商丘）藥業(yè)有限公司；注射用紫杉醇購(gòu)自上海創(chuàng)諾制藥有限公司；DMEM培養(yǎng)基、FBS、胰酶、MTS、PMS均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Annexin V-FITC購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；Bax抗體和Bcl-2抗體均購(gòu)自美國(guó)BD公司；免疫印跡試劑盒購(gòu)于賽默飛世爾科技有限公司。

1.1.3 主要儀器 ELx808吸收光酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)伯騰儀器，MACSQuant流式細(xì)胞儀購(gòu)于廣州譽(yù)維生物科技儀器有限公司，多色Western blot分析儀購(gòu)于美國(guó)森西科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng) 取術(shù)中乳腺癌標(biāo)本用加有雙抗的PBS組織洗液清洗8～10次，用2把手術(shù)刀交叉相切將組織切碎，將碎組織移至含有DMEM培養(yǎng)基的膠原蛋白酶III中，放入氣浴恒溫振蕩器中振蕩40～60 min，隨后將消化的碎組織塊倒入200目的濾網(wǎng)中過濾，將過濾液體放入50 mL離心管中，放入離心機(jī)，800 r/min離心8 min，棄上清液，加入PBS，反復(fù)吹打，1 200 r/min離心5 min，棄上清加入DMEM培養(yǎng)基移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶。倒置顯微鏡下觀察，用反復(fù)貼壁法和低濃度消化法去除成纖維細(xì)胞和肌細(xì)胞，得到腫瘤細(xì)胞。細(xì)胞置于5%O2、5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將處于對(duì)數(shù)期的細(xì)胞以每孔約5 000個(gè)細(xì)胞鋪于96孔板中，每孔100 μL，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，設(shè)置空白組和對(duì)照組。放入細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后加藥。加藥方式如下：⑴ 不同濃度VitC單獨(dú)24 h；⑵ 不同濃度PTX單獨(dú)24 h；⑶ 不同濃度的VitC與一定濃度的PTX聯(lián)合24 h。兩種藥物單藥使用時(shí)設(shè)置9個(gè)等比的濃度梯度，VitC濃度為5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 23、0.078 1、0.039 0、0.019 5 mmol/L，PTX 濃 度 為 19、9.5、4.75、2.375、1.187、0.593、0.296、0.148、0.074 nmol/L， 聯(lián)合時(shí) PTX濃度為 19、9.5、4.75、2.375、1.187、0.593、0.296、0.148、0.074 nmol/L，VitC濃 度為1 mmol/L。IncuCyte Zoom?設(shè)置每2 h拍照1次，72 h后將96孔板取出后每孔加入MTS和PMS（20:1）混合液20 μL。培養(yǎng)箱靜置3 h后，酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處每孔的OD值（A490nm）。分別計(jì)算出VitC、PTX的IC50。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取3次的平均值為實(shí)驗(yàn)結(jié)果。腫瘤細(xì)胞增殖抑制率=（細(xì)胞對(duì)照組OD值A(chǔ)490nm-實(shí)驗(yàn)對(duì)照組OD值A(chǔ)490nm）/（細(xì)胞對(duì)照組OD值A(chǔ)490nm-空白對(duì)照組OD值A(chǔ)490nm）×100%。按照金氏修正公式計(jì)算q值，公式為q=E（A+B）/（EA+EB-EA×EB）。E（A+B）為兩種藥物聯(lián)合使用的效應(yīng)，EA為A藥單用的效應(yīng)EB為B藥單用的效應(yīng)。分子為實(shí)測(cè)合并效應(yīng)，分母為預(yù)測(cè)合并效應(yīng)。如果q值為0.85～1.15之間則表明藥效單純疊加，1.15～20說明藥物之間有協(xié)同效應(yīng)，＜1.15說明藥物之間有拮抗作用。

1.2.3 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)期增長(zhǎng)的細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后以每孔1×105細(xì)胞鋪于12孔板中，待置于5%CO2，37 ℃的培養(yǎng)箱中24 h后分為對(duì)照組，高、中、低濃度（2、1、0.5 mmol/L）VitC組，PTX（4 nmol/L）組，PTX（4 nmol/L）聯(lián)合VitC（2、1、0.5 mmol/L）組，每組3個(gè)復(fù)孔。待同步細(xì)胞周期加藥48 h，用不含EDTA的胰酶消化后，1 200 r/min離心5 min收集細(xì)胞。按照試劑盒說明書步驟依次加入FITC和PI混勻后避光室溫下反應(yīng)10 min后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 Western blot檢測(cè)增殖和凋亡相關(guān)蛋白 乳腺癌原代細(xì)胞培養(yǎng)24 h后等待同步細(xì)胞周期，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加藥：對(duì)照組，PTX（4 nmol/L）組，PTX（4 nmol/L）聯(lián)合VitC（2、1、0.5 mmol/L）組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。按照試劑盒說明書提取總蛋白，加入裂解液，12 000 r/min、4 ℃、離心5 min，移取上清液。10%SDS-PAGE凝膠電泳（80 V 25～35 min后調(diào)整至120 V電泳1～1.5 h），將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至NC膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，PBS沖洗3次。將抗體caspase-3和Bcl-2抗體稀釋至0.1 μg/mL后加到NC膜正面，4 ℃冰箱過夜。之后加入1:4 000稀釋的紅色熒光標(biāo)記的羊抗兔IgG，室溫反應(yīng)2 h，PBS沖洗3次。以β-actin為內(nèi)參，Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)掃描結(jié)果并使用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參灰度比值來表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

圖1 乳腺癌細(xì)胞原代培養(yǎng)（×40） A：培養(yǎng)48 h；B：培養(yǎng)3 d；C：培養(yǎng)5 d；D：培養(yǎng)7 dFigure1 Primary culture of breast cancer cells (×40) A: Cultured for 48 h; B: Cultured for 72 h; C: Cultured for 3 d; D: Cultured for 7 d

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果

48 h后觀察細(xì)胞，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，并見有成纖維細(xì)胞和肌細(xì)胞生長(zhǎng)。待72 h后采用差速貼壁法去除成纖維細(xì)胞和肌細(xì)胞。等細(xì)胞長(zhǎng)滿后傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)3～7 d傳至3代以后。乳腺癌細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)不一，成纖維細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形易于區(qū)分（圖1）。

2.2 VitC和PTX單藥及聯(lián)合對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖抑制作用

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出，PTX單獨(dú)用藥對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖抑制呈藥物濃度依賴性，IC50=8.6 nmol/L；VitC單獨(dú)用藥藥物濃度＞1.25 mmol/L時(shí)對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖抑制呈濃度相關(guān)性，濃度＜1.25 mmol/L抑制率大幅度降低且無濃度相關(guān)性，IC50=2.5 mmol/L；VitC和PTX聯(lián)合用藥對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖抑制呈藥物濃度依賴性（圖2），IC50=2.8 nmol/L。VitC聯(lián)合PTX組的增值抑制率均大于同濃度單用PTX組。VitC濃度為1 mmol/L時(shí)的有效抑制率為3%，PTX單用藥濃度分別為0.004 75 μmol/L、0.002 3 μmol/L、0.001 18 μmol/L時(shí)的有效抑制率為55%、45%、29%，VitC濃度為1 mmol/L分別與濃度為0.004 75、0.002 37、0.001 18 μmol/L的PTX聯(lián)合用藥時(shí)的增值抑制率為82%、67%、50%，按金氏公式計(jì)算q值分別為1.37、1.36、1.52。以上濃度依賴聯(lián)合實(shí)驗(yàn)q值均＞1.15，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示VitC對(duì)PTX有增敏效應(yīng)。

圖2 PTX和VitC單藥及聯(lián)合對(duì)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用 A：不同濃度的VitC單藥；B：不同濃度的PTX單藥；C：不同濃度的PTX聯(lián)合1 mmol/L VitCFigure 2 Inhibitory effects of PTX and VitC alone and combination on growth of breast cancer cells A: Different concentrations of VitC; B: Different concentrations of PTX; C: Different concentrations of PTX plus 1 mmol/L VitC

2.3 VitC聯(lián)合PTX對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響

VitC低濃度（0.5 mmol/L）組與對(duì)照組相比較，凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但中（1 mmol/L）、高濃度（2 mmol/L）組凋亡率高于對(duì)照組（均P＜0.05）。PTX組和VitC聯(lián)合PTX組與對(duì)照組相比較，凋亡率均明顯升高，且VitC聯(lián)合PTX組凋亡率明顯高于PTX組（均P＜0.05）（表1）（圖3）。

2.4 檢測(cè)增殖和凋亡相關(guān)蛋白

PTX單藥及聯(lián)合不同濃度VitC作用后乳腺癌細(xì)胞caspase-3和Bcl-2蛋白的表達(dá)。乳腺癌細(xì)胞經(jīng)PTX單藥及與不同濃度的VitC聯(lián)合作用，隨著VitC濃度的增加凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達(dá)逐漸降低，凋亡促進(jìn)蛋白caspase-3的表達(dá)逐漸升高。PTX單藥、PTX+0.5 mmol/L VitC組、PTX+VitC 1 mmol/L組、PTX+VitC 2 mmol/L組與空白對(duì)照組比較蛋白相對(duì)表達(dá)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）（圖4）。

表1 各組乳腺癌細(xì)胞的凋亡率（±s）Table 1 The apoptosis rates of each group of breast cancer cells(±s)

表1 各組乳腺癌細(xì)胞的凋亡率（±s）Table 1 The apoptosis rates of each group of breast cancer cells(±s)

組別 凋亡率（%）對(duì)照組 10.9±2.9 2 mmol/L VitC組 55.6±4.91)1 mmol/L VitC組 30.5±5.01)0.5 mmol/L VitC組 12.3±3.6 PTX組 22.6±3.51)PTX+2 mmol/L VitC組 79.1±5.61),2)PTX+1 mmol/L VitC組 61.1±4.91),2)PTX+0.5 mmol/L VitC組 34.9±4.71),2)F 89.8 P 0.00

圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 A：對(duì)照組；B：2 mmol/L VitC組；C：1 mmol/L VitC組；D：0.5 mmol/L VitC組；E：PTX組；F：PTX+2 mmol/L VitC組；G：PTX+1 mmol/L VitC組；H：PTX+0.5 mmol/L VitCFigure 3 Apoptosis detection by flow cytometry A: Control group; B: 2 mmol/L VitC group; C: 1 mmol/L VitC group; D: 0.5 mmol/L VitC group; E: PTX group; F: PTX+2 mmol/L VitC group; G: PTX+1 mmol/L VitC group; H: PTX+0.5 mmol/L VitC group

圖4 caspase-3和Bcl-2蛋白表達(dá)檢測(cè) 1：對(duì)照組；2：PTX單藥；3：PTX+0.5 mmol/L VitC組；4：PTX+1 mmol/L VitC組；5：PTX+2 mmol/L VitC組1）與對(duì)照組比較，P＜0.05Figure 4 Determination of caspase-3 and Bcl-2 protein expressions 1: Control group; 2: PTX alone group;3: PTX+0.5 mmol/L VitC group; 4: PTX+1 mmol/L VitC; 5: PTX+2 mmol/L VitC 1) P＜0.05 vs. control group

3 討 論

PTX作為臨床常用化療藥，用于治療肺癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌以及其他的實(shí)體腫瘤[7]。但是，PTX化療的副作用會(huì)隨著劑量的增加而增加[8]。有文獻(xiàn)[9]報(bào)道，VitC在與順鉑聯(lián)合治療結(jié)腸癌時(shí)可以顯著降低順鉑的毒副作用。在臨床當(dāng)中我們需要找尋一種既能不降低化療效果又能減少PTX副作用的方法。

VitC在腫瘤治療當(dāng)中一直作為輔助藥物，所以使用劑量都較低[10]。低劑量的VitC（25～50 μg/mL）并不能誘導(dǎo)凋亡，與此相反，它與干細(xì)胞的增殖和維持有關(guān)[11-12]。后來，人們發(fā)現(xiàn)口服和靜脈注射VitC具有不同的藥代動(dòng)力學(xué)[13]。早在1979年就有相關(guān)文獻(xiàn)[14]報(bào)道，大劑量（10 g/d）在治療腫瘤方面是有效的。近期國(guó)外有研究[15]報(bào)道，VitC聯(lián)合其他抗腫瘤藥物能對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用。也有相關(guān)報(bào)道[16]，大劑量VitC在動(dòng)物模型中也具有明顯的抗腫瘤作用。鑒于這些研究結(jié)果，越來越多的I、II期臨床試驗(yàn)評(píng)估靜脈注射VitC治療癌癥的可行性[17-20]。在本研究中，體外實(shí)驗(yàn)得到大劑量VitC可明顯誘導(dǎo)乳腺癌腫瘤細(xì)胞凋亡的結(jié)論。而且，VitC濃度＜1.25 mmol/L之后抑制腫瘤增值效應(yīng)顯著下降。這些發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步研究VitC增敏PTX來提高對(duì)乳腺癌細(xì)胞殺傷作用和降低毒副作用提供了依據(jù)。

VitC治療腫瘤的確切機(jī)制還不是很清楚。目前提出了幾種假說。VitC抑制了透明質(zhì)酸酶的活性，防止了膠原蛋白的水解[21]，從而加強(qiáng)了膠原蛋白的結(jié)構(gòu)抑制了腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。VitC是驅(qū)動(dòng)雙氧加酶反應(yīng)的輔助因子，包括組蛋白去甲基化酶，缺氧誘導(dǎo)因子脯氨酰羥化酶和膠原脯氨酰羥化酶[22]。由Creagan等[23-24]在美國(guó)梅奧診所所做的臨床試驗(yàn)表明口服相同劑量的VitC治療腫瘤是無效的。VitC通過靜脈而不是口服的方法在外周血中達(dá)到毫摩爾級(jí)別的濃度可以殺死腫瘤細(xì)胞而不傷害正常細(xì)胞。VitC在腫瘤細(xì)胞周圍能介導(dǎo)促氧化作用產(chǎn)生過氧化氫（H2O2）從而殺死腫瘤細(xì)胞。有文獻(xiàn)[25]報(bào)道VitC作為一種促氧化劑，可以激活A(yù)TM/AMTK信號(hào)傳導(dǎo)通路，導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞中的雷帕霉素蛋白受到抑制并促進(jìn)了卵巢癌細(xì)胞的死亡。

本研究顯示，VitC和PTX單獨(dú)用藥時(shí)對(duì)乳腺癌細(xì)胞有增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡的作用，作用呈濃度依賴性。通過流式細(xì)胞儀測(cè)得結(jié)果顯示，聯(lián)合用藥后PTX的促凋亡作用明顯增強(qiáng)，均大于單用PTX時(shí)的促凋亡作用。Western blot檢測(cè)VitC對(duì)PTX的增敏作用，結(jié)果凋亡蛋白caspase-3的表達(dá)較PTX單用明顯增多，凋亡抑制蛋白Bcl-2明顯減少。Ma等[25]有相關(guān)研究表明，VitC可以引起SHIN3人卵巢癌細(xì)胞的DNA嚴(yán)重?fù)p傷，但是加入過氧化氫酶后這種作用可以被逆轉(zhuǎn)。VitC高劑量靜脈注射似乎意外的安全并沒有較為嚴(yán)重副作用[26]。國(guó)內(nèi)外也有許多學(xué)者在研究VitC聯(lián)合其他的化療藥物治療腫瘤的相關(guān)研究，結(jié)果基本一致，VitC聯(lián)合化療藥物可以減少化療藥物的用量并提高藥物的療效，這些結(jié)果是令人鼓舞的。綜上所述，VitC聯(lián)合PTX可以成為治療乳腺癌低毒高效的藥物組合。

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