香砂六君丸對(duì)肥胖大鼠胃黏膜JAK2/STAT3通路的影響

陳偉仁　劉文俊　柴紀(jì)嚴(yán)　劉旭東　劉慧慧　于化新　王凌志　王路　馬丹　王德山　單德紅

【摘要】 目的：研究香砂六君丸對(duì)肥胖大鼠胃黏膜JAK2和STAT3表達(dá)的影響，探討該方控制肥胖人群罹患胃癌風(fēng)險(xiǎn)的可能性。方法：40只雄性SD大鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組、肥胖組（模型組）、香砂六君丸低劑量治療組（香低組）、香砂六君丸中劑量治療組（香中組）和香砂六君丸高劑量組治療組（香高組），每組8只；全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血脂；ELISA法檢測(cè)血清超氧化物歧化酶（SOD），丙二醛（MDA）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）活性；免疫組化法檢測(cè)胃黏膜磷酸化（p）-JAK2/STAT3表達(dá)。結(jié)果：與對(duì)照組比較，模型組的總甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白（LDL）和MDA水平以及p-JAK2、p-STAT3表達(dá)均顯著增加，但SOD和高密度脂蛋白（HDL）水平以及GSH-px活性均明顯下降。與模型組相比，香低、中和高組的TG和LDL水平顯著下降，而SOD水平和GSH-px活性明顯上升；香中組和香高組MDA水平和p-JAK2、p-STAT3表達(dá)均顯著下降；香高組HDL水平明顯上升。結(jié)論：香砂六君丸能夠調(diào)控血脂，對(duì)抗氧化應(yīng)激，抑制胃黏膜JAK2/STAT3通路，可能具有降低肥胖人群罹患胃癌的作用。

【關(guān)鍵詞】 香砂六君丸； 肥胖； 胃黏膜； JAK2； STAT3

隨著現(xiàn)代社會(huì)膳食結(jié)構(gòu)的改變和體力活動(dòng)日漸減少，肥胖的患病率無(wú)論在發(fā)達(dá)國(guó)家還是發(fā)展中國(guó)家均以驚人的速度增長(zhǎng)，以美國(guó)和中國(guó)最為嚴(yán)重。肥胖能夠引發(fā)眾多疾病，特別是可以明顯增加消化道腫瘤的罹患風(fēng)險(xiǎn)，但具體機(jī)制尚不清楚。近年研究發(fā)現(xiàn)，肥胖人群多存在血脂異常和氧化應(yīng)激，進(jìn)而通過(guò)激活JAK2/STAT3信號(hào)通路，引起細(xì)胞異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化，參與了包括胃腸道腫瘤在內(nèi)的諸多惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展[1-5]。臨床報(bào)道顯示香砂六君丸對(duì)消化道潰瘍和慢性胃炎等均有一定療效[6-8]，其機(jī)制與調(diào)節(jié)血脂和對(duì)抗氧化應(yīng)激等有關(guān)。由此推測(cè)，香砂六君丸可能具有預(yù)防肥胖人群罹患胃癌的作用，但相關(guān)報(bào)道還較少。因此，本實(shí)驗(yàn)以肥胖大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，主要從JAK2/STAT3信號(hào)途徑方面探討香砂六君丸的預(yù)防作用?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 雄性SPF級(jí)SD大鼠，3～4個(gè)月齡，體質(zhì)量（200±10）g，遼寧省本溪巿實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[合格證號(hào)：SCXK（遼）-2010-0001]，于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)[許可證號(hào)：SYXK（遼）-2013-000-9]。室溫（22±1）℃，相對(duì)濕度（50±5）%，自由飲水進(jìn)食，光∶暗=12 h∶12 h，飼養(yǎng)1周進(jìn)行適應(yīng)后，開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑與藥物 香砂六君子丸購(gòu)于河南省宛西制藥股份有限公司（批號(hào)140603）；生化質(zhì)控物（批號(hào)0413021）購(gòu)于四川邁克生物科技股份有限公司；超氧化物岐化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）試劑盒均購(gòu)于上海尚樂(lè)公司（批號(hào)DZE30169、DZE30157、DZE35104）；JAK2和STAT3多克隆抗體購(gòu)于ABclonal（批號(hào)A0208、A2211）；Ultra SensitiveTM S-P超敏試劑盒（兔）和DAB，均購(gòu)于福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司（批號(hào)KIT-9706、dab0031）。

1.3 儀器 美國(guó)伯樂(lè)iMark酶標(biāo)儀，德國(guó)LEICA CM1850切片機(jī)，全自動(dòng)生化分析儀（Accute TBA-40FR），成都泰盟科技公司BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)。

1.4 方法

1.4.1 分組 大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組8只和肥胖組若干，分別給予普通顆粒飼料和高脂飼料（組成：基礎(chǔ)飼料55%，豬油15%，蔗糖20%，蛋黃粉9%，膽酸鹽1%）[9]，自由飲水。連續(xù)喂養(yǎng)180 d后，選擇體質(zhì)量超過(guò)對(duì)照組（423.97±47.78）g 20%以上[10]的肥胖組大鼠32只（523.99±29.06）g，隨機(jī)分為肥胖組（模型組）、香砂六君丸低劑量治療組（香低組）、香砂六君丸中劑量治療組（香中組）和香砂六君丸高劑量治療組（香高組），每組8只。

1.4.2 給藥方法 香砂六君丸打粉后用蒸餾水沖調(diào)，按成人用量折算為大鼠用量，香低、中和高組分別按112.5、225.0和450.0 mg/kg計(jì)算出日用量，分早晚2次灌服，連續(xù)30 d。對(duì)照組和模型組灌服等體積蒸餾水，方法同前。

1.4.3 血清相關(guān)指標(biāo)檢測(cè) 10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠（0.35 mL/100 g）后，腹主動(dòng)脈取血，離心后取血清備用。取部分血清，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清是總膽固醇（TG）、總甘油三酯（TC）、高密度脂蛋白（HDL）和高密度脂蛋白（LDL）水平；取部分血清，采用ELISA法，嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)超氧化物岐化酶（SOD）和丙二醛（MDA）水平及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-px）活性檢測(cè)。

1.4.4 胃黏膜JAK2/STAT3表達(dá) 采用免疫組化法。取麻醉大鼠胃組織，4 ℃鹽水洗凈，4%多聚甲醛固定，制備石蠟切片；脫蠟至水，3%H2O2室溫孵育10 min；微波爐修復(fù)抗原5 min；滴加正常山羊血清，室溫放置20 min；滴加兔抗大鼠磷酸化（p）-JAK2或p-STAT3抗體50 μL（均濃度1∶100），37 ℃孵育2 h，4 ℃過(guò)夜；滴加羊抗兔IgG抗體，室溫放置20 min；滴加SABC試劑，室溫10 min；DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。陰性對(duì)照采用抗體稀釋液代替一抗，步驟同上。陽(yáng)性結(jié)果為胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。利用圖像分析系統(tǒng)，光鏡下選取相同部位相同視野，分析免疫陽(yáng)性染色的平均光密度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血脂變化 與對(duì)照組比較，模型組的TG、TC和LDL水平均顯著上升（P<0.01，P<0.05，P<0.01），但HDL水平明顯下降（P<0.01）；與模型組相比，香低組、香中組和香高組的TG和LDL水平均顯著下降（P<0.01），但香高組HDL水平明顯上升（P<0.01）。見(jiàn)表1。

2.2 各組大鼠氧化應(yīng)激成分和JAK2/STAT3表達(dá)變化 與對(duì)照組比較，模型組SOD和GSH-px均顯著降低（P<0.05，P<0.01），但模型組MDA、p-JAK2和p-STAT3表達(dá)均顯著增加（P<0.01）；與模型組比較，香低、中和高組SOD和GSH-px均明顯上升（P<0.05；P<0.05，P<0.01，P<0.01），香中和高組MDA水平和p-JAK2、p-STAT3表達(dá)均顯著下降（均P<0.01）。見(jiàn)表2。

3 討論

隨著肥胖癥發(fā)病率的日漸提高，社會(huì)和家庭的負(fù)擔(dān)也隨之增加，因此國(guó)內(nèi)外開(kāi)展了大量的研究工作，探索減肥和預(yù)防并發(fā)癥的方法。研究顯示，眾多減肥措施的初期效果明顯，但長(zhǎng)期效果較差，常常出現(xiàn)反彈，這就需要研制一套長(zhǎng)效減肥機(jī)制，但目前進(jìn)展不大[11-12]。因此醫(yī)患不得不共同正視現(xiàn)實(shí)，在減肥的同時(shí)控制并發(fā)癥，極力維護(hù)患者的健康，提高生活質(zhì)量。

血脂異常是肥胖人群常見(jiàn)癥狀，并可由此產(chǎn)生氧化應(yīng)激，導(dǎo)致自由基產(chǎn)生過(guò)多，進(jìn)而參與炎癥、過(guò)敏和腫瘤等眾多疾病的發(fā)生發(fā)展，因此調(diào)控血脂是防治肥胖人群罹患他病的重要手段。近年來(lái)降脂藥物的研發(fā)較多，也取得了一些成果，但兼具高效低毒的藥物還不多。中藥復(fù)方能夠多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)起效，具有毒副作用小的特點(diǎn)，是調(diào)控血脂的重要選擇。香砂六君方出自《太平惠民和劑局方》，由木香、砂仁、黨參、白術(shù)、茯苓、炙甘草、陳皮、半夏、生姜和大棗等組成。該方以四君子湯為基礎(chǔ)加減化裁而成，其中人參、白術(shù)、茯苓、炙甘草益氣健脾，陳皮、半夏能夠和胃化濕，降逆止嘔，而木香、砂仁則可以疏通脾胃氣滯，消脹散滿，故全方可以健脾和胃，主治脾虛氣滯、消化不良、脘腹脹滿等癥。該方原為湯劑，1963年版《中國(guó)藥典》（一部）將黨參代替人參，制成水丸，稱為香砂六君子丸，后1977年版《中國(guó)藥典》將其改名為香砂六君丸，現(xiàn)又將水丸改進(jìn)為濃縮丸劑，收錄于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》（中成藥分冊(cè)）第七冊(cè)。

研究顯示，香砂六君丸能夠在一定程度上調(diào)節(jié)血脂和對(duì)抗氧化應(yīng)激[13]。本研究也觀察到類似結(jié)果，如香低組、香中組和香高組的TG、LDL水平均顯著低于模型組，而香高組HDL水平明顯高于模型組（P<0.05）；香低組、香中組和香高組SOD和GSH-px均明顯高于模型組，而香中和高組MDA水平明顯低于對(duì)照組（P<0.05）。此外，在量效關(guān)系上來(lái)看，高劑量香砂六君丸的效果要更好。但研究發(fā)現(xiàn)，盡管采取了許多措施來(lái)控制血脂、對(duì)抗氧化應(yīng)激，肥胖人群的腫瘤發(fā)病率還是要高于體質(zhì)量正常的人群，原因可能還不清楚，推測(cè)與脂肪細(xì)胞能夠釋放眾多細(xì)胞因子有關(guān)。脂肪細(xì)胞也可以稱為內(nèi)分泌細(xì)胞，能夠合成釋放干擾素、白細(xì)胞介素、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子等眾多成分，從而影響相關(guān)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能[14-17]。雖然每個(gè)細(xì)胞因子的作用途徑有所不同，但多數(shù)都涉及了JAK2/STAT3信號(hào)通路。JAK2/STAT3通路能夠介導(dǎo)眾多細(xì)胞因子誘發(fā)的細(xì)胞異常增殖和分化，參與炎癥和腫瘤等一系列疾病的發(fā)生，目前是胃癌早期篩查的重要生物學(xué)標(biāo)志物之一[18-21]。

本實(shí)驗(yàn)觀察到，模型組大鼠胃黏膜p-JAK2和p-STAT3表達(dá)均明顯高于對(duì)照組（P<0.05），說(shuō)明肥胖可激活胃黏膜細(xì)胞內(nèi)JAK2/STAT3通路，提示該組大鼠胃黏膜細(xì)胞可能出現(xiàn)異常分化，是胃癌發(fā)生的一個(gè)先兆，因此及時(shí)干預(yù)此通路可能具有預(yù)防胃黏膜細(xì)胞分化的作用。香砂六君丸能夠健脾化痰和胃，能否用于胃癌防治還不清楚。本研究結(jié)果顯示，香中組和香高組的p-JAK2和p-STAT3表達(dá)均顯著低于模型組（P<0.05），表明中、高劑量的香砂六君丸能夠抑制肥胖大鼠胃黏膜細(xì)胞JAK2/STAT3通路，提示該藥可能具有對(duì)抗肥胖大鼠胃黏膜細(xì)胞異常分化的作用，但詳細(xì)作用還需要深入研究。

綜上所述，肥胖可引起血脂異常、氧化應(yīng)激和胃黏膜細(xì)胞JAK2/STAT3異常激活，而香砂六君丸能夠調(diào)控血脂，對(duì)抗氧化應(yīng)激，并抑制胃黏膜細(xì)胞JAK2/STAT3信號(hào)途徑的異常激活，可能具有預(yù)防胃黏膜細(xì)胞異常增殖和分化的作用。因此，可以考慮先期服用香砂六君丸，降低肥胖人群罹患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)。

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（收稿日期：2017-01-20） （本文編輯：程旭然）