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    咖啡種質(zhì)資源DNA指紋圖譜的構(gòu)建

    2017-03-31 20:09:53黃麗芳董云萍王曉陽孫燕陳鵬林興
    熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué) 2016年12期
    關(guān)鍵詞:指紋圖譜種質(zhì)資源咖啡

    黃麗芳 董云萍 王曉陽 孫燕 陳鵬 林興軍 閆林

    摘 要 選用4份咖啡種質(zhì)資源為材料,對S1-S100共100個RAPD引物進(jìn)行篩選,選出多態(tài)性好的引物10個。利用這10個RAPD引物對28份咖啡資源進(jìn)行擴(kuò)增,共獲得86條帶,平均每個RAPD引物擴(kuò)增出8.6條帶,多態(tài)性譜帶74條,多態(tài)性條帶比率為86.0%。結(jié)果表明:供試咖啡種質(zhì)資源遺傳多樣性較豐富;10個多態(tài)性好的RAPD引物中S8的鑒別效率最高,能將全部供試材料全部區(qū)分開,通過整合軟件錄入如所屬種類、種質(zhì)名稱、采樣地點、引物、RAPD-PCR 擴(kuò)增數(shù)據(jù)以及電泳圖片等相關(guān)信息,形成指紋圖譜二維編碼,構(gòu)成咖啡種質(zhì)資源的DNA指紋圖譜,為咖啡種質(zhì)資源品種權(quán)益保護(hù)及分子身份證構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。

    關(guān)鍵詞 咖啡 ;種質(zhì)資源 ;RAPD ;指紋圖譜

    中圖分類號 TS273 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A Doi:10.12008/j.issn.1009-2196.2016.12.008

    咖啡(Coffea spp.)為茜草科(Rubiaceae)咖啡屬(Coffea)多年生常綠灌木或小喬木,原產(chǎn)非洲北部和中部的熱帶地區(qū)??Х葘僦参锛s有100多個種,通常所指的咖啡為小粒種、中粒種、大粒種和查理種。目前全世界馴化栽培的主要有小粒種(C. arabica L.)和中粒種(C. canephora Pierre),面積約占70%和30%[1-3]。小粒種咖啡為異源四倍體種,自花授粉,而其他種均為二倍體,異花授粉。實際生產(chǎn)中,咖啡生產(chǎn)者在來源或者遺傳背景不甚明了的情況下進(jìn)行雜交或嫁接,以及地域間的引種利用等造成咖啡品種品系良莠不齊,變異性大,產(chǎn)生了大量的同物異名和同名異物,導(dǎo)致種子、種苗市場混亂的局面,阻礙咖啡產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。傳統(tǒng)的咖啡品種真實性和純度是通過形態(tài)學(xué)、化學(xué)物質(zhì)含量分析或者進(jìn)行杯品等方法鑒定的[4-6],耗時長、成本高、較難做到準(zhǔn)確鑒別咖啡品種基因型。因此,對咖啡的核心種質(zhì)的構(gòu)建、種質(zhì)的分類及真?zhèn)舞b定、品種權(quán)益保護(hù)等方面的研究顯得十分必要。

    DNA指紋圖譜(DNA fingerprint)是鑒別不同品種、品系和不同無性系、不同基因型,以及辨別親本與雜交后代遺傳相關(guān)等方面的有力工具[7-9],RAPD標(biāo)記是以PCR為基礎(chǔ),采用隨機(jī)引物對未知序列的DNA進(jìn)行檢測,根據(jù)擴(kuò)增的多態(tài)性來反映基因組DNA相應(yīng)區(qū)域的遺傳關(guān)系,具有實驗操作流程簡單、所需儀器設(shè)備少、快速簡便,通用性好,且無須事先知道目的DNA片斷序列信息等許多優(yōu)點,在生物的遺傳多樣性檢測、品系鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建和系統(tǒng)學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛運用[10-12]。

    近年來,咖啡的分子標(biāo)記研究也取得了一些進(jìn)展。王曉陽等[13]從514對SSR引物中篩選出1對特異性引物進(jìn)行中小粒種咖啡的鑒定。該引物在小粒種中可擴(kuò)增出雙帶,在中粒種中擴(kuò)增出單帶,從擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶數(shù)目即可進(jìn)行中小??Х鹊蔫b別。黃麗芳等[14]用篩選獲得的18條RAPD多態(tài)性引物對72份咖啡種質(zhì)資源進(jìn)行RAPD擴(kuò)增,結(jié)果表明,咖啡資源在種的分類水平上存在遺傳關(guān)系多樣性,部分資源的分類學(xué)地位與地理來源無相關(guān)性。本文利用RAPD標(biāo)記技術(shù),對28份咖啡資源進(jìn)行遺傳多樣性分析,并篩選出穩(wěn)定的,多態(tài)性好的RAPD引物,構(gòu)建DNA指紋圖譜,為咖啡資源的分子身份證構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 供試材料

    供試材料為28份咖啡種質(zhì)資源,其中大粒及查理種咖啡5份(編號1~5),小粒種咖啡10份(編號6~15),中粒種咖啡13份(編號16~28)。材料采自于海南,云南省德宏熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所(簡稱德宏所),云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶亞熱帶經(jīng)濟(jì)作物研究所(簡稱熱經(jīng)所),中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所(簡稱香飲所)。詳見表1。

    1.2 基因組DNA的提取

    采用CTAB改良法進(jìn)行咖啡葉片基因組DNA的提取[15]。提取的DNA經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度計檢測質(zhì)量,稀釋至20 ng/μL,置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3 引物篩選及RAPD擴(kuò)增

    利用4份差異較大的咖啡模板,對RAPD引物S1-S100共100條隨機(jī)引物進(jìn)行多態(tài)性篩選,從中選取多態(tài)性好且擴(kuò)增條帶清晰的對實驗樣品進(jìn)行擴(kuò)增。引物由上海生工生物工程技術(shù)股份有限公司合成。

    PCR反應(yīng)體系為本課題組優(yōu)化過的咖啡RAPD反應(yīng)體系[16]:20 μL體系中,含ddH2O 13.75 μL,10×buffer 2 μL,dNTPs(2.5 mmol/L)0.6 μL,Mg2+(25 mmol/L)1.2 μL,引物(10 μmol/L)1.2 μL,Taq酶(5 U/μL)0.25 μL,基因組DNA(20 ng/μL)1 μL。PCR擴(kuò)增條件:94 ℃預(yù)變性3 min;94℃變性1 min,38℃退火1 min 45 s,72℃延伸2 min,反應(yīng)40個循環(huán);72℃再延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物通過1.8%瓊脂糖凝膠電泳觀察,以DL 2 000 Marker為參照,試驗重復(fù)2次。

    1.4 數(shù)據(jù)分析

    根據(jù)擴(kuò)增引物的遷移率,利用人工方法統(tǒng)計讀帶,將清晰度高、重復(fù)性好的擴(kuò)增條帶賦值“1”,無條帶或肉眼分辨不清的弱帶賦值“0”,導(dǎo)入Excel 表格生成數(shù)據(jù)矩陣。通過多態(tài)性條帶比率、品種最大相似系數(shù)及品種聚類區(qū)分率(Rate of distinguishing variety by cluster,RDVC)鑒別引物。采用NTSYSpc 2.1軟件,根據(jù)Nei和Li相似系數(shù)計算遺傳相似性GS(genetic similarity),根據(jù)非加權(quán)算術(shù)平均法(UPGMA)進(jìn)行聚類分析。RDVC=(N-Ni)/N,Ni 為無法區(qū)分品種數(shù),N為品種總數(shù)。

    1.5 指紋圖譜構(gòu)建

    根據(jù)RAPD電泳擴(kuò)增結(jié)果,從多態(tài)性比較豐富的引物中選出至少一條可將所有供試品種區(qū)分且表現(xiàn)優(yōu)異的RAPD引物,構(gòu)建咖啡品種(系)的DNA指紋圖譜??Х鹊腄NA指紋圖譜一部分是RAPD擴(kuò)增數(shù)據(jù),由二進(jìn)制代碼組成,另一部分是結(jié)合草料二維碼在線生成器(www.cli.im)將咖啡的種質(zhì)名稱、種屬、采樣地點、引物名稱、RAPD數(shù)據(jù)代碼[17],RAPD-PCR擴(kuò)增數(shù)據(jù)圖片等信息錄入軟件中,形成指紋圖譜二維編碼[18],可以更加快捷方便的進(jìn)行實際應(yīng)用。詳見表2。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 RAPD引物篩選與擴(kuò)增片段多態(tài)性

    以4份差異較大的咖啡基因組DNA為模板,對S1-S100共100個RAPD引物進(jìn)行多態(tài)性篩選,篩選出10個多態(tài)性較好的引物。利用這10個引物對28份材料基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增出的位點多態(tài)性數(shù)目為5~12條,產(chǎn)物片段大小介于350~2 000 bp ,以引物S8和S19擴(kuò)增的位點數(shù)最多,10個引物共擴(kuò)增出86個位點,平均每個引物擴(kuò)增出8.6條譜帶,其中多態(tài)性帶74條,多態(tài)性條帶比例為86.0%,其中S8引物多態(tài)性最為豐富。詳見表3。

    2.2 聚類分析

    28份咖啡材料間的相似性系數(shù)變幅為0.337 8~0.905 4。其中小粒種喀麥隆(13)和中粒種熱研2 號(17)的相似系數(shù)最小,為0.337 8,說明二者間的遺傳距離最遠(yuǎn),遺傳差異最大。小粒種CCC24(8)和鐵畢卡(11),中粒種興32(24)和興30(26)相似系數(shù)最大,都為0.905 4,表明它們之間的遺傳距離最小,遺傳差異最小。從種內(nèi)遺傳相似系數(shù)看,2份大粒種的相似系數(shù)為0.635 1,查理種種內(nèi)最小相似系數(shù)為查理中果(4)和查理大果(5),為0.702 7,最大相似系數(shù)為查理小果(3)和查理大果(5),為0.878 4。小粒種CATIMOR P88(7)和巴布亞新幾內(nèi)亞(14),中粒種興32(24)和興31(25),它們種內(nèi)最小相似系數(shù)分別為0.662 2和0.608 1。

    UPGMA 聚類結(jié)果(圖1)分析,該聚類圖在相似性系數(shù)為0.608水平下可劃分為3大類。第Ⅰ類群包括5份材料,包括2份大粒種和3份查理種,第Ⅱ類群包括全部13份中粒種材料,第Ⅲ類群包括了全部的小粒種。聚類分析結(jié)果表明,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3大類群種間關(guān)系清晰,聚類結(jié)果與經(jīng)典分類結(jié)果一致。

    2.3 指紋圖譜的構(gòu)建

    根據(jù)10條引物擴(kuò)增譜帶的多態(tài)性,能將供試的28份咖啡材料全部區(qū)分開。但從單條RAPD引物的聚類分析顯示,10條多態(tài)性較好的引物中只有引物S8能將所有供試材料一次性區(qū)分開,10條引物檢測效率如表3。引物S8的多態(tài)性帶數(shù)是12條,多態(tài)性百分率100%,品種最大相似性系數(shù)為0.916 7,品種聚類區(qū)分率為100%,為最有效的引物。其次為引物S11、S19,品種最大相似性系數(shù)為1,品種聚類區(qū)分率為53.57%,有13個品種無法區(qū)分開。僅用引物S8就能將所有參試品種有效區(qū)分,故選用S8的分子數(shù)據(jù)用于咖啡種質(zhì)資源DNA 指紋圖譜的構(gòu)建。

    利用草料二維碼在線生成器對所有供試材料進(jìn)行編碼,為每份材料建立了1個DNA 指紋圖譜編碼,其中包含了所屬種類、種質(zhì)名稱、采樣地點、引物、RAPD-PCR擴(kuò)增數(shù)據(jù)以及電泳圖片,從而得到二維碼結(jié)果。如圖2-A為印度,包含以下信息:所屬種類大粒種,種質(zhì)名稱印度、采樣地點德宏所、引物S8、RAPD-PCR擴(kuò)增數(shù)據(jù)為000000011100,以及圖2-A電泳圖;圖2-B為巴西,包含以下信息:所屬種類小粒種,種質(zhì)名稱為巴西,采樣地點為熱經(jīng)所,引物S8,RAPD-PCR擴(kuò)增數(shù)據(jù)為000000001110,電泳圖2-B;圖2-C為印度,包含信息,種類為中粒種,種質(zhì)名稱為興28,采樣地點為香飲所,引物S8,RAPD-PCR擴(kuò)增數(shù)據(jù)為110001000110,電泳圖2-C。28份咖啡資源的RAPD數(shù)據(jù)見表3。

    3 討論

    任何一種分子標(biāo)記在實際運用中都有各自的優(yōu)缺點。RAPD 分子標(biāo)記技術(shù)易受多種因素的影響,因其利用的是非特異引物,擴(kuò)增結(jié)果的穩(wěn)定性是相對的。但可通過多次實驗摸索建立適合該物種的一套反應(yīng)條件,得到令人滿意的擴(kuò)增結(jié)果[19-21]。

    本研究所用的咖啡RAPD反應(yīng)體系及程序等都經(jīng)本課題組反復(fù)多次實驗驗證,篩選出的最優(yōu)反應(yīng)條件。從研究結(jié)果可看出,同一條引物在各個咖啡樣品間和不同引物在相同的咖啡樣品上多態(tài)性帶數(shù)和擴(kuò)增總帶數(shù)的差異較顯著,說明供試的基因組DNA多態(tài)性較豐富,也表明了RAPD標(biāo)記是研究咖啡種質(zhì)資源親緣關(guān)系和構(gòu)建咖啡指紋圖譜的有效方法。

    本研究篩選出的10條RAPD引物對28份咖啡材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增,共擴(kuò)增出86條帶,平均每條引物擴(kuò)增出8.6條帶,多態(tài)性條帶共74條,占總數(shù)的86%,相似性系數(shù)變幅為0.337 8~0.905 4,多樣性較豐富,這與此次試驗的選材也有一定關(guān)系,收集的28份咖啡樣品為生產(chǎn)或科學(xué)研究上具有代表性的咖啡品種(品系),涵蓋了咖啡屬的4個種,其中小粒種和中粒種居多,大粒種和查理種因其抗逆性較好,目前在科學(xué)研究中較多用于作砧木。

    為了降低成本和提高樣品的檢測效率,在構(gòu)建DNA指紋圖譜時,原則之一就是利用較少的引物分開盡量多的品種,這就意味著所用的引物多態(tài)性和穩(wěn)定性要好。10條引物中,S8多態(tài)性條帶12條,多態(tài)性百分率為100%,品種聚類區(qū)分率100%。因此,選擇引物S8構(gòu)建DNA指紋圖譜。若在試驗材料增加時,單條引物不能區(qū)分所有供試材料,可在引物S8的基礎(chǔ)上增加多態(tài)性較好的引物,如S11、S19,利用引物組合區(qū)分出所有品種[22]。

    DNA指紋代碼構(gòu)建指紋圖譜的信息有限,而二維碼技術(shù)可進(jìn)行信息數(shù)據(jù)錄入。本文首次將DNA指紋代碼結(jié)合二維碼技術(shù)應(yīng)用在咖啡研究中,從而生成咖啡二維碼,可更方便快捷地供研究人員進(jìn)行對比和鑒定,為建立咖啡的網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫提供直觀有效的數(shù)據(jù)支持。最終產(chǎn)生的信息也可錄入到咖啡產(chǎn)品的物流信息中,從而形成一條完整的咖啡產(chǎn)品物流信息鏈,為咖啡產(chǎn)品在市場上的健康持續(xù)發(fā)展提供技術(shù)支持。

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