PTEN和缺氧誘導(dǎo)因子- 1α在食管鱗癌組織中的表達(dá)①

竇鵬揮，胡春榮，馬利峰，邢宇彤，朱曉峰

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

PTEN和缺氧誘導(dǎo)因子- 1α在食管鱗癌組織中的表達(dá)①

竇鵬揮，胡春榮，馬利峰，邢宇彤，朱曉峰

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

目的:探討PTEN和缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)在食管鱗癌組織中的表達(dá)及臨床意義。方法:使用免疫組化和RT-PCR的方法對(duì)PTEN，HIF-1α在食管癌組織中的表達(dá)情況進(jìn)行定量，并研究其相關(guān)性。結(jié)果:PTEN和HIF-1α多被發(fā)現(xiàn)位于食管鱗癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)、血管細(xì)胞質(zhì)以及內(nèi)皮細(xì)胞中;PTEN在T0組(0.1928±0.0164)、一期組(0.1608±0.099)、二期組(0.1423±0.073)及三期組(0.1272±0.096)患者中的表達(dá)逐步降低，差異顯著(P<0.01)，HIF-1α表達(dá)在T0(0.1320±0.0108)、一期組(0.1667±0.0089)、二期組(0.1985±0.0128)及三期(0.2483±0.0165)患者逐步增高，差異顯著(P<0.01)，PTEN和HIF-1α表達(dá)量之間的差異顯著(P<0.01) 。結(jié)論：在所有食管鱗癌病例組織中，PTEN與HIF-1α基因的表達(dá)與腫瘤的分期相關(guān)性顯著，說明這兩種蛋白的表達(dá)情況可能對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌的治療效果及預(yù)后有重要的影響。 在基因靶向治療、抗癌新藥研發(fā)等方面，提供新的選擇方向和理論基礎(chǔ)。

食管鱗癌；PTEN；HIF-1α

食管癌是我國(guó)常見的消化道惡性腫瘤之一，雖然其發(fā)生機(jī)制尚不明確，但已知其受很多相關(guān)因素的調(diào)控。主要發(fā)生在食管黏膜上皮，臨床類型中鱗癌系比較常見的[1]。盡管近些年食管癌的療效已經(jīng)不斷改善，但其預(yù)后仍然較差，患者的死亡率也較高，患者的5年生存率低于 17%[2]。在食管鱗癌中，PTEN和HIF- 1α的表達(dá)情況以及相關(guān)性的研究較少。在本研究中，通過免疫組織化學(xué)和RT-PCR研究了食管鱗狀細(xì)胞癌中PTEN和缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)的表達(dá)及相關(guān)性， 探討其與食管癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制的關(guān)系，為食管癌的靶基因治療、預(yù)后等研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

43例食管鱗癌患者組織標(biāo)本，均來(lái)自我院胸外科2010-10～2013-10經(jīng)治的病人(所有患者術(shù)前均未接受放化療)，年齡39～70歲，平均(51.67±9.91)歲;其中6例Tis(原位癌)，13例T1期，10例T2期，9例T3期，5例T4期。15例T0期作為正常對(duì)照組， 根據(jù)TNM臨床分期隨機(jī)將其分成四組(正常對(duì)照組、Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期)， 四組患者在年齡、 性別、 病變長(zhǎng)度等情況無(wú)明顯差別(P>0. 05) 。S-P試劑(Maixin，中國(guó))，抗體系兔多克隆VEGF抗體(abcam，美國(guó))。

1.2 方法

(1)免疫組化SP法步驟：切片逐步脫蠟至水，進(jìn)行抗原修復(fù)，PBS緩沖液洗3min/3次。滴加UltraVBlock，室溫孵育5min。緩沖液洗3min/3次。滴加一抗，于37℃孵育2h。PBS緩沖液沖洗5min/2次。滴加增強(qiáng)子，室溫孵育15min。PBS緩沖液沖洗5min/2 次。然后滴加HRPPolymer(酶標(biāo)二抗工作液) ， 室溫下孵育 20min。PBS緩沖液沖洗 5min/2 次。將DABPlusSubstrate底物滴加到切片上， 孵育10min。蒸餾水洗滌，蘇木素復(fù)染、常規(guī)脫水、透明、封片、拍照。

(2)RT-PCR操作步驟：用RT-PCR檢測(cè)PTEN、HIF-1α基因的表達(dá):從每個(gè)實(shí)驗(yàn)材料中提取總RNA。同時(shí)，根據(jù)上述兩個(gè)基因設(shè)計(jì)PCR引物，通過RT-PCR試劑盒檢測(cè)每個(gè)樣品中每個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS14.0軟件比較各組之間的樣本平均值，使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和方差分析ANOVA分析。

2 結(jié)果

2.1 食管鱗癌病人組織內(nèi)PTEN和HIF-1α表達(dá)的特點(diǎn)

由棕色顆粒來(lái)顯示PTENmRNA和HIF-1αmRNA表達(dá)水平， 大多位于內(nèi)皮細(xì)胞、血管細(xì)胞質(zhì)和腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，測(cè)量食管鱗狀細(xì)胞癌中PTENmRNA和HIF-1αmRNA的表達(dá)，隨著病理分期的不同，表達(dá)量亦差異性顯著，PTEN在T0組(0.1928±0.0164)、一期組(0.1608±0.099) 、 二期組(0.1423±0.073) 及三期組(0.1272±0.096)患者中的表達(dá)逐步降低，差異顯著(P<0. 01) ，HIF- 1α表達(dá)在T0(0.1320±0.0108)、一期組(0.1667±0.0089) 、 二期組(0.1985±0.0128)及三期(0.2483±0.0165)患者逐步增高，差異顯著(P<0.01)。見圖1， 圖2。

2.2PTEN，HIF-1α和食管鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)性研究的PTEN的表達(dá)與HIF-1α的表達(dá)顯著相關(guān)(r=-0. 36，-0. 68，均P<0.05) 。

表1 四組患者PTEN/HIF-1α表達(dá)情況對(duì)比

圖1 食管鱗癌及正常組織中PTEN、HIF-1α表達(dá)(S-P法，×400)

圖2 食管鱗癌患者組織內(nèi) PTEN、HIF-1α表達(dá)量(RT-PCR)

3 討論

PTEN蛋白是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的具有磷酸酯酶活性的抑癌基因，通過其磷酸化作用，去磷酸化某些蛋白激酶或磷脂，使細(xì)胞周期的進(jìn)展受到抑制，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而且調(diào)控細(xì)胞黏附、遷移、增殖和分化[3]。PTEN發(fā)揮抑癌作用的途徑包括：PI3K途徑、MAPK途徑和FAK途徑。PTEN基因在多種腫瘤組織中表達(dá)缺失，已經(jīng)被許多研究證實(shí)， 如非小細(xì)胞肺癌、 乳腺癌、大腸癌、 卵巢癌、 子宮內(nèi)膜癌、 星形細(xì)胞瘤[4～7 ]。 張偉峰等[8]研究表明性別、年齡、腫瘤大小對(duì)于PTEN的表達(dá)無(wú)相關(guān)性，但是與腫瘤的分化程度呈正相關(guān)；還發(fā)現(xiàn)腫瘤的臨床分期、浸潤(rùn)深度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與PTEN的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。HIF是細(xì)胞適應(yīng)缺氧環(huán)境因子的主要調(diào)節(jié)劑。 缺氧是腫瘤微環(huán)境的特征。調(diào)控細(xì)胞耐受缺氧環(huán)境的調(diào)控因子對(duì)于腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)必不可少，并且促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。已證實(shí)，在多種細(xì)胞中廣泛存在HIF-1，激活后直接或間接作用于多種下游基因，參與在缺氧環(huán)境下細(xì)胞的生存、 增殖、 凋亡及多種代謝，促進(jìn)新生血管的形成，并且與腫瘤耐藥等關(guān)系密切。在腫瘤組織中，PTEN基因的

缺失促進(jìn)了癌基因的高表達(dá)， 從而加速腫瘤組織生長(zhǎng)；HIF-1α可防止腫瘤細(xì)胞在生長(zhǎng)過程中的凋亡，HIF-1α的高表達(dá)使腫瘤細(xì)胞耐缺氧的能力得到增強(qiáng)，因此腫瘤細(xì)胞可以繼續(xù)的分化、 增殖，危害人體健康，PTEN的低表達(dá)與HIF-1α的高表達(dá)共同促進(jìn)了腫瘤的生長(zhǎng)、 轉(zhuǎn)移。HIF-1α的表達(dá)和活性受到PTEN調(diào)控，通過抑制PI3K-AKT-FARP途徑阻斷HIF-1α蛋白的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄活性。當(dāng)PTEN基因發(fā)生突變或缺失，HIF-1α蛋白的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄活性受到影響。前列腺癌的血管生成，是由于PTEN功能喪失，誘導(dǎo)表達(dá)HIF一1alpha相關(guān); 導(dǎo)入野生型PTEN的前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3， 不僅HIF-1α蛋白的表達(dá)被明顯抑制，而且VEGF的活性也被抑制，從而使血管形成也受到抑制[9 ]。

在本次研究中證實(shí)，在所有食管鱗癌病例組織中，PTEN與HIF-1α基因的表達(dá)與腫瘤的分期相關(guān)性顯著，說明這兩種蛋白的表達(dá)情況可能對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌的治療效果及預(yù)后有重要的影響。在基因靶向治療、抗癌新藥研發(fā)等方面，提供新的選擇方向和理論基礎(chǔ)。

[1]蔡平,方丹青,梁建輝,等.胸腔鏡輔助下與開放式食管癌根治術(shù)的綜合臨床效果比較[J].中國(guó)醫(yī)療前沿,2012,7(21):48-49

[2]YUED,FANQ,CHENX,etal.EpigeneticinactivationofSPINT2isassociatedwithtumorsuppressivefunctioninesaphagealsquamouscellcarcinoma[J].ExpCellRes,2014,322(1):149C158

[3]徐麗超，吳英杰.子宮內(nèi)膜樣腺癌中PTEN、MDM2 表達(dá)及臨床意義[J]. 黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2015 , 38(3):119

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[9]ZhongH，ChilesK，F(xiàn)eldserD，etal．Modulationofhypoxia-induciblefactor1alphaexpressionbytheepidermalgrowthfactor/phosphatidylinositol3-kinase/PTEN/AKT/FRAPpathwayinhumanprostatecancercells:implicationsfortumorangiogenesisandtherapeutics[J]．CancerRes，2000，60(6):1541-1545

佳木斯大學(xué)面上項(xiàng)目，編號(hào)：S2011-036。

竇鵬揮(1976～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，副主任醫(yī)師。

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1008-0104(2017)01-0067-02

2016-11-18)