交枝頂孢霉殺柑橘全爪螨活性及其生物學特性研究

王 娟, 胡軍華, 龍艷玲, 周 娜, 彭鳳格, 姚廷山, 李鴻筠

(西南大學柑桔研究所/國家柑桔工程技術(shù)研究中心/西南果樹科學觀測實驗站, 重慶 400712)

交枝頂孢霉殺柑橘全爪螨活性及其生物學特性研究

王 娟, 胡軍華*, 龍艷玲, 周 娜, 彭鳳格, 姚廷山, 李鴻筠

(西南大學柑桔研究所/國家柑桔工程技術(shù)研究中心/西南果樹科學觀測實驗站, 重慶 400712)

為了明確交枝頂孢霉AcremoniumimplicatumCQBBW8的殺螨活性及其生物學特性,采用觸殺毒力法檢測CQBBW8菌株對柑橘全爪螨的致死率,通過單因素試驗測試不同培養(yǎng)基、碳源、氮源、溫度、pH及紫外線對CQBBW8菌株生長、產(chǎn)孢及其分生孢子萌發(fā)的影響。結(jié)果表明,CQBBW8菌株對柑橘全爪螨Panonychuscitri(McGregor)的校正致死率為54.42%,LC50為1.2×106個/mL,LT50值為5.175 9 d。最佳生長和產(chǎn)孢培養(yǎng)基分別為PDA和SEA;菌絲生長最適碳源和氮源為甘露醇和蛋白胨,產(chǎn)孢最適碳源和氮源為可溶性淀粉和氯化銨;最適生長溫度為25℃,最適產(chǎn)孢和分生孢子萌發(fā)溫度為30℃;最適生長和產(chǎn)孢pH為6.0,最適萌發(fā)pH為7.0;紫外線對菌絲生長影響不明顯,對產(chǎn)孢影響較大,紫外線照射時間越長,孢子萌發(fā)率越高。綜上,CQBBW8菌株對柑橘全爪螨有較強的毒力,對營養(yǎng)需求不高,環(huán)境適應性較強,具有開發(fā)為殺螨真菌制劑的潛力。

交枝頂孢霉; 生物學特性; 殺螨活性

頂孢霉屬Acremoniumsp.是一類廣譜性昆蟲病原真菌,能夠防治多種農(nóng)林害蟲,如青楊天牛SaperdapopulneaL.[1]、根結(jié)線蟲Meloidogyneincognita[2-5]、楊干象Cryptorrhynchuslapathi(Linnaeus)[6]、六星黑點豹蠹蛾ZeuzeraleuconotumButler[7]、甘藍蚜Brevicorynebrassicae、菜青蟲Pierisrapae(Linnaeus)、小菜蛾P(guān)lutellaxylostella和黏蟲Mythimnaseparata(Walker)[8-9]等等。并且頂孢霉也是一種抑制多種植物病原真菌生長的拮抗真菌[10-12],同時還具有醫(yī)藥價值[13-14],是一種具有開發(fā)應用潛力的真菌。2005年宋麗雯等[15]從菜豆蚜AphismedicaginisKoch蟲尸上分離到頂孢霉AcremoniumhansfordiiAhy1菌株并且對其營養(yǎng)條件進行了初步研究,該菌株對二斑葉螨TetranychusurticaeKoch雌成螨有較高的侵染力,且能夠延長螨卵的發(fā)育歷期,降低螨卵孵化率;2012年姜立波等[16]研究發(fā)現(xiàn)頂孢霉Ahy1孢子與常用殺螨劑配合使用后對二斑葉螨的致死率提高了60%左右,LT50明顯縮短;2013年王婧[17]研究表明頂孢霉與抑制劑對羥基苯甲酸、苯甲酸混用對頂孢霉侵染二斑葉螨有較好的協(xié)同作用。本實驗室從重慶市北碚區(qū)西南大學柑桔研究所試驗場采集的自然感染的柑橘全爪螨Panonychuscitri(McGregor)上分離到一株殺螨真菌CQBBW8,經(jīng)形態(tài)學和分子鑒定為交枝頂孢霉Acremoniumimplicatum。在此基礎之上筆者測定了CQBBW8菌株對柑橘全爪螨雌成螨的殺螨活性,系統(tǒng)地研究了不同培養(yǎng)基、碳源、氮源、溫度、pH及紫外線對CQBBW8菌株生長、產(chǎn)孢及其分生孢子萌發(fā)的影響,明確其生長、產(chǎn)孢及分生孢子萌發(fā)所需要的營養(yǎng)條件和環(huán)境條件,以期為該菌后期的大批量培養(yǎng)和殺螨真菌制劑的開發(fā)與田間應用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

供試菌株:從重慶市北碚區(qū)西南大學柑桔研究所試驗場采集到的自然感染的柑橘全爪螨上分離得到的CQBBW8菌株,保存于西南大學柑桔研究所綜防課題組。PDA培養(yǎng)基25℃(L∥D=12 h∥12 h)培養(yǎng)7 d待用。

供試螨:柑橘全爪螨采自重慶市北碚區(qū)西南大學柑桔研究所試驗場,采前未經(jīng)藥劑處理。

供試培養(yǎng)基:馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar,PDA): 去皮馬鈴薯200 g切塊于800 mL去離子水中煮沸30 min后用4層紗布過濾所得液體,葡萄糖15 g,瓊脂粉20 g,蒸餾水定容到1 L;淀粉瓊脂培養(yǎng)基(SYA):可溶性淀粉40 g,酵母浸出粉5 g,瓊脂20 g,蒸餾水定容到1 L;察氏培養(yǎng)基(Czapek’s):硝酸鈉3 g,磷酸氫二鉀1 g,硫酸鎂(無水)0.5 g,氯化鉀0.5 g,硫酸亞鐵0.01 g,蔗糖30 g,瓊脂20 g,蒸餾水定容到1 L;薩氏培養(yǎng)基(SDAY):葡萄糖40 g,酵母浸出粉10 g,蛋白胨10 g,瓊脂20 g,蒸餾水定容到1 L;薩氏蛋黃培養(yǎng)基(SEA):葡萄糖40 g,酵母浸出粉10 g,蛋白胨10 g,瓊脂20 g,蒸餾水定容至1 L,121℃滅菌20 min,冷卻至50～55℃時加入5個雞蛋的蛋黃液,制備平板培養(yǎng)基,無菌試驗后備用。孢子萌發(fā)液:2%葡萄糖,0.5%蛋白胨。

1.2 方法

1.2.1 CQBBW8菌株的殺螨活性測定

參照王娟[18]的方法刮取菌株CQBBW8菌絲置于盛有含0.02%吐溫-80的20 mL無菌水的50 mL離心管中,于漩渦振蕩器上振蕩分散孢子,然后用4層無菌擦鏡紙過濾收集孢子,分別配制成6個孢子懸浮液濃度梯度:1.27×103、1.27×104、1.27×105、1.27×106、1.27×107、1.27×108個/mL。采集新鮮健康的‘溫州蜜柑’轉(zhuǎn)綠葉片,75%乙醇消毒后無菌水清洗3遍,自然晾干,置于鋪有濕海綿和濾紙的托盤內(nèi),葉緣用濕棉條圍繞保濕。在每張葉片背面接50頭柑橘全爪螨雌成螨,螨體穩(wěn)定后噴灑孢子懸浮液,每張葉片均勻噴灑2 mL孢子懸浮液,5次重復。設置含0.02%吐溫-80無菌水作對照。25℃保濕培養(yǎng),連續(xù)7 d逐日調(diào)查雌成螨的感染死亡數(shù),并采用農(nóng)藥室內(nèi)生物測定數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(PBT)計算累積死亡率、校正死亡率、LC50值和LT50值。

1.2.2 CQBBW8菌株生長最佳培養(yǎng)基篩選

制備PDA培養(yǎng)基、SYA培養(yǎng)基、Czapek’s培養(yǎng)基、SDAY培養(yǎng)基、SEA培養(yǎng)基,用接種針挑取少量CQBBW8菌絲接到各種培養(yǎng)基平板上,每個處理5次重復。恒溫光照培養(yǎng)箱中(25±1)℃恒溫培養(yǎng)8 d后(L∥D=12 h∥12 h,RH 95%),采用十字交叉法測量菌落直徑,計算平均日生長速率,并收集孢子，用血球計數(shù)板鏡檢菌落總產(chǎn)孢量,然后計算其單位面積產(chǎn)孢量。

1.2.3 碳源和氮源對CQBBW8菌株生長和產(chǎn)孢的影響

在去除碳源的察氏培養(yǎng)基中分別加入30 g可溶性淀粉、甘露醇、肌醇、麥芽糖、葡萄糖、乳糖、甘油、蔗糖制成不同碳源的供試培養(yǎng)基。每個處理5個重復,(25±1)℃恒溫培養(yǎng)8 d(L∥D=12 h∥12 h,RH95%),菌落直徑和產(chǎn)孢量的測定方法同1.2.2。

在去除氮源的察氏培養(yǎng)基中分別加入3 g硝酸鉀、尿素、蛋白胨、硝酸銨、甘氨酸、賴氨酸、氯化銨制成不同氮源的供試培養(yǎng)基。每個處理5個重復,(25±1)℃恒溫培養(yǎng)8 d(L∥D=12 h∥12 h,RH95%),采用十字交叉法測量菌落直徑,計算其平均生長速率,并用血球計數(shù)板鏡檢孢子數(shù)量,折算為每平方毫米菌落產(chǎn)孢量。

1.2.4 溫度對CQBBW8菌株生長、產(chǎn)孢和分生孢子萌發(fā)的影響

挑取少量CQBBW8菌株菌絲接至新的PDA培養(yǎng)基中央,分別置于10、15、20、25、30、35、40℃的光照培養(yǎng)箱(L∥D=12 h∥12 h,RH95%)中,每個處理5次重復,培養(yǎng)8 d時采用十字交叉法測量菌落直徑,計算其平均生長速率,并用血球計數(shù)板鏡檢孢子數(shù)量,折算為每平方毫米菌落產(chǎn)孢量。

用孢子萌發(fā)液配制濃度為1×107個/mL的分生孢子懸浮液,取等量孢子懸浮液分別置于10、15、20、25、30、35、40℃的搖床中,100 r/min振蕩培養(yǎng),每個處理3次重復,處理20 h 后取樣在顯微鏡下計測分生孢子的萌發(fā)狀況。孢子萌發(fā)率(%)=萌發(fā)孢子數(shù)/孢子總數(shù)×100,下同。

1.2.5 pH對CQBBW8菌株生長、產(chǎn)孢和分生孢子萌發(fā)的影響

用 1 mol/L HCl 和 1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)PDA培養(yǎng)基的pH分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0,挑取菌絲接到不同pH的PDA培養(yǎng)基中央,每個處理5次重復,(25±1)℃恒溫培養(yǎng)8 d (L∥D=12 h∥12 h,RH95%),采用十字交叉法測量菌落的直徑,計算其平均生長速率,并用血球計數(shù)板鏡檢孢子數(shù)量,折算為每平方毫米菌落產(chǎn)孢量。

用 1 mol/L HCl 和 1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)分生孢子懸浮液的pH分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0,每個處理3次重復,(25±1)℃、100 r/min搖床中振蕩培養(yǎng),處理20 h 后取樣在顯微鏡下計測分生孢子的萌發(fā)狀況。

1.2.6 紫外線對CQBBW8菌株生長、產(chǎn)孢和分生孢子萌發(fā)的影響

用0.05%吐溫-80無菌配制濃度為1×107個/mL的分生孢子懸浮液,在每個PDA平板中央接種孢子懸浮液2 μL,然后置于紫外燈(30 W,120 lx)40 cm下分別照射 5、10、20、30、40、50、60 min,每個處理5次重復,(25±1)℃恒溫培養(yǎng)8 d(L∥D=12 h∥12 h,RH95%)。以不經(jīng)紫外線照射作為對照。采用十字交叉法測量菌落直徑,計算其平均生長速率,并用血球計數(shù)板鏡檢孢子數(shù)量,折算為每平方毫米菌落產(chǎn)孢量。

取等量分生孢子懸浮液置于紫外燈(30 W,120 lx)40 cm下分別照射 5、10、20、30、40、50、60 min,每個處理3次重復。(25±1)℃、100 r/min搖床中振蕩培養(yǎng),以不經(jīng)紫外線照射作為對照,處理12 h 后取樣在顯微鏡下計測分生孢子的萌發(fā)狀況。

1.2.7 相容性殺菌劑、殺螨劑篩選

選取11種田間常用的殺菌劑作為供試殺菌劑:86.2%氧化亞銅可濕性粉劑(挪威勞道克斯公司)、40%氟硅唑乳油(美國杜邦公司)、60%唑醚·代森聯(lián)水分散粒劑(巴斯夫歐洲公司)、10%苯醚甲環(huán)唑粉劑(海南博士威農(nóng)用化學有限公司)、43%戊唑醇懸浮劑(拜爾作物科學(中國)有限公司)、20%甲基硫菌靈懸浮劑(深圳諾普信農(nóng)化股份有限公司)、50%喹啉銅可濕性粉劑(浙江海正化工股份有限公司)、70%丙森鋅可濕性粉劑(拜爾作物科學(中國)有限公司)、25%嘧菌酯懸浮劑(英國先正達有限公司)、50%多菌靈可濕性粉劑(江陰市農(nóng)藥二廠有限公司)、250 g/L吡唑醚菌酯乳油(巴斯夫歐洲公司),分別制成不同濃度的培養(yǎng)基,采用菌絲生長速率法測定殺菌劑的毒力。

選取5種田間常用的殺螨劑作為供試殺螨劑:240 g/L 螺螨酯懸浮劑(拜爾作物科學(中國)有限公司)、20%四螨嗪懸浮劑(廣東中訊農(nóng)科股份有限公司)、5% 唑螨酯懸浮劑(濟南中科綠色生物工程有限公司)、15% 噠螨靈乳油(江蘇克勝集團股份有限公司)、22.4% 螺蟲乙酯懸浮劑(拜爾作物科學(中國)有限公司)。根據(jù)殺螨劑的性質(zhì),每種殺螨劑設定高、中、低3個供試濃度。

培養(yǎng)基配制:取1 g(1 mL)農(nóng)藥用無菌水配制成100 mL母液,取對應濃度所需體積的農(nóng)藥母液(無菌水作為對照)與100 mL PDA培養(yǎng)基混合均勻后平均倒入5個直徑為9 cm的無菌培養(yǎng)皿中。挑取CQBBW8菌絲接入冷凝后的培養(yǎng)平板中央,28℃恒溫培養(yǎng)7 d后用十字交叉法測量菌落直徑。采用農(nóng)藥室內(nèi)生物測定數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(PBT)對各藥劑試驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析,獲得各藥劑對菌株的毒力回歸方程、抑制中濃度(EC50)和相關(guān)系數(shù)(r)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20.0軟件進行試驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析,Duncan氏新復極差法進行各處理間的差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 CQBBW8菌株對柑橘全爪螨雌成螨的殺螨活性

接種CQBBW8菌株孢子懸浮液后1～3 d時柑橘全爪螨行動緩慢,螨體顏色變暗,開始出現(xiàn)部分死亡。將死螨放在培養(yǎng)皿里保濕培養(yǎng)5 d,發(fā)現(xiàn)在其體表長出白色菌絲,挑取菌絲鏡檢和分子鑒定,確定和接種菌株是同一菌株。殺螨活性結(jié)果顯示,死亡率隨著孢子濃度的增大而升高。當孢子濃度為1.27×106個/mL時,第7天的累積死亡率達到55.33%,校正死亡率為54.42%,LC50為1.2×106個/mL(95%置信區(qū)間:5.67×105～2.65×106個/mL),毒力回歸方程為Y=3.368 4+0.268 0X,相關(guān)系數(shù)(r)為0.929 1; LT50為5.175 9 d(95%置信區(qū)間:4.751 6～5.638 0 d),毒力回歸方程為Y=3.160 7+2.254 0X,相關(guān)系數(shù)(r)為0.989 2。

2.2 CQBBW8菌株生長最佳培養(yǎng)基篩選

不同培養(yǎng)基對交枝頂孢霉的生長影響不同,在PDA培養(yǎng)基上CQBBW8菌株生長速率最快,為3.44 mm/d,其次是Czapek’s培養(yǎng)基和SYA培養(yǎng)基,在SEA培養(yǎng)基上菌絲生長最慢,為1.92 mm/d。產(chǎn)孢量在SEA培養(yǎng)基上最高,為6.43×105個/mm2,在察氏培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量最小,僅為0.54×105個/mm2(表 1)。

表1 CQBBW8菌株在不同培養(yǎng)基上的生長速率和產(chǎn)孢量1)

Table 1 The growth rates and spore production of CQBBW8 strain on different media

培養(yǎng)基Medium生長速率/mm·d-1Growthrate產(chǎn)孢量/×105個·mm-2Sporeproduction薩氏培養(yǎng)基SDAY(2.26±0.03)c(4.11±0.38)b薩氏蛋黃培養(yǎng)基SEA(1.92±0.09)d(6.43±0.03)a察氏培養(yǎng)基Czapek’s(2.99±0.16)b(0.54±0.17)e馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基PDA(3.44±0.72)a(1.53±0.28)d淀粉瓊脂培養(yǎng)基SYA(2.90±0.14)b(2.79±0.26)c

1) 數(shù)值為平均值±標準誤。同列數(shù)值后不同小寫英文字母表示在0.05水平差異顯著(Duncan’s 多重比較法)。下同。 Data are means±SE; the different letters in the same column indicate significant difference at 0.05 level by Duncan’s multiple range test. The same below.

2.3 碳、氮源對CQBBW8菌株的影響

交枝頂孢霉在8種碳源培養(yǎng)基上均可生長,其中甘露醇對菌絲生長最為有利,生長速率為3.19 mm/d,其次為淀粉和蔗糖,對甘油和乳糖的利用最差,生長速率分別為2.70 mm/d和2.69 mm/d。該菌株在以淀粉為碳源的培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量最大,為1.33×105個/mm2,以甘露醇為碳源的產(chǎn)孢量最低,為2.07×104個/mm2(表 2)。

表2 不同碳源對CQBBW8菌株生長和產(chǎn)孢量的影響

Table 2 Effects of carbon sources on mycelium growth and conidial production of CQBBW8 strain

碳源Carbonsource生長速率/mm·d-1Growthrate產(chǎn)孢量/×104個·mm-2Sporeproduction淀粉Solublestarch(3.00±0.10)b(13.32±0.63)a葡萄糖Glucose(2.94±0.04)bc(6.24±0.19)d甘露醇Mannite(3.19±0.11)a(2.07±0.12)h麥芽糖Maltose(2.80±0.05)cd(2.75±0.39)g肌醇Inositol(2.94±0.17)bc(6.76±0.62)c甘油Glycerol(2.70±0.10)d(3.30±0.28)f乳糖Lactose(2.69±0.13)d(10.49±0.53)b蔗糖Sucrose(2.99±0.16)b(5.37±0.17)e

不同氮源對菌絲生長和產(chǎn)孢的影響見表3。該菌株均能在這7種氮源的培養(yǎng)基上生長,經(jīng)方差分析顯示,蛋白胨最有利于菌絲的生長,生長速率為3.36 mm/d,賴氨酸最不利于菌絲的生長,生長速率為2.21 mm/d。產(chǎn)孢量在以氯化銨為氮源的培養(yǎng)基上最大,為1.99×105個/mm2,最差為甘氨酸,僅為1.96×104個/mm2。

表3 不同碳源對CQBBW8菌株生長和產(chǎn)孢量的影響

Table 3 Effects of nitrogen sources on mycelium growth and conidial production of CQBBW8 strain

氮源Nitrogensource生長速率/mm·d-1Growthrate產(chǎn)孢量/×104個·mm-2Sporeproduction尿素Urea(2.45±0.07)d(5.11±0.05)e甘氨酸Glycine(2.78±0.04)c(1.96±0.50)g硝酸銨Ammoniumnitrate(2.43±0.08)d(12.74±0.28)b蛋白胨Peptone(3.36±0.03)a(10.22±0.36)c硝酸鉀Potassiumnitrate(3.24±0.05)b(6.60±0.48)d賴氨酸Lysine(2.21±0.03)f(2.51±0.03)f氯化銨Ammoniumchlo-ride(2.34±0.05)e(19.93±0.26)a

2.4 不同溫度對CQBBW8菌株菌絲生長、產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)的影響

試驗結(jié)果表明:CQBBW8菌株在10～30 ℃均能生長,最佳生長溫度為25 ℃,平均生長速率為3.06 mm/d。在10 ℃生長最慢,生長速率為0.64 mm/d,在35、40 ℃不能生長(表 4)。該菌產(chǎn)孢的溫度范圍為10～30 ℃,在30 ℃時產(chǎn)孢量最大,為3.39×105個/mm2。分生孢子在10～35 ℃均能萌發(fā),最適溫度為25 ℃,萌發(fā)率為42.56%,在40 ℃不萌發(fā)。

表4 溫度對CQBBW8菌株菌絲生長、產(chǎn)孢量和
分生孢子萌發(fā)的影響

Table 4 Effects of different temperatures on mycelium growth, conidial production and germination of CQBBW8 strain

溫度/℃Temperature生長速率/mm·d-1Growthrate產(chǎn)孢量/×104個·mm-2Sporeproduction分生孢子萌發(fā)率/%Conidialgerminationrate10(0.64±0.03)d(7.34±0.08)d(3.56±0.005)f15(1.33±0.08)c(3.97±0.30)e(16.44±0.007)c20(2.36±0.05)b(12.93±0.21)c(25.11±0.008)b25(3.06±0.06)a(15.29±0.28)b(42.56±0.007)a30(2.47±0.10)b(33.87±0.43)a(14.89±0.017)d35(0.00±0.00)e(0.00±0.00)f(6.56±0.005)e40(0.00±0.00)e(0.00±0.00)f(0.00±0.000)g

2.5 不同pH對菌絲生長、產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)的影響

從表5可以看出,CQBBW8在pH 為5.0～11.0條件下菌絲均能生長,在pH為6.0～8.0范圍內(nèi)生長速率相對較快,最適生長pH為6.0,生長速率為3.03 mm/d。產(chǎn)孢范圍為pH 5.0～11.0,最適產(chǎn)孢pH為6.0,產(chǎn)孢量為3.16×105個孢子/mm2,在pH為11.0時產(chǎn)量最少,僅為1.01×105個孢子/mm2。分生孢子在pH 5.0～9.0內(nèi)均能萌發(fā),萌發(fā)率隨著pH的增大呈先升高后下降的趨勢,在pH為7.0時萌發(fā)率最高為13.56%,在pH 10.0和11.0不萌發(fā)。

2.6 紫外照射對CQBBW8菌株菌絲生長、產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)的影響

紫外線照射不同時間對CQBBW8菌株的影響見表 6。從表中可知,紫外照射5 min顯著降低了該菌株的生長速率,為3.04 mm/d,其他處理對菌絲生長速率的影響無顯著差異。但是紫外照射對產(chǎn)孢量影響較大,紫外線照射30 min的產(chǎn)孢量最低,為2.38×105個孢子/mm2,紫外線照射10 min的產(chǎn)孢量最高,為4.43×105個孢子/mm2。隨著紫外照射時間的延長,孢子萌發(fā)率逐漸增高,紫外線照射60 min時孢子萌發(fā)率達到64.33%。

表5 pH對CQBBW8菌株菌絲生長、產(chǎn)孢量和
分生孢子萌發(fā)的影響

Table 5 Effects of pH value on mycelium growth, conidial production and germination of CQBBW8 strain

pH生長速率/mm·d-1Growthrate產(chǎn)孢量/×105個·mm-2Sporeproduction分生孢子萌發(fā)率/%Conidialgerminationrate5.0(2.59±0.13)c(2.42±0.35)c(8.22±0.004)c6.0(3.03±0.11)a(3.16±0.46)a(10.78±0.004)b7.0(2.95±0.08)ab(2.45±0.69)b(13.56±0.005)a8.0(2.98±0.09)ab(2.39±0.31)d(10.67±0.007)b9.0(2.88±0.13)ab(1.56±0.34)e(4.00±0.003)d10.0(2.85±0.10)b(1.56±0.34)e(0.00±0.00)e11.0(2.59±0.11)c(1.01±0.62)f(0.00±0.00)e

表6 紫外照射對CQBBW8菌株菌絲生長、
產(chǎn)孢量和分生孢子萌發(fā)的影響

Table 6 Effects of UV radiation on mycelium growth, conidial production and germination of CQBBW8 strain

紫外照射時間/minUVirradiationtime生長速率/mm·d-1Growthrate產(chǎn)孢量/×105個·mm-2Sporeproduction分生孢子萌發(fā)率/%Conidialgerminationrate0(3.19±0.01)a(2.54±0.43)g(27.78±0.008)h5(3.04±0.02)b(2.75±0.46)c(31.67±0.009)g10(3.17±0.01)a(4.43±0.59)a(39.56±0.008)f20(3.19±0.02)a(4.26±0.35)b(42.78±0.024)e30(3.22±0.00)a(2.38±0.36)h(49.11±0.008)d40(3.22±0.01)a(2.56±0.50)f(55.89±0.008)c50(3.09±0.02)ab(2.64±0.63)e(60.22±0.010)b60(3.19±0.02)a(2.65±0.52)d(64.33±0.010)a

2.7 CQBBW8菌株與殺菌劑的相容性篩選

從表7可以看出,250 g/L吡唑醚菌酯WP與交枝頂孢霉的相容性最差,EC50值為1.502 1 mg/mL,其次為50%多菌靈WP、40%氟硅唑EC、43%戊唑醇EC等,EC50分別為2.102 6、6.260 2和10.282 8 mg/mL。氧化亞銅與交枝頂孢霉的相容性最好,EC50為6.24×1027mg/mL,其次為70%丙森鋅WP和25%嘧菌酯SC。

從表8可以看出,20%四螨嗪SC與交枝頂孢霉的相容性最好,其次為240 g/L螺螨酯SC,5% 唑螨酯SC的相容性最差,需盡可能減少配合使用次數(shù)。

表7 11種殺菌劑與交枝頂孢霉的相容性1)

Table 7 Compatibility of 11 fungicides withAcremoniumimplicatumstrain

藥劑Fungicide毒力回歸方程ToxicregressionequationEC50/mg·mL-1相關(guān)系數(shù)(r)Correlationcoefficient86.2%氧化亞銅WP 86.2%cuprousoxideWPY=3.7888+0.0436X6.24×10270.900470%丙森鋅WP 70%propinebWPY=4.1648+0.3350X311.03570.908025%嘧菌酯SC 25%azoxystrobinSCY=4.3151+0.3199X138.36000.936310%苯醚甲環(huán)唑DP 10%difenoconazoleDPY=4.0692+0.4746X91.50300.901460%唑醚·代森聯(lián)WG 60%pyraclostrobin·metiramWGY=4.3536+0.4073X38.65370.914120%甲基硫菌靈SC 20%thiophanate-methylSCY=4.4640+0.4115X20.06830.900550%喹啉銅WP 50%oxine-copperWPY=3.6342+1.1287X16.22200.900243%戊唑醇SC 43%tebuconazoleSCY=4.4334+0.5598X10.28280.946640%氟硅唑EC 40%flusilazoleECY=4.7628+0.2978X6.26020.919150%多菌靈WP 50%carbendazimWPY=4.8363+0.5073X2.10260.9009250g/L吡唑醚菌酯WP 250g/LpyraclostrobinWPY=4.9637+0.2056X1.50210.9123

表8 5種殺螨劑對交枝頂孢霉生長的抑制作用

Table 8 Growth inhibitory effect of 5 kinds of acaricides onAcremoniumimplicatumstrain

殺螨劑Acaricide高濃度/μg·mL-1Highconcentration抑制率/%Inhibitionrate中濃度/μg·mL-1Mediumconcentration抑制率/%Inhibitionrate低濃度/μg·mL-1Lowconcentration抑制率/%Inhibitionrate240g/L螺螨酯SC 240g/LspirodiclofenSC6015.90405.10155.025%唑螨酯SC 5%fenpyroximateSC6020.504025.521524.2720%四螨嗪SC 20%clofentezineSC1000602.51202.5115%噠螨靈EC 15%pyridabenEC2521.341517.99511.7222.4%螺蟲乙酯SC 22.4%spirotetramatSC5015.063019.251015.06

3 討論

2012年姜立波等[16]的研究發(fā)現(xiàn)1×106個/mL頂孢霉孢子對二斑葉螨的校正致死率為23.33%,LT50為 9.57 d;2013年王婧[17]的研究表明,當頂孢霉孢子濃度為1×106個/mL時,對二斑葉螨的校正殺螨率為30.95%;本試驗結(jié)果表明,交枝頂孢霉CQBBW8菌株分生孢子濃度為1.27×106個/mL時對柑橘全爪螨雌成螨的校正致死率高達54.42%,LC50和LT50分別為1.2×106個/mL和6.55 d,與以上研究報道的致死率相比有更好的殺螨效果。這也可能是由于菌株種類和葉螨種類不同、殺螨評價技術(shù)體系不一致等因素導致殺螨結(jié)果的差異,但同時也說明了CQBBW 8菌株具有生防潛力和開發(fā)為殺螨真菌制劑的價值。

從不同環(huán)境中分離到的不同生理小種的頂孢霉對營養(yǎng)的需求不盡相同。宋麗雯等[19]的研究顯示薩氏培養(yǎng)基和薩氏蛋黃培養(yǎng)基最有利于頂孢霉A.hansfordiiAhy1菌落的生長和產(chǎn)孢,最佳生長和產(chǎn)孢碳源為葡萄糖和蔗糖,對甘油利用最差,最佳氮源為蛋白胨,氯化銨最差;孫冬梅等[20]報道桃色頂孢霉A.persicinum生長最佳碳源為蔗糖,不能利用纖維素,最佳氮源為胰蛋白胨,尿素最差;徐婧等[21]的研究表明葫蘆科枝頂孢霉A.cucurbitacearum在PDA等培養(yǎng)基上生長良好,最適宜菌株生長的碳源為可溶性淀粉和麥芽糖,氮源為酵母膏、蛋白胨,對硝酸銨和氯化銨的利用較差。本試驗結(jié)果與以上研究結(jié)果基本一致,總的來說,CQBBW8菌株能夠利用多種碳源和氮源進行生長,對營養(yǎng)條件要求不高,易于培養(yǎng)。

菌株對環(huán)境條件適應性的強弱直接影響其能否在自然界中穩(wěn)定存在。桃色頂孢霉[20]生長的最適pH8.5,最適溫度為30℃;葫蘆科枝頂孢霉A.cucurbitacearum[22]在5～33℃范圍內(nèi)均可生長,最適宜溫度為25℃,超過35℃病菌不能生長。生長的pH范圍為5～12,最適宜pH為8?？禃曰鄣萚22]報道點枝頂孢霉A.strictum菌絲體生長的溫度范圍是10～25℃,在20～25℃生長最快,低于10℃或溫度達到30～35℃時生長緩慢,40℃或45℃時菌絲體不生長;菌絲體生長以及孢子萌發(fā)最適宜pH范圍為7～8,pH低于4或高于8菌絲不生長，孢子難以萌發(fā);紫外照射對大多數(shù)真菌孢子都具有一定的殺傷力,張海英[23]研究了紫外線照射處理對頂孢霉A.hansfordii分生孢子萌發(fā)的影響,結(jié)果顯示隨著照射時間的不斷延長,分生孢子的萌發(fā)率也逐漸降低。本試驗結(jié)果與以上研究結(jié)果也基本一致,均表明頂孢霉具有較寬的溫度和酸堿適應范圍,比較適宜在25～30℃、中性環(huán)境中生長。本研究最值得一提的是,紫外線照射處理對CQBBW8菌株生長和產(chǎn)孢影響不大,而且隨著紫外線照射時間的延長,孢子萌發(fā)率逐漸增高。相較而言,抗逆性較高的CQBBW8菌株更易于在重慶這種高溫高濕、紫外線較強的環(huán)境中存活,能在田間施用后達到持續(xù)控制害螨的作用。

此外,筆者還研究了11種殺菌劑和5種殺螨劑與交枝頂孢霉的相容性,結(jié)果顯示氧化亞銅、四螨嗪與交枝頂孢霉的相容性最好。2012年姜立波等[16]研究了常用殺螨劑與頂孢霉Ahy1菌株的相容性及協(xié)同作用,結(jié)果顯示噠螨靈、蟲螨腈、螺螨酯與頂孢霉混用對二斑葉螨有一定的協(xié)同作用,菌藥復配使用能夠提高殺螨效果。因此篩選與蟲生真菌相容的化學藥劑二者復配使用,不僅能夠有效克服生防真菌制劑潛伏期長、藥效緩慢的問題,同時還可以大幅降低化學藥劑的施用量,對有效控制害蟲、減少化學農(nóng)藥殘留和環(huán)境保護具有重要意義。

綜上所述,交枝頂孢霉CQBBW8菌株對柑橘全爪螨具有較高致病力,具有開發(fā)成為殺螨真菌制劑的潛力。下一步我們將系統(tǒng)研究CQBBW8對二斑葉螨、蚜蟲、粉虱等柑橘害蟲的殺蟲效果,擴大其殺蟲譜,以期為田間柑橘病蟲害的綜合防治做出貢獻。同時CQBBW8菌株對營養(yǎng)需求不高,環(huán)境適應性較強,易于大批量培養(yǎng),與氧化亞銅等殺菌劑和多種殺螨劑相容性較好,其生物學特性的闡明為后期菌株快速培養(yǎng)和開發(fā)為殺蟲真菌制劑防治柑橘全爪螨及其他害蟲奠定基礎,使利用微生物農(nóng)藥來實現(xiàn)生物防控柑橘病蟲害成為可能[24]。

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(責任編輯：田 喆)

Biological characteristics and acaricidal activity ofAcremoniumimplicatumtoPanonychuscitri(McGregor)

Wang Juan, Hu Junhua, Long Yanling, Zhou Na, Peng Fengge, Yao Tingshan, Li Hongjun

(CitrusResearchInstitute,SouthwestUniversity,NationalEngineeringResearchCenterforCitrus,ScientificObservationandExperimentalStationofFruitTreeScience(SouthwestRegion),MinistryofAgriculture,Chongqing400712,China)

To explore the acaricidal activity and biological characteristics ofAcremoniumimplicatumCQBBW8, the lethal rate of CQBBW8 strain toPanonychuscitri(McGregor) was detected by using contact toxicity method, and the effects of different factors, such as culture medium, carbon source, nitrogen source, temperature, pH, and UV on the hyphal growth, sporulation and spore germination ofA.implicatumwere tested by using single factor test. The results indicated that the corrected mortality rate of CQBBW8 strain toP.citriwas 54.42%; the LC50was 1.2×106spores/mL and the LT50was 5.175 9 d. The optimum growth and sporulation culture medium were PDA and SEA. Mannite and peptone were the best carbon and nitrogen sources for hyphal growth, and soluble starch and ammonium chloride were the best carbon and nitrogen sources for sporulation, respectively. The most suitable culture temperature for hyphal growth was 25℃, and the most suitable temperature for sporulation and spore germination was 30℃. The optimum pH for hyphal growth and sporulation was 6.0, and the optimum pH for spore germination was 7.0. Although UV had no significant effect on fungal growth rate, it had a marked effect on sporulation; the longer the ultraviolet irradiation time, the higher the rate of spore germination. In summary, CQBBW8 strain had a strong toxicity toP.citri, without a high nutritional demand, and its environmental adaptability was strong, with a potential for development of the fungus preparation for killing mites.

Acremoniumimplicatum; biological characteristic; acaricidal activity

2016-04-20

2016-06-10

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201103020);重慶市科技支撐示范工程(cstc2014fazktjcsf0075);“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計劃課題(2014BAD16B702-5)

S 476.1

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.02.015

* 通信作者 E-mail:hujunhua@cric.cn