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    清腸溫中方對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠干擾素γ誘導(dǎo)蛋白10的影響*

    2017-03-27 09:18:14毛堂友謝添弘賈博宜劉佳麗韓亞飛丁龐華李軍祥
    關(guān)鍵詞:清腸潰瘍性結(jié)腸炎

    毛堂友,史 瑞,謝添弘,郭 一,陳 晨,石 磊,賈博宜,劉佳麗,譚 祥,韓亞飛,丁龐華,李軍祥

    (北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院脾胃肝膽科 北京 100078)

    潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種病因尚不十分清楚的結(jié)腸和直腸的慢性非特異性炎癥性疾病[1,2],好發(fā)于年輕人,其腹痛、腹瀉、黏液膿血便的臨床主癥嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量,被世界衛(wèi)生組織列為現(xiàn)代難治病之一[3]。本課題組前期研究[4]發(fā)現(xiàn),清腸溫中方能夠明顯改善潰瘍性結(jié)腸炎患者的臨床癥狀,抑制炎癥反應(yīng),修復(fù)腸粘膜損傷,總有效率為93.48%。但具體的作用機制尚不清楚。研究[5]顯示,干擾素γ誘導(dǎo)蛋白10(Interferon gamma inducible protein 10,IP10)介導(dǎo)的炎癥反應(yīng),是導(dǎo)致潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病的主要機制之一。因此,本研究將從IP10及IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α、INF-γ等炎癥因子入手,探討清腸溫中方治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用機制。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物

    健康SD大鼠,雄性,SPF級,體重(200±20)g,購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司(許可證號:SCXK(京)2011-0004),常規(guī)飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所SPF級動物房,12小時光照/黑夜循環(huán),溫度(20-24)℃,濕度50-60%;自由飲食飲水飼養(yǎng)。

    1.2 藥物

    清腸溫中方的方藥組成:黃連,炮姜,苦參,三七,青黛,煨木香,地榆炭,炙甘草,劑型為配方顆粒,由北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院配方顆粒藥房統(tǒng)一購自于北京康仁堂藥業(yè)有限公司,保證所用藥品為同一批次,并進(jìn)行鑒定質(zhì)控。按實驗動物與人體體表面積比等效量核算比率,計算動物的等效劑量。實驗時以燒開的去離子水配制成所需濃度,放冰箱保存,每天配藥一次。美沙拉嗪腸溶片(mesalazine,商品名:莎爾福)購自德國Losan Pharma GmbH公司。

    1.3 試劑與儀器

    葡聚糖硫酸鈉(MW36-50KDa;MP Biomedical,Burlingame,CA,USA),便潛血試紙(珠海貝索生物技術(shù)有限公司);大鼠IL-1α酶聯(lián)免疫試劑盒(Multiscience,EK301A2/2),大鼠IL-1β酶聯(lián)免疫試劑盒(Multiscience,EK301B2/2),大鼠IL-6酶聯(lián)免疫試劑盒(Multiscience,EK3062/2),大鼠TNF-α酶聯(lián)免疫試劑盒(Multiscience,EK3821/2),大鼠INF-γ酶聯(lián)免疫試劑盒(Multiscience,EK3802/2),IP10抗體(abcam,Ab7206),Beta actin抗體(中杉金橋,TA-09)PV9000超敏二步法免疫組化檢測試劑購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。UCT型超薄切片機(德國萊卡公司),顯微鏡(尼康顯微鏡ECLIPSE LV100POL/50IPOL,日本),全自動多功能酶標(biāo)儀(MULTISKAN MK3,美國),電熱恒溫培養(yǎng)箱(DH4000A,天津)等。

    1.4 分組、造模及標(biāo)本采集

    本課題組的動物模型建立方法如前期研究[6],繼續(xù)采用自由飲用4.5%DSS溶液制備潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型,將70只健康SPF級雄性SD大鼠(體重200±20 g)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,以4.5%DSS(MW:36 000-50 000,MP Biomedical)溶液自由飲水7天,普通飼料喂養(yǎng),晝/夜12/12 h交替,溫度25℃,濕度60%。同時運用隨機數(shù)字表法將大鼠隨機均等分為6組:正常組,模型組,清腸溫中方低劑量組(0.3 g/kg/day),清腸溫中方中劑量組(0.6 g/kg/day),清腸溫中方高劑量組(1.2 g/kg/day),美沙拉嗪組(0.03 g/kg/day)。造模的同時各組均以相應(yīng)藥物灌胃治療7天。每日稱取大鼠體重,檢測便潛血,確保造模7天中大鼠均維持便血狀態(tài),造模結(jié)束后查看大鼠結(jié)腸病理,結(jié)腸黏膜病變不超過黏膜下層,炎癥細(xì)胞侵潤明顯,使得模型維持在炎癥階段,避免異型增生的干預(yù)。各組大鼠,末次給藥后,禁食不禁水,24 h后取材,分離遠(yuǎn)端結(jié)腸10 cm,-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

    1.5 ELSIA法檢測結(jié)腸組織炎癥因子(IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α、INF-γ)的表達(dá)

    將凍存的結(jié)腸解凍后,在研缽里用眼科剪切成小片,并轉(zhuǎn)入勻漿器中加入3倍生理鹽水充分勻漿,1000r,4℃離心10 min,取上清液用于檢測。

    1.6 免疫組化檢測結(jié)腸IP10的表達(dá)

    4 μm厚的石蠟切片經(jīng)過脫蠟、復(fù)水、高壓修復(fù)、封閉后,按照試劑盒說明進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色(IP10抗體濃度1:5 000,Beta actin抗體濃度1:1 000),以PBS為陰性對照,200倍鏡視野下采集圖片,應(yīng)用image pro plus 6.0軟件分析圖像,計算光密度(IOD)和染色區(qū)域總面積(area),其中以IOD表示目的蛋白表達(dá)量,以area表示目的蛋白分布及表達(dá)總面積,最后用平均光密度(IOD/area的比值)來進(jìn)行統(tǒng)計分析。

    1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

    所有的數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件(IBM Corp,Armonk,NY,USA)分析,數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差 (±s)表示。符合正態(tài)分布且方差齊進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA),不符合正態(tài)分布或方差不齊進(jìn)行非參數(shù)檢驗,均為組間比較,P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

    2 結(jié)果

    2.1 結(jié)腸IL-1α、IL-1β

    與正常組比較,模型組大鼠結(jié)腸IL-1α、IL-1β的表達(dá)水平顯著增高(P<0.01);與模型組比較,清腸溫中方中劑量組、高劑量組和美沙拉嗪組大鼠結(jié)腸的IL-1α、IL-1β表達(dá)水平均降低(P<0.05,P<0.01),清腸溫中方低劑量組大鼠結(jié)腸IL-1β表達(dá)水平較模型組降低(P<0.05),清腸溫中方低劑量組大鼠結(jié)腸IL-1α表達(dá)水平較模型組降低,但無統(tǒng)計學(xué)意義,見表1。

    2.2 結(jié)腸IL-6、TNF-α

    與正常組比較,模型組大鼠結(jié)腸IL-6、TNF-α的表達(dá)水平顯著增高(P<0.05,P<0.01);與模型組比較,清腸溫中方中劑量組、高劑量組和美沙拉嗪組大鼠結(jié)腸的IL-6表達(dá)水平均降低(P<0.05,P<0.01),清腸溫中方低劑量組大鼠結(jié)腸IL-6表達(dá)水平較模型組降低(P<0.01),清腸溫中方低劑量組大鼠結(jié)腸TNF-α表達(dá)水平較模型組降低,但無統(tǒng)計學(xué)意義,見表2。

    2.3 結(jié)腸INF-γ

    與正常組比較,模型組大鼠結(jié)腸IFN-γ的表達(dá)水平顯著增高(P<0.01);與模型組比較,清腸溫中方中劑量組、高劑量組和美沙拉嗪組大鼠結(jié)腸的IFN-γ表達(dá)水平均降低(P<0.05,P<0.01),清腸溫中方低劑量組大鼠結(jié)腸IFN-γ表達(dá)水平較模型組降低,但無統(tǒng)計學(xué)意義,見表3。

    2.4 結(jié)腸IP10

    正常組大鼠結(jié)腸組織中的IP10陽性表達(dá)很少,模型組中IP10陽性表達(dá)區(qū)域主要在腸黏膜層、黏膜肌層、肌層、漿膜層等,經(jīng)過治療后,各治療組較模型組的表達(dá)相對較少,其組織切片陽性表達(dá)染色主要為深棕黃色或褐色,見圖1。與正常組相比,模型組IP10的平均光密度明顯升高(P<0.01);而經(jīng)過干預(yù)后,清腸溫中方各劑量組和美沙拉嗪組大鼠結(jié)腸的IP10平均光密度較模型組顯著降低(P<0.01,P<0.05),見表4。

    表1 清腸溫中方對DSS誘導(dǎo)的UC大鼠結(jié)腸IL-1α、IL-1β的影響(±s)

    表1 清腸溫中方對DSS誘導(dǎo)的UC大鼠結(jié)腸IL-1α、IL-1β的影響(±s)

    注:與正常組比較,##P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01

    表2 清腸溫中方對DSS誘導(dǎo)的UC大鼠結(jié)腸IL-6、TNF-α的影響 (±s)

    表2 清腸溫中方對DSS誘導(dǎo)的UC大鼠結(jié)腸IL-6、TNF-α的影響 (±s)

    注:與正常組比較,#P<0.05,##P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01

    表3 清腸溫中方對DSS誘導(dǎo)的UC大鼠結(jié)腸IFN-γ的影響 (±s)

    表3 清腸溫中方對DSS誘導(dǎo)的UC大鼠結(jié)腸IFN-γ的影響 (±s)

    注:與正常組比較,##P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01

    表4 清腸溫中方對DSS誘導(dǎo)的UC大鼠結(jié)腸IP10的影響 (±s)

    表4 清腸溫中方對DSS誘導(dǎo)的UC大鼠結(jié)腸IP10的影響 (±s)

    注:與正常組比較,##P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01

    圖1 清腸溫中方對UC大鼠結(jié)腸IP10蛋白的影響(IHC,×200)

    3 討論

    目前,UC的發(fā)病機制仍未完全闡明,目前大多學(xué)者認(rèn)為持續(xù)腸道感染、腸黏膜屏障缺損、腸黏膜免疫調(diào)節(jié)異常、遺傳和環(huán)境等因素共同參與了疾病發(fā)生過程[7]。其中,持續(xù)的腸道感染是導(dǎo)致UC發(fā)病的關(guān)鍵因素。

    干擾素γ誘導(dǎo)蛋白10在UC的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。IP10屬于ELR陰性的CXC亞家族的內(nèi)生趨化因子,在IFN-γ誘導(dǎo)下由多種細(xì)胞如成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等分泌[8],也可以在脂多糖、前炎癥因子如IFN-α/β及TNF-α等刺激下分泌[9]。CXCR3是IP10唯一的受體,IP10與CXCR3特異性結(jié)合后,能夠促進(jìn)CXCR3+細(xì)胞的趨化活性[10],從而觸發(fā)多步驟的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,使CXCR3陽性靶細(xì)胞T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞、NK細(xì)胞等向局部炎癥病灶趨化。其中,被募集的T細(xì)胞在活化后主要分泌IL-2、TNF-β、IFN-γ;巨噬細(xì)胞主要分泌TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18、IL-12、IL-23、IFN-γ等炎性因子[11];而局部分泌增加的TN F-α、IFN-γ等炎癥因子一方面刺激產(chǎn)生更多IP10,進(jìn)一步募集更多的免疫細(xì)胞,形成惡性循環(huán);另一方面可直接或間接損傷腸黏膜屏障,從而損傷腸黏膜[12],促進(jìn)潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生發(fā)展。

    本次實驗中,模型組大鼠結(jié)腸IP10的表達(dá)水平較正常組大鼠顯著增高,這與這與既往實驗結(jié)果相一致[13,14],同時,結(jié)腸組織的炎癥因子(IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α、INF-γ)也呈現(xiàn)高表達(dá),表明DSS能夠誘結(jié)腸IP10的表達(dá),促進(jìn)炎癥因子的產(chǎn)生,從而加強炎癥反應(yīng),加重腸黏膜的損傷;而經(jīng)過干預(yù)后,清腸溫中方各劑量組的IP10及炎癥因子(IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α、INF-γ)的表達(dá)水平均下降,說明清腸溫中方能夠通過抑制IP10的表達(dá),下調(diào)結(jié)腸炎癥因子(IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α、INF-γ)的水平,從而抑制腸道抑制炎癥。

    本次研究通過動物實驗探討了IP10對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的調(diào)控機制,對清腸溫中方治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用機制做了初步研究,進(jìn)一步深化了潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病機制的認(rèn)識,為臨床運用清腸溫中方治療潰瘍性結(jié)腸炎提供了良好的實驗依據(jù),但深入的作用機制有待于進(jìn)一步研究。

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