水稻稻曲病菌拮抗菌的分離、篩選與抑菌活性測(cè)定

朱哲遠(yuǎn)，彭 迪，李祖任，王立峰，柏連陽(yáng)

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125）

水稻稻曲病是稻綠核菌（Ustilaginoidea virens）侵染稻谷引起的真菌病害。該病分布廣泛，在亞洲、美洲、非洲和歐洲等地稻區(qū)都有發(fā)生，這些地區(qū)病害的報(bào)道也越發(fā)頻繁[1-3]。近年來(lái)，隨著大規(guī)模水稻種植和化肥大量使用，優(yōu)質(zhì)稻和雜交稻被侵染的情況增多，影響我國(guó)中晚稻比重較大。感染稻曲病的谷粒又被稱為“豐收果”，因?yàn)椴【谇秩具^(guò)程中形成孢子球不斷膨脹，包裹整個(gè)谷粒，降低水稻生產(chǎn)質(zhì)量，同時(shí)分泌真菌毒素（Ustiloxins），造成動(dòng)植物的細(xì)胞分裂受到抑制，對(duì)人畜有毒害作用[4]。所以稻曲病的防控在水稻生產(chǎn)中至關(guān)重要，關(guān)系著糧食生產(chǎn)安全和農(nóng)田生態(tài)環(huán)境安全。

稻曲病是水稻生產(chǎn)中重要的危害病害之一，采取的防控措施主要有化學(xué)藥劑防控、生防微生物防控和使用抗病品種等[5]?；瘜W(xué)藥劑防控主要在種子處理和侵染前或初期防治，但是在病害發(fā)生程度較深時(shí)，防控效果明顯降低，且化學(xué)農(nóng)藥對(duì)生態(tài)環(huán)境的影響日益受到重視[6-7]。在抗病品種選育方面，目前對(duì)水稻抗病機(jī)理研究尚不明確，選育方向還集中于從水稻類型出發(fā)，該方法不能使高產(chǎn)量和高質(zhì)量方面同時(shí)兼?zhèn)鋄8-10]。遵循“預(yù)防為主，綜合防治”的植保方針，發(fā)展生物農(nóng)藥防控病害的研究，是結(jié)合化學(xué)藥劑和田間管理措施等綜合防控方法的必要組成，也是解決稻曲病危害的重要方向。

近年來(lái)，生防微生物在水稻病害防控方面研究進(jìn)展迅速[11-12]。以芽孢桿菌（Bacillus spp.）為代表的拮抗菌在防治水稻紋枯病、稻瘟病和白葉枯病等病害上相繼取得了一系列成果，水稻稻曲病菌的拮抗菌的報(bào)道較少[13-16]。本研究從野外水稻田土壤中分離篩選出對(duì)稻曲病菌有生長(zhǎng)抑制作用的拮抗細(xì)菌B-7，通過(guò)16S rDNA測(cè)序的方法對(duì)菌株進(jìn)行了鑒定，并測(cè)定了抑菌活性。初步研究了B-7的生防作用，為拮抗細(xì)菌田間應(yīng)用和微生物農(nóng)藥開(kāi)發(fā)提供了參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

水稻稻曲病菌（Ustilaginoidea virens）分離自長(zhǎng)沙周邊區(qū)縣發(fā)病水稻植株的谷粒，純培養(yǎng)后4℃保存。待篩菌株采用稀釋平板法分離自長(zhǎng)沙郊外稻田土壤中，與50%甘油1∶1混合，-20℃冰箱保存。

1.2 培養(yǎng)基

病原菌培養(yǎng)、拮抗菌篩選和抑菌活性測(cè)定所用培養(yǎng)基為PDA固體培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g，定容至1 000 mL，pH值7.0）。拮抗菌培養(yǎng)采用的是LB液體培養(yǎng)基（胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化鈉10 g，定容至1 000 mL，pH值7.0）。

1.3 待篩菌株的培養(yǎng)

取200 μL待篩菌株甘油保存液于20 mL LB液體培養(yǎng)基中，置于28℃恒溫?fù)u床200 r/min培養(yǎng)24 h后，取200 μL菌旋液置于20 mL LB液體培養(yǎng)基同條件培養(yǎng)39 h。

1.4 拮抗菌的篩選

采用劃線平板對(duì)峙法測(cè)定待篩選菌株對(duì)水稻稻曲病菌的抑制情況。取新鮮稻曲病菌接種于PDA平板兩周距中央6 cm處，用接種環(huán)沾取培養(yǎng)好的待篩菌株發(fā)酵液，在PDA平板中央呈直線由上而下劃線，設(shè)無(wú)劃線處理為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次，置于25℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，觀察、記錄抑菌現(xiàn)象，待空白對(duì)照兩個(gè)稻曲病菌菌絲相互接觸時(shí)，查看抑菌效果，測(cè)量平板中線與稻曲病菌邊緣形成的空白區(qū)域長(zhǎng)度。挑選空白區(qū)域較大，且作用持久的拮抗菌進(jìn)行復(fù)篩和抑菌活性試驗(yàn)。

1.5 拮抗菌的抑菌活性測(cè)定

抑菌活性測(cè)定采用K-B紙片擴(kuò)散法[17]。將水稻稻曲病菌接種于PDA平板中央，在兩周各6 cm處分別擺上已滅菌的直徑8 mm定性濾紙圓片，并用鑷子按壓固定。按照1.3的方法制備拮抗菌發(fā)酵液，用移液槍吸取10 μL，滴加至圓片上，待液體晾干。設(shè)不滴加拮抗菌菌液平板為空白對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。平板置于25℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，并觀察記錄生長(zhǎng)狀況，測(cè)量抑菌圈半徑（濾紙片圓心到水稻稻曲病菌最邊緣菌絲距離），觀察抑菌效果。按公式（1）計(jì)算抑菌活性。

1.6 拮抗細(xì)菌分子生物學(xué)鑒定

使用通用引物提取拮抗菌DNA序列，通過(guò)16S rDNA擴(kuò)增，進(jìn)行桑格測(cè)序后BLAST比對(duì)。分子生物學(xué)鑒定由擎科生物技術(shù)有限公司完成，BLAST比對(duì)使用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.7 拮抗細(xì)菌對(duì)稻曲病的田間防治效果

試驗(yàn)地位于長(zhǎng)沙縣高橋鎮(zhèn)，試驗(yàn)田為稻曲發(fā)病較嚴(yán)重的水稻田，水稻品種為農(nóng)香32。試驗(yàn)包括4個(gè)處理：拮抗細(xì)菌發(fā)酵液（含菌量為1×108CFU/mL）；拮抗細(xì)菌發(fā)酵液（含菌量為5×108CFU/mL）；藥劑對(duì)照生物農(nóng)藥紋曲寧；清水對(duì)照。每處理重復(fù)4次，共16個(gè)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)面積為30 m2（6 m×5 m）。各小區(qū)按隨機(jī)區(qū)組排列。在水稻破口前噴施藥劑，7 d后進(jìn)行第2次施藥。調(diào)查方法：每小區(qū)隨機(jī)選取2點(diǎn)，每點(diǎn)40穴，稻曲病記錄總穗數(shù)和病穗數(shù)，計(jì)算防治效果：

采用鄧肯氏新復(fù)極差（DMRT）法分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗細(xì)菌篩選

從水稻田土壤中分離出5株細(xì)菌菌株，通過(guò)劃線平板對(duì)峙法，對(duì)5株細(xì)菌菌株的抑菌效果進(jìn)行了測(cè)定。其中細(xì)菌菌株B-7對(duì)水稻稻曲病菌的抑菌效果最好，B-7與水稻稻曲病菌之間形成了明顯的空白區(qū)域。

2.2 拮抗菌B-7抑菌活性測(cè)定

篩選出拮抗菌B-7作為對(duì)水稻稻曲病菌有生長(zhǎng)抑制作用的拮抗菌，采用K-B紙片擴(kuò)散法進(jìn)行定量抑菌活性測(cè)定。試驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)39 h的恒溫培養(yǎng)之后，空白對(duì)照組稻曲病菌的菌絲生長(zhǎng)接近平板邊緣，抑菌半徑為0 cm，B-7菌株的生長(zhǎng)對(duì)稻曲病菌生長(zhǎng)的抑菌半徑達(dá)到1.4 cm（圖1），抑菌活性達(dá)到72.0%。表明B-7對(duì)水稻稻曲病菌有拮抗作用。

圖1 拮抗菌B-7對(duì)水稻稻曲病菌抑制效果

2.3 拮抗菌B-7的16S rDNA測(cè)序鑒定

拮抗菌B-7通過(guò)16S rDNA全長(zhǎng)測(cè)序之后，經(jīng)過(guò)NCBI上與已經(jīng)公開(kāi)的菌株序列進(jìn)行BLAST比對(duì)。結(jié)果表明拮抗菌B-7與數(shù)據(jù)庫(kù)中Bacillus cereus strain FORT 154的同源性達(dá)99%，初步鑒定為蠟質(zhì)芽孢桿菌（Bacillus cereus）。

2.4 拮抗菌B-7防治稻曲病田間防治效果

田間小區(qū)試驗(yàn)結(jié)果（表1）表明，蠟質(zhì)芽孢桿菌B-7對(duì)稻曲病的防治效果較好，相對(duì)于清水對(duì)照處理，其他3個(gè)處理的水稻紋枯病的發(fā)病率都有明顯的降低，其中5×108CFU/mL濃度的 B-7菌懸液處理的發(fā)病率最低，對(duì)稻曲病的防效達(dá)到了63.90%。

表1 蠟質(zhì)芽孢桿菌B-7防治稻曲病田間試驗(yàn)效果

3 結(jié)論與討論

水稻稻曲病對(duì)水稻生產(chǎn)的威脅不容忽視，病菌產(chǎn)生的菌粉對(duì)人畜、環(huán)境等方面都有較大的危害。為了減輕稻曲病對(duì)水稻生產(chǎn)的影響，一直采取化學(xué)藥劑防治，盲目、不科學(xué)使用化學(xué)農(nóng)藥和化肥，導(dǎo)致水稻稻曲病在種植地區(qū)大面積發(fā)生，對(duì)我國(guó)糧食生產(chǎn)、環(huán)境保護(hù)方面都造成了一定的負(fù)面影響。使用綜合防治的措施，將微生物、化學(xué)藥劑和田間治理等多種方式結(jié)合來(lái)治理水稻稻曲病等水稻病害，可以逐步改善農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境和水稻種植品質(zhì)。完善微生物拮抗菌的研究是其中一大重點(diǎn)。

從生態(tài)環(huán)境的角度出發(fā)，防治真菌病害的措施不再單一，采用生物菌防治的方式是一有力補(bǔ)充。鄢一笑等[18]分離出菌株F26-T，發(fā)現(xiàn)對(duì)水稻稻曲病菌有較強(qiáng)的抑菌作用，且能夠在水稻葉圍上定殖生長(zhǎng)。尹小樂(lè)等[19]從土壤中分離出枯草芽孢桿菌SF-62和SF-3-38，初步研究出對(duì)水稻稻曲病菌的拮抗性能。目前蠟質(zhì)芽孢桿菌的研究有很好的發(fā)展前景[20-21]。蠟質(zhì)芽孢桿菌具有強(qiáng)烈的抗真菌活性，陳劉軍等[22]研究蠟質(zhì)芽孢桿菌AR156能夠抑制水稻紋枯菌核的生長(zhǎng)，而且可以誘導(dǎo)水稻植株的體內(nèi)防御酶的提前表達(dá)，從而使水稻抗性顯著提升。

試驗(yàn)從拮抗菌分離、篩選和抑菌活性等方面，篩選出了有效抑制稻曲病菌生長(zhǎng)的拮抗細(xì)菌B-7，鑒定為蠟質(zhì)芽孢桿菌，田間試驗(yàn)結(jié)果表明其對(duì)稻曲病具有良好的防治效果。通過(guò)這一試驗(yàn)說(shuō)明了蠟質(zhì)芽孢桿菌在水稻病害防治上的重要作用，繼續(xù)研究蠟質(zhì)芽孢桿菌的誘導(dǎo)植物抗性表達(dá)，可以深層次了解生防機(jī)制，為微生物農(nóng)藥的開(kāi)發(fā)提供參考。

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