水稻紋枯病拮抗菌的篩選、鑒定及抑菌活性測定

彭 迪，朱哲遠(yuǎn),2，李祖任,2，王立峰，劉 洋，柏連陽,2

（1.湖南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所，湖南 長沙 410125；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，湖南長沙 410128；3.湖南省水稻研究所，湖南 長沙 410125）

水稻紋枯病由立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）侵染水稻所形成，世界各產(chǎn)稻國家均有分布，亞洲稻區(qū)危害最為嚴(yán)重，水稻感染后品質(zhì)出現(xiàn)明顯下降，嚴(yán)重時導(dǎo)致絕收[1-2]。該病被歸為土傳病害，立枯絲核菌等病原菌形態(tài)以菌絲或菌核在土壤中越冬，待溫度、濕度等條件適宜時會大量生長，在水稻生長中后期隨著田間氮肥的過量單一使用，水稻抗病性的降低，病原菌導(dǎo)致水稻感病，從而紋枯病流行爆發(fā)[3-4]。解決水稻紋枯病的根本措施是選育抗病品種，但目前還未能篩選到高抗或免疫品種，主要還是通過井岡霉素等化學(xué)藥劑來防治[5-6]。由于化學(xué)藥劑的使用存在農(nóng)藥殘留超標(biāo)、環(huán)境污染等諸多弊端，加上我國積極推進(jìn)農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展，提倡實施高效綠色防控措施，因此結(jié)合生物防治進(jìn)行綜合防治的方式成為當(dāng)今水稻紋枯病研究熱點。

拮抗微生物可作為生物防治材料控制水稻紋枯病的發(fā)生，近年已有學(xué)者發(fā)現(xiàn)了抗紋枯病的拮抗真菌、細(xì)菌和放線菌[7-10]。芽孢桿菌（Bacillus spp.）是當(dāng)前研究較廣、應(yīng)用較多的生防菌，它們在生長過程中產(chǎn)生了多種抗菌化合物。Wichitra等報道，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）NSRS 89-24中提取的β-1,3-葡聚糖酶和抗生素能夠降解紋枯病原菌等真菌細(xì)胞的細(xì)胞壁，控制病害的發(fā)生[11-13]。盧鈺升等[14]從水稻土壤中分離的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）GB58，與常規(guī)藥劑對比對水稻紋枯病防效提高了24%。游景茂[15]分離的枯草芽孢桿菌WJ-1，能在抑制菌絲生長同時導(dǎo)致菌絲生長畸形、潰解和內(nèi)部物質(zhì)泄漏。陳劉軍等[16]分離的蠟質(zhì)芽孢桿菌（Bacillus cerens）AR156對水稻紋枯病溫室防效達(dá)到73.06%，同時促進(jìn)水稻生物量增加了14.45%。因此，篩選出抑制病原菌和促進(jìn)植物生長的細(xì)菌是植物病害防治的重要方向。

為篩選出對水稻紋枯病菌的高效拮抗生防菌，湖南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所實驗室從野外采集并分離細(xì)菌菌株，采用劃線對峙方法篩選出對水稻紋枯病病菌有抑制作用的短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）B-2，采用紙片擴(kuò)散法測定菌株對紋枯病菌的室內(nèi)抑菌活性。

1 材料與方法

1.1 供試菌株與培養(yǎng)基

1.1.1 供試菌株 待篩菌株為實驗室從野外從不同水稻病健植株分離到的細(xì)菌菌株，按1∶1與甘油混合存于-20℃冰箱中。靶標(biāo)菌株為實驗室從野外感染水稻紋枯病的水稻葉片表面采集、分離和鑒定的水稻紋枯菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基 細(xì)菌培養(yǎng)基采用LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化鈉10 g，定容至1 000 mL，pH值7.0，用于生防細(xì)菌的發(fā)酵。真菌、生防平板試驗采用PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g，定容至1 000 mL，pH值7.0。

1.2 待篩選菌株發(fā)酵液制備

將待篩選菌株按0.5%的量接種于LB液體培養(yǎng)基中，在28 ℃下按200 r/min置于恒溫?fù)u床中，振蕩培養(yǎng)40 h，得到菌種發(fā)酵液。

1.3 拮抗菌篩選

采用劃線對峙法篩選對水稻紋枯病菌有生長抑制的細(xì)菌菌種，用接種環(huán)沾取待篩細(xì)菌菌株發(fā)酵液1環(huán)于已凝固的PDA平板中央劃線，劃線方式：從平板中央上邊緣垂直劃一條直線到下邊緣。距離中央菌液直線中點左右各6 cm處分別接種水稻紋枯病菌菌碟，設(shè)置3個重復(fù)和空白對照，空白對照不劃待篩菌株線。在25℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，待空白對照左右菌碟菌絲生長相交，測量水稻紋枯病菌邊緣和待篩菌株直線之間抑菌帶寬度，篩選出對水稻紋枯病菌抑制效果最好的細(xì)菌菌株。

1.4 拮抗菌抑菌活性測定

根據(jù)劃線對峙法篩選的結(jié)果，選擇對水稻紋枯病菌抑菌效果最好的細(xì)菌菌種，采用K-B紙片擴(kuò)散法測定細(xì)菌菌株的抑菌活性，按照1.2中方法制備細(xì)菌菌株發(fā)酵液[17]。將活化好的水稻紋枯病菌接種于PDA平板中央，滅菌鑷子夾取6 mm無菌濾紙片放置于與中心等距的左右兩方。用移液槍吸取10 μL細(xì)菌菌株發(fā)酵液到濾紙片中央，設(shè)置3個重復(fù)和空白對照。置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，測量抑菌圈半徑（濾紙片圓心到中央靶標(biāo)菌盤最邊緣菌絲距離）觀察抑菌效果。根據(jù)公式（1）計算抑菌活性。

1.5 拮抗菌的分子生物學(xué)鑒定

采用16S rDNA通用引物對細(xì)菌B-2的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增、序列測定和BLAST比對[18]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由擎科生物技術(shù)有限公司提供并進(jìn)行序列測定，同源性搜索比對使用NCBI數(shù)據(jù)庫。

1.6 拮抗細(xì)菌對水稻紋枯病的田間防治效果

試驗地位于長沙縣高橋鎮(zhèn)，試驗田為紋枯病發(fā)病較嚴(yán)重的水稻田，水稻品種為農(nóng)香32。2017年田間試驗包括4個處理：拮抗細(xì)菌發(fā)酵液（含菌量為1×108CFU/mL）；拮抗細(xì)菌發(fā)酵液（含菌量為5×108CFU/mL）；藥劑對照生物農(nóng)藥井岡霉素wp；清水對照。每處理重復(fù)4次，共16個小區(qū)，每個小區(qū)面積為30 m2（6 m×5 m）。各小區(qū)按隨機區(qū)組排列。水稻分蘗末期施藥1次，對水750 g/hm2噴霧，至水稻抽穗初期施用第2次，間隔10 d后在水稻齊穗期第3次用藥。

調(diào)查方法：第3次用藥后14 d分別調(diào)查各小區(qū)的發(fā)病情況。每小區(qū)調(diào)查200株，記載發(fā)病株和嚴(yán)重度（計算病株率、病情指數(shù)和防治效果）。調(diào)查方法按照《農(nóng)藥田間藥效試驗準(zhǔn)則》（一）進(jìn)行，分級標(biāo)準(zhǔn)如下：

0級：全株無病；1級：第四葉片及其以下各葉鞘、葉片發(fā)?。ㄒ詣θ~為第一片葉）；3級：第三葉片及其以下各葉鞘、葉片發(fā)?。?級：第二葉片及其以下各葉鞘、葉片發(fā)?。?級：劍葉葉片及其以下各葉鞘、葉片發(fā)病；9級：全株發(fā)病，提早枯死。

采用鄧肯氏新復(fù)極差（DMRT）法分析試驗數(shù)據(jù)的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌篩選結(jié)果

從野外水稻田采集、分離和純培養(yǎng)得到5株細(xì)菌菌株，以水稻紋枯病菌作為靶標(biāo)指示菌，篩選出有拮抗作用的菌株，其中B-2拮抗效果最好，水稻紋枯病菌外圍與中央生防菌株線形成空白區(qū)域最廣。

2.2 拮抗菌活性測定結(jié)果

試驗結(jié)果顯示，經(jīng)PDA平板對峙培養(yǎng)30 h后，B-2菌株對水稻紋枯病菌的平均抑菌圈半徑為1.6 cm（圖1），未加入拮抗菌種的對照處理平均抑菌圈半徑為0 cm。處理組與對照組差異較為明顯，B-2抑菌活性為85.33%，表明B-2菌株對水稻紋枯病菌有較明顯的抑制效果。

2.3 拮抗菌鑒定結(jié)果

通過分子生物學(xué)的方法，經(jīng)過PCR擴(kuò)增和公司的測序，將16S rDNA序列提交至NCBI中，用BLAST程序與數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)公開的序列進(jìn)行同源性比對，結(jié)果表明菌株B-2為短小芽孢桿菌。

2.4 拮抗菌B-2防治水稻紋枯田間防治效果

田間小區(qū)試驗結(jié)果表明（表1），短小芽孢桿菌B-2對紋枯病的防治效果較好，相對于清水對照處理，其他3個處理的水稻紋枯病的發(fā)病率都有明顯的降低，其中5×108CFU/mL濃度的B-2菌懸液處理的發(fā)病率最低，對紋枯病的防效達(dá)到了72.42%。

圖1 拮抗菌B-2對水稻紋枯病菌抑制效果

表1 短小芽孢桿菌B-2防治紋枯病田間試驗效果

3 結(jié)論與討論

研究結(jié)果表明，B-2在室內(nèi)平板試驗中對水稻紋枯病菌的拮抗抑制作用明顯。試驗中采取劃線對峙法篩選拮抗菌種，通過觀察菌株之間空白區(qū)域面積，初步判斷生防菌株對靶標(biāo)菌株的拮抗作用，借鑒藥敏實驗采取的紙片擴(kuò)散法進(jìn)一步測定菌株的抑菌活性，這種方法相對其他篩選、鑒定方法快速、方便且準(zhǔn)確。

在植物生物防治中，分離的生防菌一般具有對病原菌有拮抗作用外，還對植物具有一定的促生作用[19]。馬桂珍等[20]從海洋中分離了細(xì)菌L1-9對小麥根腐葉枯病和小麥赤霉病有良好的防病效果，同時能顯著提高小麥種子的發(fā)芽率和小麥的株高，促進(jìn)小麥生長。田大偉等[21]研究的促生芽孢桿菌OKB105、FZB42在防治水稻白葉枯病同時使水稻株高增長15.86%，產(chǎn)量提升14%。分離的拮抗菌株B-2經(jīng)鑒定為短小芽孢桿菌，對水稻紋枯病菌的抑制效果明顯，對水稻生長的促生作用還待驗證，拮抗菌生長產(chǎn)生激素類物質(zhì)是促進(jìn)作物生長的原因之一，可預(yù)期估計B-2對水稻生長具有一定的促進(jìn)作用。

試驗中分離的短小芽孢桿菌B-2對水稻紋枯病菌抑制活性高達(dá)85.33%，可作為生物防治的有效措施之一，也可作為生物農(nóng)藥開發(fā)的重要菌株。開展B-2的分子生物學(xué)研究，找到相關(guān)功能基因，分析功能基因的作用機制，研究相關(guān)的代謝通路表達(dá)等，可以為進(jìn)一步改造出發(fā)菌株，使其在大田生防中表現(xiàn)出更良好的防效。通過目前的試驗，已經(jīng)表明B-2有很好的生防應(yīng)用前景，實驗室將進(jìn)一步開展田間生防試驗和菌株基因功能挖掘。

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