核桃青皮不同溶劑提取物對(duì)煙青蟲(chóng)的防治效果研究

何念武++劉曉陽(yáng)++李堆淑++任道遠(yuǎn)++黃金輝

摘要 采用水、乙醇、氯仿、乙酸乙酯及乙醚5種不同極性的溶劑，利用超聲波輔助提取法從核桃青皮中提取有效成分，繼而研究其對(duì)煙青蟲(chóng)的毒殺和拒食活性。結(jié)果表明：5種提取物均對(duì)煙青蟲(chóng)具有毒殺作用，且呈現(xiàn)良好的劑量效應(yīng)關(guān)系，不同提取物、不同濃度都會(huì)影響煙青蟲(chóng)的毒殺活性和拒食活性。5種提取物對(duì)煙青蟲(chóng)的殺蟲(chóng)活性順序依次為乙酸乙酯提取物>氯仿提取物>乙醚提取物>乙醇提取物>水提取物。由此可見(jiàn)，核桃青皮不同溶劑提取物對(duì)煙青蟲(chóng)具有一定的毒殺作用，具有開(kāi)發(fā)成生物農(nóng)藥的潛力。

關(guān)鍵詞 核桃青皮；提取物；煙青蟲(chóng)；毒殺活性；拒食活性

中圖分類(lèi)號(hào) S433；S481+.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2016）22-0109-02

Abstract Using water，ethanol，chloroform，ethyl acetate and ethyl ether five different polar solvents，effective components from walnut peel were extracted by ultrasonic extraction，and then the tobacco budworm poison and antifeedant activity were studied.The results showed that five kinds of extracts had toxic effect on tobacco budworm，and showed a good dose-response relationship，different extracts of different concentrations would affect the tobacco budworm toxicity and antifeedant activity.The order of insecticidal activity of five kinds of extracts to the tobacco budworm was ethyl acetate extract > chloroform extract > ethyl ether extract > ethanol extract.Thus，different solvent extracts from walnut green husk has certain toxic effect on tobacco budworm，has potentiality in biological pesticide development.

Key words walnut green husk；extract；tobacco budworm；cytotoxicity；antifeedant activity

核桃青皮，又名青龍衣（Juglans regia L.），是核桃最外層的一層厚厚的綠色果皮，其具有苦、澀、辛、平等特點(diǎn)，隨著核桃逐漸成熟青果皮會(huì)變成黑色直至自然脫落。有研究表明，核桃樹(shù)葉、枝及青核桃皮和核桃樹(shù)皮都有較高的藥用價(jià)值，具有殺菌、解毒、利尿等諸多功效[1-3]。同時(shí)，核桃青皮和葉的浸出液可防治農(nóng)作物病蟲(chóng)害，是植物源新型農(nóng)藥開(kāi)發(fā)的主要原料[1-3]。我國(guó)作為一個(gè)核桃生產(chǎn)大國(guó)，而且核桃的產(chǎn)量還在逐年增加，這樣每年都有大量的核桃青皮被倒入山野、河流或者田地，不僅浪費(fèi)了資源，也帶來(lái)了很大的環(huán)境問(wèn)題[4]?；诖?，本研究擬采用不同的有機(jī)溶劑從核桃青皮中提取主要的化學(xué)成分，進(jìn)一步開(kāi)展其對(duì)煙青蟲(chóng)的毒殺和拒食活性研究，旨在開(kāi)拓其更高的藥用價(jià)值，以期為開(kāi)發(fā)以核桃青皮為原料的新型植物源農(nóng)藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 材料及試劑。核桃青皮為2015年8—9月采自陜西省商洛市洛南縣古城鎮(zhèn)中山村（地理位置為北緯34°01′29″；東經(jīng)110°33′03″，海拔高度809～1 215 m）。自然晾干后，在60 ℃的烘箱中烘干，粉碎后過(guò)10目篩（孔徑2 000 μm）得到干粉，密封于塑料袋中，放在陰涼干燥處備用。吡蟲(chóng)啉（100 g/袋，江蘇克勝集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)），其他試劑均為分析純。

1.1.2 供試?yán)ハx(chóng)。煙青蟲(chóng)、健康煙苗（于2015年6月源于洛南縣永豐煙葉試驗(yàn)基地），選擇體形健壯、大小一致的煙青蟲(chóng)作為供試蟲(chóng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 核桃青皮不同溶劑提取物制備。準(zhǔn)確稱(chēng)取核桃青皮粉末80 g，放入1 000 mL錐形瓶中，分別選用5種極性不同的溶劑（水、乙醇、氯仿、乙酸乙酯、乙醚）于室溫下浸泡數(shù)小時(shí)，而后采用超聲波輔助回流提取，每次30 min，連續(xù)浸提3次，過(guò)濾，合并3次濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至膏狀，備用。

1.2.2 生物活性測(cè)定。一是煙青蟲(chóng)的毒殺活性測(cè)定。采用噴霧法[5-7]，取30個(gè)清洗干凈的的培養(yǎng)皿（？準(zhǔn) 9 cm），每個(gè)培養(yǎng)皿底部鋪上中性濾紙，將個(gè)體大小一致、體色相近的煙青蟲(chóng)放到新鮮的煙草的葉片上，放入培養(yǎng)皿中，將不同濃度的核桃青皮提取液（1.0、5.0、10.0、15.0、20.0 mg/mL）均勻地噴灑在煙葉的表面，以每片20頭進(jìn)行分段處理。蓋好培養(yǎng)皿蓋，以防煙青蟲(chóng)逃逸，貼好標(biāo)簽，用農(nóng)藥吡蟲(chóng)啉（10 mg/mL）處理作陽(yáng)性對(duì)照，以相應(yīng)溶劑為正常對(duì)照組。置于適宜的溫度下培養(yǎng)48 h后，觀(guān)察死亡情況，分別檢查死亡的煙青蟲(chóng)數(shù)目，存活的煙青蟲(chóng)數(shù)目，計(jì)算死亡率及校正死亡率。

二是不同提取物對(duì)煙青蟲(chóng)的拒食活性測(cè)定方法。將提取物稀釋成濃度為1.0、5.0、10.0、15.0、20.0 mg/mL的溶液，并用農(nóng)藥吡蟲(chóng)啉（10 mg/mL）作為陽(yáng)性對(duì)照，相應(yīng)溶劑作空白（正常）對(duì)照。將煙葉剪成2.5 cm×2.5 cm的小葉片分別在處理溶液和對(duì)照溶液（包括空白對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照）中分別浸蘸5 s，取出，然后在其葉背上放5頭煙青蟲(chóng)，將煙葉放入培養(yǎng)皿中，葉背朝下，并用濕棉球縛葉柄保濕培育。48 h后檢查各處理葉片上煙青蟲(chóng)的棲息數(shù)，每種處理重復(fù)6次，計(jì)算拒食率[7]。

拒食率（%）=（對(duì)照葉片蟲(chóng)數(shù)-處理葉片蟲(chóng)數(shù)）/對(duì)照葉片蟲(chóng)數(shù)×100

1.3 數(shù)據(jù)分析方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 19.0數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溶劑提取物對(duì)煙青蟲(chóng)的毒殺作用

核桃青皮5種不同溶劑核桃青皮提取物對(duì)煙青蟲(chóng)的毒殺作用如表1所示，可以看出，不同溶劑提取物在不同濃度處理下都會(huì)影響煙青蟲(chóng)存活情況。在相同溶劑、不同濃度下對(duì)煙青蟲(chóng)的觸殺活性總體上隨著提取物濃度的增加，煙青蟲(chóng)的死亡率在升高。其中，乙酸乙酯對(duì)煙青蟲(chóng)的觸殺效果最好。當(dāng)濃度為20 mg/mL，樣品處理48 h后煙青蟲(chóng)的死亡率和校正死亡率分別為60.15%和59.51%。在相同質(zhì)量濃度下不同溶劑提取物的殺蟲(chóng)活性大小不一，其殺蟲(chóng)活性依次為乙酸乙酯提取物>氯仿提取物>乙醚提取物>乙醇提取物>水提取物。由此可見(jiàn)，核桃青皮的殺蟲(chóng)成分主要集中在脂溶性的有機(jī)溶劑當(dāng)中，其主要?dú)⑾x(chóng)活性物質(zhì)尚待后續(xù)進(jìn)一步研究。在10 mg/mL的條件下，和同濃度的陽(yáng)性對(duì)照相比，各樣品的作用要弱一些，這可能是樣品的純度不夠所致，需要進(jìn)一步的純化和更深入研究。

2.2 核桃青皮不同溶劑提取物對(duì)煙青蟲(chóng)的拒食作用

從表2可以看出，5種不同溶劑提取物對(duì)煙青蟲(chóng)均具有一定的拒食活性，拒食活性依次為乙酸乙酯提取物>氯仿提取物>乙醚提取物>乙醇提取物>水提取物。在相同溶劑下煙青蟲(chóng)的拒食活性總體上是隨著提取物濃度的增加而升高，且拒食率明顯高于正常對(duì)照組（提取溶劑），略低于陽(yáng)性對(duì)照組農(nóng)藥吡蟲(chóng)啉。

當(dāng)質(zhì)量濃度為20 mg/mL時(shí)，核桃青皮乙酸乙酯提取物對(duì)煙青蟲(chóng)的拒食活性最高，處理48 h后拒食率為63.77%，陽(yáng)性對(duì)照組農(nóng)藥吡蟲(chóng)啉的拒食率為67.53%，非常接近陽(yáng)性對(duì)照（圖1）。

3 結(jié)論與討論

商洛核桃青皮提取物對(duì)煙青蟲(chóng)具有一定的防治作用，其拒食率和死亡率均呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系，5種不同溶劑提取物對(duì)煙青蟲(chóng)的觸殺和拒食活性不盡相同。在相同濃度條件下，其殺蟲(chóng)活性和拒食活性依次為乙酸乙酯提取物>水提取物>乙醚提取物>乙醇提取物>氯仿提取物；在相同溶劑條件下，提取物對(duì)煙青蟲(chóng)的毒殺活性和拒食活性總體上隨提取物濃度的增加而升高，并且呈現(xiàn)良好的劑量效應(yīng)關(guān)系。當(dāng)濃度為20 mg/mL，煙青蟲(chóng)處理48 h后的死亡率和校正死亡率分別為60.15%和59.51%，且觸殺率和拒食率均高于正常對(duì)照組（提取溶劑），與此同時(shí)，煙青蟲(chóng)的觸殺率均高于陽(yáng)性對(duì)照組農(nóng)藥吡蟲(chóng)啉，拒食率略低于陽(yáng)性藥物吡蟲(chóng)啉[5-6]。

本試驗(yàn)選取5種極性不同的溶劑（水、乙醇、乙酸、氯仿、乙酸乙酯），采用超聲波方法提取核桃青皮的有效成分，從而得出核桃青皮5種不同溶劑提取物對(duì)煙青蟲(chóng)的毒殺活性和拒食活性。試驗(yàn)結(jié)果表明，核桃青皮乙酸乙酯提取物對(duì)煙青蟲(chóng)的毒殺活性和拒食活性最強(qiáng)，為進(jìn)一步研究核桃青皮中的殺蟲(chóng)活性物質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。試驗(yàn)過(guò)程設(shè)計(jì)溶劑對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組來(lái)比較觸殺率和拒食率，充分說(shuō)明了煙青蟲(chóng)5種不同溶劑提取物對(duì)煙青蟲(chóng)的毒殺作用，但本試驗(yàn)只觀(guān)察了處理48 h后的活性，沒(méi)有把時(shí)間因素考慮進(jìn)去，可能會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生相應(yīng)的誤差，這是對(duì)活性測(cè)定的一個(gè)重要因素。而且由于植物次生物質(zhì)種類(lèi)多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，所得的乙酸乙酯提取物仍是一類(lèi)混合物，還必須進(jìn)一步分離純化得到殺蟲(chóng)活性單體物質(zhì)[8-10]。研究發(fā)現(xiàn)，核桃青皮不同溶劑提取物均對(duì)煙青蟲(chóng)具有明顯的毒殺作用，將其作為植物源殺蟲(chóng)劑與殺菌劑來(lái)開(kāi)發(fā)利用，變廢為寶，意義重大[11]，并可為以后的研究提供更廣闊的空間。但關(guān)于其在防治農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)方面的研究卻剛剛起步，若能從核桃青皮中提取出具有藥用價(jià)值的活性成分，不僅能緩解大量核桃青皮堆積帶來(lái)的環(huán)境問(wèn)題，還能增加果農(nóng)收入，農(nóng)業(yè)的發(fā)展前景將更加廣闊。

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