雜交構(gòu)樹(shù)開(kāi)放式組培快繁技術(shù)研究

徐凱南++楊笑如

摘 要：本實(shí)驗(yàn)通過(guò)添加不同溶度的次氯酸鈉溶液，與不加次氯酸鈉溶液作為空白對(duì)照，研究得出在保證不影響雜交構(gòu)樹(shù)正常分化生長(zhǎng)的前提下，雜交構(gòu)樹(shù)誘導(dǎo)和擴(kuò)繁培養(yǎng)基的最佳添加濃度均為10mg/L。在很大程度上解決了雜交構(gòu)樹(shù)在開(kāi)放式組培中的難題，為雜交構(gòu)樹(shù)下在開(kāi)放情況下創(chuàng)造了條件，簡(jiǎn)化了操作環(huán)節(jié)，有利工廠化生產(chǎn)。

關(guān)鍵詞：雜交構(gòu)樹(shù)；組織培養(yǎng)；快繁技術(shù)；開(kāi)放式組織

雜交構(gòu)樹(shù)是近年中科院極力推廣的一種優(yōu)良速生樹(shù)種，是科學(xué)家通過(guò)傳統(tǒng)的雜交育種結(jié)合現(xiàn)代生物技術(shù)手段培育而得。具有抗逆性性強(qiáng)，耐干旱、貧瘠、鹽堿等優(yōu)良特性，它的全身都是寶，葉、皮、果等都可以利用，有“未來(lái)軟黃金”的美稱。目前雜交構(gòu)樹(shù)的種植主要通過(guò)插扦，但是插扦的成活率極低，選擇在較好的時(shí)間段，成活率高的雜交構(gòu)樹(shù)嫩芽，配合生根粉進(jìn)行插扦，成活率也只有24%[1]。而通過(guò)無(wú)菌操作組織培養(yǎng)不僅可以大大提高育苗的速度，使育苗不受季節(jié)限制，同時(shí)組培苗的生根率也高達(dá)100%。但污染和繁瑣的組培程序是阻礙組織培養(yǎng)走向工廠化的關(guān)鍵問(wèn)題。開(kāi)放式組培的研究具有重大的意義，它可以在不影響組培效果的前提下拋開(kāi)無(wú)菌操作，簡(jiǎn)化環(huán)節(jié)，降低成本，為植物組織培養(yǎng)及工廠化育苗提供新的可能。次氯酸鈉做為一種廣譜性抑菌劑，在組織培養(yǎng)細(xì)菌、真菌的污染與預(yù)防和香蕉開(kāi)放式組培中都取得了不錯(cuò)的效果[2]。本試驗(yàn)采用抑菌劑次氯酸鈉，研究在不同濃度次氯酸鈉處理下對(duì)雜交構(gòu)樹(shù)開(kāi)放式組培生長(zhǎng)的影響，以期簡(jiǎn)化雜交構(gòu)樹(shù)的組培程序，降低成本，為生產(chǎn)提供更好的服務(wù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用雜交構(gòu)樹(shù)引種自中科構(gòu)想（北京）林業(yè)科技有限公司 “中科1號(hào)”品系。采用的次氯酸鈉純度為分析純，由西隴化工股份有限公司生產(chǎn)，次氯酸鈉含量（以有效氯計(jì)）≥8.0%，游離堿含量（以氫氧化鈉計(jì)）≤5.0%，試驗(yàn)用的次氯酸鈉溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。其他藥品還有6-BA、NAA、KT、蔗糖等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

污染率（%）=污染瓶數(shù)/總接種瓶數(shù)X100%

褐化率（%）=褐化瓶數(shù)/總接種瓶數(shù)X100%

存活率（%）=存活瓶數(shù)/總接種瓶數(shù)X100%

1.2.2 組培塑料杯滅菌處理

鑒于是開(kāi)放式組培不需要經(jīng)過(guò)高壓滅菌，本次實(shí)驗(yàn)選取比較方便、易于運(yùn)輸且透光性較好的塑料杯作為接種容器，封口采用奶茶封蓋機(jī)封口。塑料杯和封口膜使用前統(tǒng)一由外面的工廠用同位素鈷60照射消毒，備用。

1.2.3 次氯酸鈉最佳實(shí)驗(yàn)濃度的實(shí)驗(yàn)

誘導(dǎo)分化和增殖擴(kuò)繁培養(yǎng)基的次氯酸鈉濃度均設(shè)置為0mg/L（為CK1，未經(jīng)過(guò)高壓滅菌）、0mg/L（為CK2，經(jīng)過(guò)121度，20min高壓滅菌處理）、5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L、25mg/L、30mg/L。接種方法采用開(kāi)放式，對(duì)照組2在超凈工作臺(tái)接種。誘導(dǎo)分化每杯培養(yǎng)基接種2個(gè) 芽，每組10杯，處理3組。擴(kuò)繁培養(yǎng)基每杯接種6個(gè)，每組20杯，處理3組。接種完之后30天觀察污染、褐化、存活情況，統(tǒng)計(jì)最后污染率、褐化率、存活率。

1.2.4 培養(yǎng)基的配制

配制培養(yǎng)基的房間需經(jīng)過(guò)紫外燈30min照射消毒，誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基采用MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 1.0mg/L+抑菌劑。增殖擴(kuò)繁培養(yǎng)基采用MS+6BA 2.0mg/L+KT1.0mg/L +GA21.0mg/L+抑菌劑。培養(yǎng)基加熱溶解將PH值調(diào)到6.0后進(jìn)行分裝，并迅速蓋好杯蓋，置于已經(jīng)消毒干凈的接種室中冷卻凝固待用。

1.2.5 接種環(huán)境的營(yíng)造

接種前一天晚上，打開(kāi)紫外燈進(jìn)行消毒，接種前關(guān)閉紫外燈，并進(jìn)行75%酒精降塵處理。

1.2.6 培養(yǎng)環(huán)境的營(yíng)造

培養(yǎng)室定時(shí)日光燈照射12h/d，設(shè)置溫度25±1℃，濕度保持在60%-80%，光照強(qiáng)度2000-3000LX。

1.2.7 開(kāi)放式接種方法

不借助超凈工作臺(tái)，在已經(jīng)消毒處理過(guò)的接種室內(nèi)操作臺(tái)上，取氯化貢消毒后的構(gòu)樹(shù)嫩芽于75%酒精擦拭后的接種盤上用剪刀剪去褐化損傷部分，每個(gè)接種芽留一個(gè)生長(zhǎng)點(diǎn)，長(zhǎng)度取2-3cm為宜。接種完一瓶后用酒精燈灼燒瓶口后迅速蓋上蓋子，完成接種。接種用的剪刀、鑷子和解剖刀每次使用后用75%酒精擦拭后置于300度消毒器中30秒后取出降溫待用。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘導(dǎo)分化雜交構(gòu)樹(shù)分化的最佳濃度

由圖1可得，從污染率來(lái)看隨著次氯酸鈉濃度的增加污染率不斷下降，在使用大于30mg/L次氯酸鈉的時(shí)候，污染率低于6.67%，相比較于其他處理組污染率低。從褐化率來(lái)看，隨著抑菌劑次氯酸鈉濃度的提高，褐化率呈不斷上升的趨勢(shì)，使用大于30mg/L次氯酸鈉的時(shí)候，所有的構(gòu)樹(shù)嫩芽都死亡，一方面是因?yàn)殡s交構(gòu)樹(shù)屬于木本，本身會(huì)分泌多酚導(dǎo)致褐化，另一方面是受到太高濃度次氯酸鈉濃度的毒害。使用5mg/L和10mg/L次氯酸鈉濃度褐化率分別是36.67%和40.00%，褐化率與CK2相近。從存活率來(lái)看，隨著抑菌劑次氯酸鈉濃度的提高，存活率呈不斷下降的趨勢(shì)，高濃度的抑菌劑濃度（20mg/L-30mg/LNaClO），使得雜交構(gòu)樹(shù)的嫩芽的存活率低于6.67%。從總體來(lái)看，30mg/L次氯酸鈉濃度時(shí)，污染率雖然很低，僅6.67%，但確呈現(xiàn)出高褐化率和低存活率。5mg/L和10mg/L的次氯酸鈉濃度雖然褐化率相差不大，但10mg/L次氯酸鈉濃度污染率和存活率相較于5mg/L時(shí)，呈現(xiàn)出更有利的一面，更有利于雜交構(gòu)樹(shù)嫩芽的生長(zhǎng)。所以次氯酸鈉做為雜交構(gòu)樹(shù)嫩芽誘導(dǎo)分化的最佳濃度為10mg/L。

2.2 擴(kuò)繁雜交構(gòu)樹(shù)的最佳濃度

由圖2可得，從污染率來(lái)看，次氯酸鈉的濃度越高污染率越低。30mg/L次氯酸鈉濃度僅污染率僅5.00%比CK2處理組的還低。從褐化率來(lái)看，次氯酸鈉濃度的提高，褐化率呈上升趨勢(shì)，不利于雜交構(gòu)樹(shù)的生長(zhǎng)，30mg/L次氯酸鈉濃度下褐化率高達(dá)81.67%。從存活率來(lái)看，高濃度的次氯酸鈉也不利于構(gòu)樹(shù)的存活，30mg/L次氯酸鈉濃度下存活率僅為6.67%。從整體來(lái)看，10mg/L次氯酸鈉處理組要優(yōu)于其他處理組，存活率達(dá)71.67%。所以雜交構(gòu)樹(shù)的擴(kuò)繁培養(yǎng)基次氯酸鈉的最佳濃度為10mg/L。

3 討論

開(kāi)放式組培的成功試驗(yàn)?zāi)壳斑€比較少看到有報(bào)道，傳統(tǒng)培養(yǎng)基的富營(yíng)養(yǎng)化常常成為細(xì)菌的溫床，給開(kāi)放式組培帶來(lái)困難，從優(yōu)化培養(yǎng)基入手，在不影響正常生長(zhǎng)的情況下，減少有機(jī)物和蔗糖的用量，即可以節(jié)約成本又有利于開(kāi)放式組培的成功構(gòu)建。近年來(lái)研究比較多的是從植物中提取某種具有抗菌的活性物質(zhì)，在結(jié)合添加一點(diǎn)化學(xué)藥品，制成一種以植物原料為主的廣譜性抑菌劑[3]。由于研究一種有效的植物源廣譜性抑菌劑所需要的周期是比較長(zhǎng)的，所以作者選擇使用次氯酸鈉作為雜交構(gòu)樹(shù)開(kāi)放式組培抑菌劑來(lái)研究。次氯酸鈉是含氯消毒劑使用最廣的，具有殺菌譜廣、作用迅速低毒、價(jià)格低，對(duì)真菌和芽孢也顯著的殺滅效果。

和常規(guī)的使用超凈工作臺(tái)進(jìn)行接種工作相比，本試驗(yàn)通過(guò)添加10mg/L次氯酸鈉建立的開(kāi)放式組培可以有效的降低組培成本，首先脫離了超凈工作臺(tái)，就節(jié)省了超凈工作臺(tái)耗電費(fèi)用，根據(jù)研究超凈工作臺(tái)耗電就直接占耗電成本的46%[4]，另一方面無(wú)菌操作變得沒(méi)那么嚴(yán)格，也從另一方面提高了工人接種效率[7]。而且添加了次氯酸鈉之后培養(yǎng)基就不用經(jīng)過(guò)高壓鍋滅菌，不但節(jié)省了高壓鍋的滅菌費(fèi)用，還提高了配制培養(yǎng)基的效率，還減少了對(duì)培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的破壞，更有利于植物的生長(zhǎng)。誘導(dǎo)培養(yǎng)基加入10mg/L次氯酸鈉后，污染率、褐化率、存活率相比較于CK2差別都不是很大。擴(kuò)繁培養(yǎng)基加入10mg/L次氯酸鈉后污染率和褐化率雖然和CK2還存在一點(diǎn)差距，但存活率也達(dá)到71.67%，筆者要指出的是本次試驗(yàn)培養(yǎng)基所采用的是傳統(tǒng)培養(yǎng)基，沒(méi)有經(jīng)過(guò)優(yōu)化處理。如果培養(yǎng)基經(jīng)達(dá)優(yōu)化之后，構(gòu)樹(shù)的組培效果是有可能達(dá)到和高壓滅菌同樣的效果，甚至有可能優(yōu)于高壓滅菌的。

綜上所述：次氯酸鈉在雜交構(gòu)樹(shù)開(kāi)放式組培中的誘導(dǎo)和擴(kuò)繁添加的最佳抑菌濃度均為10mg/L，而關(guān)于此濃度下是否適合生根培養(yǎng)及培養(yǎng)基如何優(yōu)化有機(jī)物和碳源蔗糖的添加量的試驗(yàn)還有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

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[3]盧加舉，張正學(xué)，彭仕榮，等.復(fù)合型抑菌劑在甘蔗開(kāi)放式組培中的應(yīng)用研究[J].熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，32（10）：67-71.

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作者簡(jiǎn)介：徐凱南（1990-），籍貫：福建安溪，學(xué)歷：本科，職稱：生物助理工程師，主要研究方向：林業(yè)種苗組培。