AcMNPV p95基因一段339bp序列在病毒復(fù)制中的作用

朱明駿，尹 雋，鐘 江

(復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 微生物學(xué)與微生物工程系 上海 200438)

桿狀病毒(Baculovirus)是一類在自然界中僅感染節(jié)肢動(dòng)物的病毒，在分類上屬于桿狀病毒科，基因組為90～160kb的雙鏈環(huán)狀DNA[1]．已報(bào)道的桿狀病毒有500多種，其中苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographacalifornicanucleopolyhedrovirus，AcMNPV)是桿狀病毒的模式種，其基因組大小為133894bp，包含154個(gè)潛在的開放閱讀框(ORF)[2]．

AcMNPVp95基因由第83號(hào)開放閱讀框編碼，又稱為ac83．它編碼一個(gè)含847個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)[2-3]．研究表明該蛋白是病毒核衣殼的組成蛋白[4-5]，同時(shí)也是病毒經(jīng)口感染因子(Per os Infectivity Factor, PIF)復(fù)合體的組成部分，與病毒經(jīng)口感染昆蟲有關(guān)[6-7]．P95蛋白有一個(gè)幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，刪除該結(jié)構(gòu)域后，病毒無法經(jīng)幼蟲中腸感染，但可以經(jīng)血腔注射感染[7]．

本實(shí)驗(yàn)室早期的研究結(jié)果表明，雖然p95基因破壞后病毒無法在Sf9細(xì)胞中復(fù)制，但編碼P95蛋白N端序列的1kb基因序列對(duì)于病毒的復(fù)制是非必需的[8]．Zhu等[7]研究表明，在p95基因敲除的病毒基因組中回補(bǔ)451～600位氨基酸殘基對(duì)應(yīng)的450bp基因序列后，就能部分恢復(fù)病毒在Sf9細(xì)胞中復(fù)制和產(chǎn)生子代病毒的能力，但其效價(jià)仍僅100 TCID50/mL左右，大大低于正常情況．

本研究構(gòu)建了2株不能表達(dá)p95基因但帶有對(duì)應(yīng)P95蛋白565～677位氨基酸的一段339bp核心序列的重組病毒，證實(shí)重組病毒可以在Sf9細(xì)胞中完成復(fù)制，且重組病毒復(fù)制水平接近野生型病毒．這項(xiàng)研究進(jìn)一步明確了p95基因核心區(qū)域的位置，并為研究其作用機(jī)制提供了基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1.1 細(xì)菌、細(xì)胞和病毒

大腸桿菌EscherichiacoliTG1，DH10B等菌株，Spodopterafrugiperda細(xì)胞系Sf9由本實(shí)驗(yàn)室保存．Sf9細(xì)胞用TNM-FH培養(yǎng)基(Sigma-Aldrich, MO, USA)補(bǔ)充10%的小牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素在27℃培養(yǎng)．表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因egfp的重組病毒AcEGFP由本實(shí)驗(yàn)室保存，用來代表的能夠完全復(fù)制的野生型病毒．

1.2 質(zhì)粒的構(gòu)建

注： 加下劃線部分為AvrⅡ酶切位點(diǎn)．

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室研究結(jié)果，選取p95基因核心區(qū)域的DNA序列(339bp，AcMNPV基因組位置： 69576～69914bp，以下稱為Core339)，用339upper/339lower引物對(duì)(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物T載體克隆后，經(jīng)序列分析驗(yàn)證，獲得兩端帶有AvrⅡ識(shí)別位點(diǎn)的p95基因核心片段Core339．將在pFastbac1質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)插入egfp基因的質(zhì)粒pBG[9]用AvrⅡ酶切，并連接到用AvrⅡ酶切的Core339上，得到Core339片段以正、反兩種方向分別插入pFastbac1 SV40 polyA信號(hào)序列后的兩種重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastbacEGFP/Core339+和pFastbacEGFP/Core339-．質(zhì)粒經(jīng)PCR和酶切檢驗(yàn)正確．另將ie1啟動(dòng)子帶動(dòng)的egfp片段插入pFastbac1質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)的HindⅢ處，得到轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastbac-ie1EGFP．

1.3 重組Bacmid的構(gòu)建

首先利用λ-red系統(tǒng)[10]以阿普拉霉素抗性基因(apra)置換p95基因的大部分區(qū)域，敲除p95基因．p95基因位于基因組67884～70427bp處，本實(shí)驗(yàn)中敲除的區(qū)域?yàn)?8001～70427bp，僅保留了p95從起始密碼子起的117bp．根據(jù)生物信息學(xué)分析，該區(qū)域可能是位于p95基因上游(反向)的AcTLP基因的啟動(dòng)子[11]．通過PCR擴(kuò)增apra基因，使得到的擴(kuò)增產(chǎn)物在兩端分別帶有39bp和57bp與敲除區(qū)域兩側(cè)分別同源的序列．將表達(dá)λ-red重組酶的pKD46質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Bac-to-Bac菌株DH10Bac，得到DH10Bac/pKD46，再轉(zhuǎn)入上述帶有同源序列的apra基因PCR產(chǎn)物，篩選對(duì)阿普拉霉素(40μg/mL)和卡那霉素(50μg/mL)同時(shí)具有抗性的重組菌．用試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)提取Bacmid DNA，PCR檢驗(yàn)確認(rèn)p95基因已經(jīng)被敲除．將Bacmid DNA通過電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入E.coliDH10B，隨后轉(zhuǎn)入帶有Tn7轉(zhuǎn)座酶的輔助質(zhì)粒pMON7124，得到E.coliDH10Bac-bP95K/helper.

按照Bac-to-Bac技術(shù)手冊(cè)(Invitrogen)，用以上構(gòu)建的3種轉(zhuǎn)移質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH10Bac-bP95K/helper，篩選得到相應(yīng)的重組Bacmid bP95K/Core339/EGFP+，bP95K/Core339/EGFP-和bP95K/EGFP．通過PCR擴(kuò)增對(duì)這些Bacmid進(jìn)行驗(yàn)證．

1.4 重組Bacmid轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞

Sf9細(xì)胞接入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，2×105/孔．培養(yǎng)過夜后，用重組Bacmid DNA轉(zhuǎn)染．細(xì)胞轉(zhuǎn)染利用Cellfectin Ⅱ(Invitrogen)按產(chǎn)品說明書進(jìn)行．在轉(zhuǎn)染后一定時(shí)間用熒光顯微鏡(Olympus CKX41)觀察感染情況．轉(zhuǎn)染后一定時(shí)間懸浮細(xì)胞，離心后收獲上清，用終點(diǎn)稀釋法測(cè)定重組病毒效價(jià)．

1.5 重組病毒感染Sf9細(xì)胞

Sf9細(xì)胞接入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，2×105/孔．培養(yǎng)過夜后，用一定量重組病毒感染，使MOI約為5pfu/cell．感染后一定時(shí)間懸浮細(xì)胞，離心后收獲上清，用終點(diǎn)稀釋法測(cè)定重組病毒效價(jià)．

1.6 感染細(xì)胞中病毒DNA拷貝數(shù)的測(cè)定

Sf9細(xì)胞用重組病毒感染(MOI=5 pfu/cell)，感染后不同時(shí)間收集細(xì)胞，用PBS離心清洗(3000r/min，5min)后，細(xì)胞沉淀加入20μL水，80μL 0.4% SDS(TE配置)，5μL 20mg/mL的蛋白酶K(Roche)，1μL RNase(1000×).50℃消化5～8h．酚/氯仿/異戊醇抽提2～3次后，用無水乙醇沉淀總DNA．DNA拷貝數(shù)測(cè)定使用SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ(Tli RNaseH Plus)定量PCR預(yù)混液(TaKaRa)進(jìn)行，引物為gp64upper/gp64lower(表1)．Real-time PCR使用Stratagene Mx 3000p進(jìn)行，Ct值用以2-ΔΔt法進(jìn)行相對(duì)定量，以同一樣本2h時(shí)為1．

1.7 SDS-PAGE電泳和Western blot檢測(cè)P95蛋白表達(dá)

轉(zhuǎn)染后72h收獲細(xì)胞，3000r/min離心5min．細(xì)胞沉淀用PBS離心清洗后，加入50μL樣品緩沖液，100℃煮沸5min．樣品進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳和電轉(zhuǎn)移．用Western blot檢測(cè)P95蛋白的表達(dá)，一抗用鼠源P95多克隆抗體(實(shí)驗(yàn)室自制)，二抗為AP偶聯(lián)抗鼠IgG抗體(Sigma-Aldrich)，用BCIP/NBT顯色．

2 結(jié)果

2.1 重組Bacmid的構(gòu)建

根據(jù)前期研究結(jié)果[7-8]和實(shí)驗(yàn)室初步數(shù)據(jù)(尹雋等，未發(fā)表)，將p95基因中一段339bp的序列(Core339，位于AcMNPV基因組69576～69914，對(duì)應(yīng)P95蛋白565～677位氨基酸)以正反兩個(gè)不同的方向插入轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastbacEGFP報(bào)告基因egfp編碼區(qū)及多聚腺苷信號(hào)(SV40 PA)下游，得到轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFastbacEGFP/Core339+和pFastbac/Core339-．這兩個(gè)質(zhì)粒中egfp基因位于多角體啟動(dòng)子下方，所插入的Core339上下游沒有明顯的啟動(dòng)子．另外將ie1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)egfp基因的片段插入pFastbac1多克隆位點(diǎn)，得到pFastbac-ie1EGFP．

通過λ-red方法用阿普拉霉素抗性基因(apra)置換病毒基因組Bacmid中p95基因的絕大部分序列，得到p95基因缺失且多角體位點(diǎn)空白，可以轉(zhuǎn)入其他基因的Bacmid bP95K．將上述轉(zhuǎn)移質(zhì)粒轉(zhuǎn)入帶有bP95K和Tn7轉(zhuǎn)座酶表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌，通過Bac-to-Bac獲得重組Bacmid bP95K/EGFP/339+，bP95K/EGFP/339-，和bP95K/EGFP．它們?cè)趐95基因位點(diǎn)和多角體基因位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)如圖1(a)所示．

圖1 重組Bacmid p95基因位點(diǎn)和多角體基因位點(diǎn)結(jié)構(gòu)示意圖(a)及構(gòu)建結(jié)果的PCR擴(kuò)增驗(yàn)證(b)Fig.1 The diagram of recombinant Bacmid in p95 and polyhedrin locus (a) and the verification of construction results by PCR method(b)

通過PCR擴(kuò)增驗(yàn)證重組Bacmid的正確性，結(jié)果如圖1(b)所示．用p95基因上下游引物(p95upper/p95lower，表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，作為對(duì)照的p95野生型Bacmid bAcEGFP的擴(kuò)增得到2.5kb片段，而p95基因缺失的3個(gè)重組Bacmid中都只能擴(kuò)增得到1.5kb的片段．用Core339上下游引物(339upper/339lower，表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，除了bP95K/EGFP未得到擴(kuò)增產(chǎn)物外，其余3種Bacmid均得到339bp的片段．用BacmidF引物與339upper進(jìn)行PCR擴(kuò)增，僅bP95K/EGFP/339-有3.1kb的擴(kuò)增產(chǎn)物，而用BacmidF引物與339lower進(jìn)行PCR擴(kuò)增，僅bP95K/EGFP/339+有3.1kb的擴(kuò)增產(chǎn)物．以上結(jié)果均與預(yù)期一致，表明3種Bacmid構(gòu)建正確．

2.2 帶有Core339的重組病毒的獲得

用Bacmid bP95K/EGFP、bP95K/EGFP/339+、bP95K/EGFP/339-轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，120h后在熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果如圖2所示．其中bP95K/EGFP/339+、bP95K/EGFP/339-轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中已有明顯的感染擴(kuò)散現(xiàn)象，表明病毒復(fù)制已經(jīng)啟動(dòng)，而bP95K/EGFP僅個(gè)別細(xì)胞可以觀察到熒光．取轉(zhuǎn)染上清測(cè)定病毒效價(jià)，bP95K/EGFP效價(jià)低于100 TCID50/mL，雖經(jīng)病毒傳代培養(yǎng)，未能得到有感染力的病毒，與以前的報(bào)道一致[7]．bP95K/EGFP/339+、bP95K/EGFP/339-轉(zhuǎn)染上清液中的病毒效價(jià)均達(dá)到1.0×104TCID50/mL左右，傳代培養(yǎng)后效價(jià)進(jìn)一步提高，由此得到了重組病毒vP95K/EGFP/339+和vP95K/EGFP/339-．為確保重組病毒確實(shí)為僅帶有Core339的p95基因缺陷型，從感染細(xì)胞上清中提取了病毒DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，得到肯定的結(jié)果(未顯示)．

圖2 帶有p95基因Core339片段的重組桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞120h后的熒光顯微鏡圖Fig.2 The fluorescence microscopy pictures of Sf9 cells infected with recombinant baculovirus containing Core339 fragment of p95 gene(120hpi)

圖3 重組病毒感染的Sf9細(xì)胞中P95蛋白的Western blot 檢測(cè)Fig.3 Western blot analysis of P95 expression in Sf9 cells infected with recombinant virus

進(jìn)一步檢測(cè)的重組病毒感染細(xì)胞中P95蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果如圖3所示．可見僅有p95野生型的對(duì)照有完整的P95蛋白表達(dá)，vP95K/EGFP/339+和vP95K/EGFP/339-感染的細(xì)胞中均未檢測(cè)到條帶，這也證明得到重組病毒的p95基因已經(jīng)被敲除而無法表達(dá)．

2.3 帶有Core339片段的重組桿狀病毒的復(fù)制動(dòng)態(tài)

用vP95K/EGFP/339+和vP95K/EGFP/339-感染Sf9細(xì)胞(MOI=5 pfu/cell)，在感染后不同時(shí)間測(cè)定培養(yǎng)中病毒的效價(jià)，以p95基因?yàn)橐吧偷腁cEGFP病毒作為對(duì)照，結(jié)果如圖4所示．由圖可見，帶有Core339片段的重組病毒產(chǎn)生出芽型病毒的時(shí)間明顯晚于AcEGFP，但120h后效價(jià)趨于接近．其中，vP95K/EGFP/339-在96h已經(jīng)達(dá)到與AcEGFP一致的水平，而vP95K/EGFP/339+復(fù)制較慢一些，但120h時(shí)效價(jià)仍達(dá)1.0×107TCID50/mL左右．進(jìn)一步測(cè)定重組病毒基因組DNA的復(fù)制情況，如圖5所示．可以發(fā)現(xiàn)，感染后12h和18h，重組病毒基因組拷貝數(shù)明顯低于AcEGFP，但到24h時(shí)，3種病毒病毒基因組拷貝數(shù)接近．

3 討 論

P95蛋白及其同源蛋白是多種桿狀病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，也與病毒感染昆蟲活體有關(guān)[12-13]．但同時(shí)，有研究表明完整的P95蛋白對(duì)于AcMNPV在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中復(fù)制是非必需的．本實(shí)驗(yàn)室2008年曾報(bào)道剔除P95 N端的300多個(gè)氨基酸對(duì)病毒在Sf9細(xì)胞中的復(fù)制無明顯影響[8]．Zhu等[7]的結(jié)果也表明，編碼P95蛋白451～600位氨基酸的DNA片段(450bp)可以部分彌補(bǔ)p95基因缺失的影響，使病毒部分獲得產(chǎn)生子代病毒的能力[7]，但其效價(jià)僅為100 TCID50/mL左右．

圖4 重組病毒感染Sf9細(xì)胞后培養(yǎng)液中病毒效價(jià)Fig.4 Virus titers in the culture of Sf9 cells infected with recombinant virus

圖5 Sf9細(xì)胞中病毒DNA復(fù)制動(dòng)態(tài)Fig.5 Replication dynamics of viral DNA in Sf9 cells infected with recombinant virus

本研究在實(shí)驗(yàn)室前期工作的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步把對(duì)病毒復(fù)制起關(guān)鍵作用的片段定位到一段339bp的片段上．用該片段構(gòu)建的重組病毒vP95K/EGFP/339+和vP95K/EGFP/339-都能得到高效價(jià)的重組病毒，效價(jià)水平與p95基因正常的病毒AcEGFP基本相當(dāng)．Western blot實(shí)驗(yàn)未能在這兩株病毒感染的細(xì)胞中檢測(cè)到P95蛋白，結(jié)合PCR檢測(cè)，證實(shí)這兩株病毒中的p95基因編碼區(qū)的大部分確已被置換而無法表達(dá)．同時(shí)，病毒復(fù)制動(dòng)態(tài)分析表明，這兩株病毒無論在病毒DNA復(fù)制還是在出芽型病毒產(chǎn)生方面均稍慢于AcEGFP，vP95K/EGFP/339+在產(chǎn)生出芽型病毒方面又慢于vP95K/EGFP/339-，但DNA拷貝數(shù)在感染后24h，病毒效價(jià)在感染后120h時(shí)均與AcEGFP趨于一致．這些結(jié)果表明完整的P95蛋白對(duì)于病毒的復(fù)制不是必需的，其核心區(qū)域Core339對(duì)病毒的復(fù)制有關(guān)鍵的作用．同時(shí)也提示P95蛋白在病毒復(fù)制中仍發(fā)揮一定的作用．

Core339片段對(duì)應(yīng)P95蛋白的565～677位氨基酸，與Zhu等[7]報(bào)道的451～600位氨基酸的結(jié)果有所重疊，但不盡一致．這應(yīng)該是兩個(gè)研究中病毒效價(jià)差異的關(guān)鍵．我們前期的系列共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步縮短這個(gè)段序列會(huì)顯著降低病毒復(fù)制的水平，但相關(guān)結(jié)果還需要通過以構(gòu)建重組病毒進(jìn)一步驗(yàn)證．Zhu等報(bào)道了帶有451～600區(qū)域的重組病毒(vAc83: del2-450/601-847)感染細(xì)胞后可檢測(cè)到與正常水平相當(dāng)?shù)慕囟绦蚉95蛋白的表達(dá)，但本研究中，我們并未檢測(cè)到相應(yīng)的條帶．這可能與Core339片段更小，其潛在表達(dá)的蛋白的分子質(zhì)量較小、不易檢測(cè)有關(guān)．

在前期實(shí)驗(yàn)中，我們?cè)鴩L試將Core339的PCR片段、質(zhì)粒、體外轉(zhuǎn)錄RNA(正向和反向)等與p95缺陷的bP95K/EGFP共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，均觀察到病毒不同程度的復(fù)制(結(jié)果未顯示)．本研究驗(yàn)證了這些結(jié)果的可靠性．值得注意的是，在本研究所構(gòu)建的兩株重組病毒中，Core339插入位置兩側(cè)，一側(cè)是SV40 polyA信號(hào)序列，另一側(cè)是Tn7轉(zhuǎn)座子序列，沒有明顯的啟動(dòng)子序列，而Core339片段以正向或反向插入都可以獲得病毒．因此，Core339片段是如何發(fā)揮作用的，值得探究．我們?cè)鴩L試檢測(cè)該片段可能的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，并沒有得到明確的結(jié)果．此外，我們?cè)谘芯坎《靖腥镜募?xì)胞中microRNA動(dòng)態(tài)時(shí)發(fā)現(xiàn)microRNAbantam是Sf9細(xì)胞中豐度最高的microRNA之一，對(duì)于病毒的感染和基因表達(dá)有一定作用[14]．序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)Core339與bantam序列有明顯的同源性，似乎提示Core339可能參與干擾宿主microRNA的活性．但我們初步的研究未能得到明確支持這一假說的結(jié)果．

綜上，本研究的結(jié)果提示p95基因中的一段339bp的核心序列對(duì)病毒的復(fù)制具有關(guān)鍵作用，但它是如何發(fā)揮作用的還有待深入研究．

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