河北省不同地區(qū)杠柳遺傳多樣性的ISSR分析

狄魁穎++黃大莊++賈艷晶++張顯國(guó)++王偉++霍騰達(dá)

摘要：通過ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)采自河北石家莊、保定、邢臺(tái)、邯鄲、張家口的11個(gè)杠柳（Periploca sepium Bunge）樣品進(jìn)行遺傳多樣性分析。結(jié)果表明，從100條通用引物中共篩選出34條適用于杠柳ISSR研究的多態(tài)性引物；對(duì)11個(gè)供試樣品進(jìn)行PCR檢測(cè)，進(jìn)一步篩選出8條多態(tài)性好、穩(wěn)定性高的引物，共檢測(cè)出79個(gè)ISSR位點(diǎn)，多態(tài)性位點(diǎn)63個(gè)，占79.7%；遺傳相似系數(shù)（GS）變化范圍在0.454 5～0.854 5，8對(duì)多態(tài)性引物多態(tài)信息含量值變化范圍為0.747～0.884，平均為0.827；11份供試樣品聚類分為三大類，聚類相對(duì)復(fù)雜，呈一定的地域相關(guān)性；ISSR分子標(biāo)記適用于杠柳遺傳多樣性研究，且杠柳遺傳多樣性豐富。

關(guān)鍵詞：杠柳（Periploca sepium Bunge）；ISSR；分子標(biāo)記；遺傳多樣性

中圖分類號(hào)：S326；Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）03-0570-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.03.046

Genetic Diversity Analysis of Periploca sepium Bunge in Hebei Province by ISSR Markers

DI Kui-ying1，HUANG Da-zhuang1，JIA Yan-jing1，ZHANG Xian-guo2，WANG Wei3，HUO Teng-da4

（1. College of Landscape and Travel，Agricultural University of Hebei，Baoding 071000，Hebei，China；2.Highway Administration Bureau of Hebei Province， Shijiazhuang 050000，China；3. Great Wall Motor Co.， Ltd.， Baoding 071000，Hebei，China；4. Luanping County Propaganda Department，Chengde 068250， Hebei，China）

Abstract：ISSR makers was used to analyze the genetic diversity of 11 Periploca sepium Bunge samples from Shijiazhuang， Handan， Xingtai， Zhangjiakou， Baoding. The results showed that 34 polymorphic primers were selected from 100 general primers for ISSR analysis. 11 samples were tested for PCR， and 8 primers with good polymorphism and stability were screened out， 79 ISSR loci were amplified by 8 primers， among which 63 loci were polymorphic， accounting for 79.7%. Genetic similarity coefficient varied in the range of 0.454 5～0.854 5. the change range of PIC values of polymorphic primers was 0.747～0.884， the average was 0.827. 11 samples were clustered into 3 groups， and the cluster was relatively complex， the accessions were significantly related to the geographical. ISSR molecular markers were applied to the study of genetic diversity of Periploca sepium Bunge， and the genetic diversity was rich.

Key words：Periploca sepium Bunge； ISSR； molecular markers； genetic diversity

杠柳（Periploca sepium Bunge）又叫北五加皮、桃枝子、羊奶子、羊角桃等，是蘿藦科杠柳屬植物。在河北全省均有分布，主要集中于太行山山區(qū)，道路兩旁以及田間荒坡，其根皮為傳統(tǒng)中藥材，有祛風(fēng)濕、利水消腫、強(qiáng)筋骨的作用[1]，其特性為喜光、耐寒、耐旱、耐蔭、耐鹽堿。根系分布深，呈叢生狀態(tài)[2]。杠柳具有廣泛的適應(yīng)性，是優(yōu)良的固沙、水土保持樹種，不僅是優(yōu)良的高速公路邊坡綠化樹種，同時(shí)也是煤矸石山生態(tài)恢復(fù)的可自然定居樹種[3]。近年來，隨著杠柳藥理作用不斷被開發(fā)，市場(chǎng)需求增加，出現(xiàn)過度采挖，而其種苗繁育遲緩，不利于進(jìn)一步開展資源保護(hù)利用以及人工培植規(guī)劃[4]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)杠柳研究多集中于生理生態(tài)及藥理生態(tài)的研究，DNA分子水平研究鮮見報(bào)道。本研究利用ISSR分子標(biāo)記方法對(duì)11個(gè)不同地區(qū)杠柳進(jìn)行分析，篩選適用于杠柳ISSR分子標(biāo)記的引物，并分析其遺傳多樣性，旨在為后續(xù)應(yīng)用分子標(biāo)記方法對(duì)杠柳進(jìn)行相關(guān)研究以及杠柳種質(zhì)資源的合理開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試的11份杠柳種質(zhì)資源，分別采自保定、石家莊、邯鄲、張家口、邢臺(tái)等地（表1），選擇當(dāng)年萌發(fā)的新鮮葉片，低溫下洗凈、晾干，-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?

1.2 杠柳基因組DNA的提取

采用改良CTAB法提取供試樣品DNA：取新鮮葉片1 g，加入適量液氮置于預(yù)冷的研缽中快速研磨，待葉片研磨成粉末，快速裝入預(yù)冷的2 mL離心管中，加入提前預(yù)熱的DNA提取液750 μL，充分振蕩混勻。將混勻后的離心管64.5 ℃熱水浴30 min，加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）抽提，重復(fù)此步驟兩次。取上清液，加入等體積的預(yù)冷異丙醇放入-20 ℃冰箱中凍沉3 h。凍沉結(jié)束后，棄上清液，保留管底白色物質(zhì)，70%乙醇清洗2次，無水乙醇清洗1次，放入烘箱烘干，加入50 μL ddH2O和1 μL RNA酶，冷卻至室溫，放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

用NANODROP2000型超微量核酸儀檢測(cè)濃度和純度，質(zhì)量濃度稀釋至50 ng/μL，4 ℃保存用于ISSR分析。

1.3 引物篩選

擴(kuò)增引物按照加拿大哥倫比亞大學(xué)（UBC）公布的100條ISSR引物序列，由上海生物工程股份有限公司合成。隨機(jī)選取8個(gè)地區(qū)供試樣品進(jìn)行ISSR引物的篩選，從中篩選出適用于杠柳ISSR研究的多態(tài)性引物，并進(jìn)一步篩選多態(tài)性好、背景清晰、穩(wěn)定性高的高效率引物。每個(gè)引物擴(kuò)增程序重復(fù)2次，每條引物的變性溫度根據(jù)引物的Tm值設(shè)置12個(gè)梯度進(jìn)行篩選[5]。具體引物序列以及退火溫度見表2。

1.4 ISSR-PCR擴(kuò)增與產(chǎn)物檢測(cè)

1.4 1PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系 ISSR-PCR擴(kuò)增在BIO-RAD 公司生產(chǎn)BS97MyCycler型PCR儀上進(jìn)行。ISSR反應(yīng)體系：25 μL反應(yīng)體系中含有12.5 μL的 Taq Master Mix，正向引物和反向引物各10 μL，50 ng模板DNA。

1.4.2 擴(kuò)增反應(yīng)程序 ISSR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，52～62 ℃（每條引物不同，詳見表2）退火40 s，72 ℃延伸1.5 min，共40個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸10 min，擴(kuò)增產(chǎn)物4 ℃保存。

1.4.3 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè) 在1×TAE緩沖系統(tǒng)下，取10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠電泳上電泳分離，用DL2000 Marker作為標(biāo)準(zhǔn)分子量進(jìn)行對(duì)照，穩(wěn)定電壓170 V，經(jīng)溴化乙錠（EB）染色后在凝膠成像儀上觀察并照相記錄。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

根據(jù)ISSR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶在瓊脂糖凝膠上的遷移率，對(duì)擴(kuò)增條帶進(jìn)行二元數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，有條帶的賦值為“1”，無條帶的賦值為“0”，條帶弱的位點(diǎn)在重復(fù)擴(kuò)增中穩(wěn)定出現(xiàn)的記為“1”，建立“0”“1”原始數(shù)據(jù)矩陣。用NTSYS-pc 2.10e軟件進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR引物在杠柳上的通用性分析

以供試材料基因組DNA為模板，對(duì)100條ISSR通用引物進(jìn)行篩選，擴(kuò)增結(jié)果表明，43條能擴(kuò)增出產(chǎn)物，其中9條無多態(tài)性，其余均呈現(xiàn)多態(tài)性（表2），通用性較低。圖1所示為引物UBC826擴(kuò)增圖譜。34條多態(tài)性引物擴(kuò)增共得到236條DNA條帶，其中多態(tài)性條帶194條，多態(tài)率82.2%。每對(duì)引物擴(kuò)增條帶數(shù)量范圍在2～16條，平均為6.94條。擴(kuò)增條帶最多的是UBC895，達(dá)16條，多態(tài)率也達(dá)最高為100%，擴(kuò)增條帶較少的引物僅得到2條，如UBC817、UBC824、UBC840、UBC846、UBC853，但多態(tài)率均達(dá)100%，其中引物UBC866僅得到2條DNA條帶，并且多態(tài)率最低為50%。擴(kuò)增DNA片段大小在100～2 000 bp，以500～1 000 bp居多。以上數(shù)據(jù)表明，ISSR分子標(biāo)記檢測(cè)杠柳遺傳多樣性效率較高，同時(shí)說明杠柳種質(zhì)資源具有豐富的遺傳多樣性。

2.2 高效率ISSR引物篩選

對(duì)11份供試樣品進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增并檢測(cè)，進(jìn)一步篩選出8條背景清晰、多態(tài)性好、穩(wěn)定性高的引物進(jìn)行后續(xù)遺傳多樣性研究（表3）。8對(duì)引物共得到79條條帶，多態(tài)性條帶63條，多態(tài)率達(dá)79.7%。以此可見，杠柳種質(zhì)資源在分子水平上多態(tài)性豐富；擴(kuò)增片段長(zhǎng)度在100～2 000 bp之間，每條引物平均擴(kuò)增條帶9.88條，PIC變幅為0.747～0.884，平均為0.827，說明8對(duì)引物均為高度多態(tài)性信息引物[6]，圖2為引物UBC818擴(kuò)增圖譜。

2.3 親緣關(guān)系分析

利用NTSYS-pc 2.10e軟件計(jì)算供試材料間的遺傳相似系數(shù)，得到相似性矩陣（表4）。遺傳相似系數(shù)（GS）可以揭示不同地區(qū)種質(zhì)間彼此遺傳關(guān)系遠(yuǎn)近，11個(gè)不同地區(qū)供試樣品遺傳相似系數(shù)變化范圍在0.454 5～0.854 5，其中供試樣品6與9親緣關(guān)系最近，遺傳相似性系數(shù)高達(dá)0.854 5，供試樣品6與10親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，遺傳相似性系數(shù)僅為0.454 5。結(jié)果表明，不同地區(qū)杠柳種質(zhì)資源遺傳差異明顯。

2.4 聚類分析

利用NTSYS-pc 2.10e軟件對(duì)11份杠柳供試樣品進(jìn)行UPGMA聚類分析，通過Tree plot模塊生成聚類分析樹狀圖（圖3）。從圖3可以看出，11個(gè)不同地區(qū)種質(zhì)材料在相似系數(shù)為0.60水平上分為三大類，第Ⅰ類為來自石家莊贊皇、邢臺(tái)內(nèi)丘、沙河、邯鄲涉縣和武安的樣品；在相似系數(shù)為0.70水平上，第Ⅰ類樣品中來自邯鄲涉縣的樣品與邢臺(tái)內(nèi)丘和石家莊的樣品區(qū)別開來。第Ⅱ類共包括5份種質(zhì)，分別來自于保定易縣、滿城、阜平、淶水、淶源。來自張家口的樣品作為單獨(dú)一支，為第Ⅲ類。由此可見，杠柳種質(zhì)親緣關(guān)系與地理分布呈一定相關(guān)性，其生長(zhǎng)區(qū)域越近親緣關(guān)系越近，充分體現(xiàn)了地域分布和環(huán)境對(duì)杠柳的影響。

3 小結(jié)與討論

物種的遺傳多樣性反映該物種適應(yīng)環(huán)境的能力，遺傳多樣性越豐富，在不同生境存活的可能性越大[7]。ISSR分子標(biāo)記具有較高的多態(tài)性和穩(wěn)定性，無需預(yù)知物種DNA信息背景，操作簡(jiǎn)單，廣泛應(yīng)用于植物的遺傳多樣性研究[8]。本研究通過篩選得到8對(duì)高效ISSR引物，對(duì)11份地理來源不同的杠柳種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析，共檢測(cè)到位點(diǎn)79個(gè)，多態(tài)率達(dá)79.7%，多態(tài)性較高，表明供試杠柳基因組DNA具有明顯的遺傳差異，多樣性豐富。ISSR分子標(biāo)記是一種有效的用于杠柳種質(zhì)資源遺傳多樣性研究的技術(shù)。尹海波等[9]利用ISSR技術(shù)對(duì)老鸛草遺傳多樣性進(jìn)行分析，其多態(tài)率高達(dá)94.6%，趙雪英等[10]利用ISSR標(biāo)記探討了33份綠豆種質(zhì)資源的遺傳多樣性，多態(tài)率達(dá)98.18%。雖然本研究中引物多態(tài)率達(dá)到79.7%，但仍低于上述兩個(gè)研究，分析原因可能是物種的差異導(dǎo)致多態(tài)率的差異，多態(tài)性引物需要進(jìn)一步篩選。

本研究對(duì)杠柳遺傳多樣性僅采用了ISSR技術(shù)，但高山等[11]利用RAPD和ISSR兩種分子標(biāo)記對(duì)苦瓜種質(zhì)資源的遺傳多樣性進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)2種分子標(biāo)記方法都能檢測(cè)其較高的遺傳多樣性，ISSR標(biāo)記較RAPD標(biāo)記多態(tài)性更高。王志清等[12]利用ISSR和SRAP標(biāo)記分別對(duì)61份細(xì)辛資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明相同數(shù)量的引物，ISSR標(biāo)記揭示的多態(tài)性高于SRAP標(biāo)記。王惠梅等[13]分別應(yīng)用SSR和ISSR對(duì)野生菰資源遺傳多樣性進(jìn)行分析表明，SSR標(biāo)記多態(tài)性比率較ISSR要高。因此，在以后的研究應(yīng)進(jìn)一步采用其他標(biāo)記技術(shù)，篩選更適合杠柳的分子標(biāo)記技術(shù)。

分子標(biāo)記是研究物種遺傳多樣性的基礎(chǔ)工作之一，因研究材料和技術(shù)不同，研究結(jié)果不盡相同。本研究結(jié)果表明，不同地區(qū)杠柳的親緣關(guān)系與地域分布呈一定相關(guān)性，這與胡仲義等[14]對(duì)麥冬種質(zhì)資源ISSR分析研究結(jié)果一致。任風(fēng)鳴等[15]對(duì)金錢草種質(zhì)的ISSR研究結(jié)果表明，通過ISSR標(biāo)記的親緣關(guān)系聚類與地理分布不具有明顯的相關(guān)性。

從聚類分析可以看到，一方面，供試材料在聚類中按照緯度變化呈一定的地域相關(guān)性，反映地域隔離產(chǎn)生遺傳差異；另一方面，來自保定不同縣域的種質(zhì)也產(chǎn)生了遺傳差異，充分體現(xiàn)表明杠柳多樣性豐富，進(jìn)一步開發(fā)利用的空間較大。為更全面和真實(shí)地揭示杠柳的遺傳多樣性，更為合理利用、保護(hù)和管理杠柳種質(zhì)資源，有必要采用多種技術(shù)手段、對(duì)更大范圍內(nèi)杠柳種質(zhì)進(jìn)行研究和檢測(cè)其遺傳多樣性。

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