桂西重樓總黃酮體外抗氧化活性研究

莫璐++黃雅珍++張惠++馬小庭++黃晶瑩++黃鎖義++譚冰

摘要：研究了桂西重樓總黃酮的體外抗氧化活性，旨在為抗氧化新藥的開發(fā)提供理論依據(jù)。采用70%乙醇為提取溶劑，1∶40（g∶mL）的料液比，通過回流提取法對廣西重樓總黃酮進(jìn)行提取，經(jīng)減壓濃縮得總黃酮。結(jié)果表明，重樓對ABTS+·、DPPH·、·OH的清除能力以及對Fe3+的還原能力均較強(qiáng)，說明桂西重樓總黃酮的體外抗氧化活性較強(qiáng)。

關(guān)鍵詞：桂西重樓；總黃酮；體外；抗氧化

中圖分類號：R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）03-0538-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.03.037

Study on Antioxidant Activity in Vitro of Total Flavanone

from Polyphylla in Western Guangxi

MO Lu1a，HUANG Ya-zhen1a，ZHANG Hui1a，MA Xiao-ting1b，HUANG Jing-ying1c，HUANG Suo-yi1b，2，TAN Bing1b

（1.Youjiang Medical University for Nationalities，a. College of Clinical Medicine；b.College of Pharmacy；c. College of Basic Medicine，Baise 533000，Guangxi， China；2.Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of the Characteristics of Ethnic Medicine of the Youjiang Valley， Baise 533000， Guangxi，China）

Abstract： The antioxidant activity in vitro of total flavanone from Polyphylla in western Guangxi was studied to provide theoretical basis for the development of new antioxidant drug. Using 70% ethanol as extraction solvent，with material-liquid ratio of 1∶40（g∶mL）， the total flavonoid of Polyphylla in western Guangxi was extracted by reflux extraction method，and then was obtained by decompression concentrator. The results showed that，polyphylla had strong scavenging capacity on ABTS+·，DPPH·， ·OH and strong reducing power on Fe3+. The total flavanone of Polyphylla in western Guangxi had a strong antioxidant activity in vitro.

Key words： polyphylla in western Guangxi； total flavanone； in vitro； antioxidant activity

重樓為百合科植物云南重樓（Paris polyphylla Smith var. yunnanensisiFranch）或七葉一枝花[Paris polyphylla Smith var. chinensis（Franch.） Hara]的干燥根莖。重樓味苦，微寒，有小毒。歸肝經(jīng)。清熱解毒，消腫止痛，涼肝定驚。用于疔瘡癰腫，咽喉腫痛，蛇蟲咬傷，跌撲傷痛，驚風(fēng)抽搐[1]。近現(xiàn)代試驗(yàn)表明，重樓具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，其對惡性淋巴癌、肺癌、鼻咽癌、腦腫瘤及消化系統(tǒng)腫瘤等有較好的治療作用?？鼓[瘤機(jī)制主要是阻滯腫瘤細(xì)胞增殖周期、影響癌基因和抑制癌基因的表達(dá)、影響細(xì)胞信號的傳導(dǎo)等[2]，重樓主要含甾體皂苷、黃酮、多糖等活性成分[2，3]，其中，黃酮類化合物具有鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗炎、抗氧化，抗抑郁、抗衰老、調(diào)節(jié)免疫、抗心律失常及降血脂等作用[2-5]?？梢姡貥堑狞S酮類藥物成分在治療腫瘤疾病方面發(fā)揮了值得肯定的作用。此外黃酮類化合物還對免疫低下、高血脂、抑郁癥等疾病的治療及防衰老、抗氧化方面揮發(fā)重要作用。然而目前對重樓的化學(xué)成分研究仍比較少，其藥理活性研究方面的文獻(xiàn)報(bào)道也不多，生物活性作用物質(zhì)基礎(chǔ)不夠明確，導(dǎo)致其在功能食品和臨床上的應(yīng)用受到局限。目前，國內(nèi)外對重樓抗氧化研究甚少[6-11]。重樓的抗氧化性只限于重樓總皂苷和多糖，而重樓黃酮的抗氧化性未見報(bào)道。因此，國內(nèi)外缺乏重樓總黃酮的抗氧化性研究，限制了重樓的進(jìn)一步開發(fā)利用等問題[12，13]，因此需要進(jìn)一步研究來闡明重樓總黃酮體外抗氧化活性及其作用機(jī)理，為抗氧化新藥的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

重樓購于廣西百色市人民市場藥材店。

1.2 儀器

DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；KQ-C型玻璃儀器氣流烘干器（鞏義市英峪予華儀器廠）；FA1204B型電子天平（上海天美天平儀器有限公司）；SHH-11-4型恒溫水浴鍋（上海百典儀器設(shè)備有限公司）；SHB-III型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；752型紫外可見分光光度計(jì)（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）；RE-3000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.3 試劑

蘆?。ㄉ虾＝鹚肷锟萍加邢薰?，批號：20150305）；ABTS對照品（上海金穗生物科技有限公司，批號：C18H24N606S4）；DPPH對照品（日本東京化成工業(yè)株式會社，217-591-8）。無水乙醇、過氧化氫、鹽酸、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、過硫酸鉀、鐵氰化鉀、三氯化鐵、磷酸二氫鈉、三氯乙酸等均為分析純。

1.4 方法

1.4.1 提取重樓總黃酮 將粉碎后的重樓粉末20.0 g以料液比1∶40加入70%的乙醇，在溫度70 ℃提取2 h，提取2次的條件下進(jìn)行回流冷凝提取，過濾，合并濾液，減壓濃縮至近干，用適量蒸餾水溶解，得重樓黃酮樣品原液75.00 mL，待用。

1.4.2 制作蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線 精確稱量蘆丁對照品10.0 mg，于燒杯中用60%乙醇溶解，定容至100 mL的容量瓶，得100 mg/L的蘆丁原液。準(zhǔn)確量取蘆丁原液0.00、4.00、8.00、12.00、16.00、20.00 mL分別置于6個50 mL的容量瓶中，用60%的乙醇稀釋至25 mL；各加1.40 mL的5% NaNO2溶液，搖勻，室溫放置5 min；各加1.40 mL 10% Al（OH）3溶液，搖勻，靜置6 min；再取5 mL 1 mol/L的NaOH溶液放入容量瓶中，最后用60%乙醇定容至50 mL，分別得到濃度為0.00、8.00、16.00、24.00、32.00、40.00 mg/L的蘆丁對照品待測液。10 min后，以加入0.00 mg/L的蘆丁待測液作為空白對照，于510 nm處平行3次，測量吸光度。以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，濃度C（mg/L）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立線性回歸方程。

1.4.3 重樓總黃酮含量的測定 精密吸取重樓黃酮樣品原液2.50 mL于50 mL的容量瓶中，依次加入1.40 mL的5%NaNO2溶液、1.40 mL10%Al（OH）3溶液及5.00 mL 1 mol/L的NaOH溶液后用60%乙醇定容至50 mL。以60%乙醇代替重樓樣品原液作為空白對照，于510 nm處平行3次，測量吸光度。

1.4.4 重樓總黃酮的體外抗氧化活性

1）對DPPH自由基的清除作用。參考文獻(xiàn)[14]，稍有改進(jìn)。準(zhǔn)確稱取DPPH對照品2.0 mg，以95%乙醇溶解，定容于100 mL的容量瓶中，得0.002% DPPH對照品溶液，避光保存。以無水乙醇依次將重樓總黃酮樣品原液稀釋成2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mg/L的濃度梯度。取5只干凈具塞比色管，將各濃度重樓總黃酮待測液0.50 mL與4.00 mL 0.002% DPPH對照液加入各管中作為待測組。另取5只具塞比色管，以95%乙醇代替0.002% DPPH溶液作為對照組，再以蒸餾水代替重樓總黃酮待測液作為空白組。將3組溶液置于恒溫水浴鍋中，溫度28 ℃，提取時(shí)間30 min處理后，以0.50 mL蒸餾水和4.00 mL 95%乙醇調(diào)零，于517 nm處平行3次測定吸光度A，各取平均值后，計(jì)算對DPPH自由基的清除率。

清除率=[A空白-（A待測-A對照）]/A空白×100%

2）對ABTS自由基的清除能力。將7 mmol/L的ABTS與2.45 mmol/L的K2S2O8溶液等體積混合，室溫避光放置12 h，得ABTS備用液。用無水乙醇稀釋，使其吸光度范圍在2.000±0.100，得ABTS+·檢測液。取11只比色管，分為待測組3.00 mL ABTS+·檢測液與0.30 mL各濃度的重樓總黃酮待測液，以95%乙醇代替ABTS+·檢測液的對照組，95%代替重樓總黃酮待測液的空白組，各組混勻后，室溫靜置6 min，以無水乙醇進(jìn)行調(diào)零，迅速在波長為734 nm處平行測定3次吸光度，取平均值。根據(jù)以下公式進(jìn)行計(jì)算。

清除率=[1-（A待測-A對照）/A空白]×100%

3）對·OH的清除能力。利用Fenton反應(yīng)進(jìn)行測定。取6只具塞比色管，其中5只為待測組按重樓總黃酮待測液各濃度梯度編號，依次向每只管中加入1.00 mL的9 mmol/L FeSO4，2.00 mL的9 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液，2.00 mL相應(yīng)濃度重樓總黃酮待測液，及2.00 mL的8.8 mmol/L H2O2溶液。在室溫下放置1 h。以蒸餾水代替重樓總黃酮待測液作為空白組。以無水乙醇進(jìn)行調(diào)零，在510 nm處平行3次測定吸光度，并取平均值，按以下公式計(jì)算重樓總黃酮待測液對·OH的清除率。

對·OH的清除率=[（A空白-A待測）/A空白]×100%

4）對Fe3+的還原能力。取6只具塞比色管，其中5只作為待測組備用液，分別向其加入2.00 mL各濃度重樓黃酮待測液，2.00 mL磷酸鹽緩沖液（pH 6.6）及2.00 mL 1% K[Fe（CN）6]，混勻后于50 ℃的電熱恒溫水浴鍋中放置20 min。取出后向各管加入2 mL的10% CCI3COOH，混勻后分別取出2.00 mL置于另外的5只具塞比色管，依次向此5只比色管中依次加入2.00 mL蒸餾水和0.50 mL的0.1% FeCI3，混勻，作為待測組份。以無水乙醇代替重樓總黃酮待測液作為調(diào)零組，在700 nm處平行3次測定吸光度（A）。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，濃度C（mg/L）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立線性回歸方程，結(jié)果如表1所示。經(jīng)線性回歸，得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=0.011 8C+0.004 3，回歸系數(shù)為0.999 3。

2.2 總黃酮含量測定結(jié)果

重復(fù)3次取平均值，得A=0.596，代入線性回歸方程A=0.011 8C+0.004 3，計(jì)算得重樓總黃酮樣品原液的濃度50 mg/L，即重樓總黃酮含量為0.003 8 g，提取率為0.019%。

2.3 體外抗氧化活性

2.3.1 對DPPH自由基的清除作用 對DPPH自由基的清除作用見表2和圖1。由圖1可以看出，對DPPH自由基的清除能力隨著重樓總黃酮待測液濃度的增加而增大，且在0.00～8.00 mg/L增長幅度大，超過8.00 mg/L時(shí)，逐漸趨于平衡，清除率可達(dá)96.46%，其自由基清除率接近50%的濃度低于3.00 mg/L，說明桂西重樓總黃酮對DPPH自由基的清除能力作用極強(qiáng)。

2.3.2 對ABTS自由基的清除能力 對ABTS自由基的清除結(jié)果見表3及圖2。從圖2可以看出，桂西重樓總黃酮待測液在濃度為0.00～2.00 mg/L時(shí)，對ABTS+·的清除能力較小，低于20.00%；隨著濃度的增加，清除能力逐漸增強(qiáng)，在2.00～4.00 mg/L增幅最大；之后趨于平衡，最大時(shí)可達(dá)96.62%。當(dāng)濃度在3.00 mg/L時(shí)，清除率約為50%，表明桂西重樓總黃酮對ABTS+·的清除能力很強(qiáng)。

2.3.3 對·OH的清除能力 對·OH的清除率結(jié)果見表4和圖3。由圖3可知，各濃度的桂西重樓總黃酮待測液對·OH均有清除能力，隨著濃度的增加清除率增大，即二者存在一定的正相關(guān)，但增幅不大，在濃度為10.00 mg/L時(shí)趨于平衡，清除率達(dá)36.78%，表明桂西重樓總黃酮對·OH的清除能力較強(qiáng)。

2.3.4 對Fe3+的還原能力 對Fe3+的還原能力結(jié)果見圖4。由圖4可知，隨著桂西重樓總黃酮待測液濃度的增加，其吸光度增大，且增幅均勻，在2.00～8.00 m/L時(shí)呈一定的線性關(guān)系，說明其對Fe3+的還原能力增加。

3 小結(jié)與討論

現(xiàn)代研究表明[15-17]，由于氧化損傷的機(jī)制在疾病的發(fā)展中起著重要的作用，因此，中藥的抗氧化作用是其達(dá)到治療效果的重要因素。很多疾病包括腫瘤、心腦血管疾病、老年癡呆等都不同程度地與自由基損傷有關(guān)。而黃酮類化合物是自然界中抗氧化作用最強(qiáng)的一類天然化合物，由于它具有很強(qiáng)的抑制活性氧、清除自由基作用，同時(shí)毒副作用相對小于化學(xué)合成藥，因此黃酮類化合物一直是人們致力于尋找新藥的重要研究領(lǐng)域。桂西重樓總黃酮對DPPH·、ABTS·及·OH自由基均具有較強(qiáng)的清除能力，對Fe3+表現(xiàn)出較強(qiáng)的還原能力，并隨著重樓濃度的增大而增強(qiáng)。當(dāng)對DPPH自由基的清除率達(dá)50%時(shí)，重樓待測液濃度低于3.00 mg/L；當(dāng)對ABTS自由基的清除率達(dá)50%時(shí)，其所需重樓濃度約為3.00 mg/L，說明重樓抗氧化活性極強(qiáng)。

中國重樓資源豐富，云南、四川、廣西等是中國重樓主產(chǎn)區(qū)，大多數(shù)對重樓的研究均是以云南滇重樓為研究對象，而重樓是廣西的道地藥材和優(yōu)勢資源，具有巨大的醫(yī)藥應(yīng)用開發(fā)價(jià)值，但是，目前并沒有深度開發(fā)利用，如果能開發(fā)利用廣西重樓中草藥資源，大幅度提高其附加值，不僅可以優(yōu)化資源利用，而且可以為廣西和全國的經(jīng)濟(jì)發(fā)展作貢獻(xiàn)，應(yīng)用前景廣闊。

本研究立足于廣西重樓的優(yōu)勢資源，為篩選出高效的藥物和食品抗氧化劑，以及重樓的質(zhì)量控制和藥理作用研究及其深入開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.260.

[2] 鐘 彥，周 濃，杜思雯，等.四種重樓屬植物總黃酮含量的比較分析[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，53（6）：1420-1421.

[3] 張翔宇，唐映軍，周茂嫦，等.珍惜藥用植物植物重樓研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2014，28（1）：78-83.

[4] 方一杰，徐巖成，安毛毛，等.黃酮類化合物的藥動學(xué)和藥理作用研究進(jìn)展[J].藥學(xué)服務(wù)與研究，2015，15（1）：6-9.

[5] 張丹萍，丁 丁.黃酮類化合物的藥理作用的研究[J].北方醫(yī)學(xué)，2015，12（8）：150-151.

[6] 高云濤，楊利榮，楊益林，等.重樓提取物體外清除活性氧及抗氧化作用研究[J].中成藥，2007，29（2）：195-198.

[7] 劉功成，王作偉，李亭亭，等.重樓葉多糖改善D-半乳糖衰老模型小鼠脾臟免疫功能和抗氧化能力[J].食品工業(yè)科技，2015，36（16）：366-369.

[8] 童立雷.重樓總皂苷提取工藝及抗氧化特性[D].合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[9] 廖春麗，吳創(chuàng)業(yè)，鄭 瑞，等.藥用植物浸提液溶藻效果和溶藻機(jī)理的研究[J].河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，48（4）：470-474.

[10] 高琳琳，李福榮，康 莉，等.蚤休醇提物對H2O2損傷的ECV304細(xì)胞的細(xì)胞周期與凋亡的影響[J].中國藥理學(xué)通報(bào)，2008，24（11）：1513-1517.

[11] 李秦康.陜西重樓抗腫瘤活性成分研究[D].陜西咸陽：陜西中醫(yī)學(xué)院，2011.

[12] 何良艷，余美榮，陳建真.重樓的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2011，25（6）：94-97.

[13] 趙保勝，朱寅荻，馬 勇，等.中藥重樓研究進(jìn)展[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（11）：267-269.

[14] 羅 超，劉藹明，邢惟清，等.石參總黃酮抗氧化活性研究[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（13）：198-201.

[15] 任 紅，鄭少杰，張小利，等.基于不同抗氧化機(jī)制的黃酮類化合物構(gòu)效關(guān)系研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技，2016，37（2）：384-388.

[16] ARRUDA S F，SOUZA E M T，SIQUEIRA E M A.Carotenoids from malnga （Xanthosom a sagittifolium） leaves protect cells against ox2 idative stress in rats[J].Int J Vitam Nutri Res，2005，75（2）：161-163.

[17] JAGTAP U B，PANASKAR S N，BAPAT V A. Evaluation of antioxidant capacity and phenol content in jackfruit （Artocarpus heterophyllus Lam.） fruit pulp[J].Plant Foods Hum Nutr，2010，65：102-106.