早期食管癌中ATM和p16蛋白的表達及臨床意義

韓 笑，陸榮柱

食管癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，我國食管癌的發(fā)病率居全球之首，每年發(fā)病率和病死率均占全球發(fā)病率和病死率的一半以上。食管癌的5年生存率僅為10%，但早期食管癌的生存率可達90%[1]。所以“早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療”對于食管癌患者來說意義重大。ATM和p16基因均為抑癌基因，兩者通過特定途徑影響細胞周期，在食管癌的發(fā)生中起重要作用。本文采用免疫組化法檢測ATM和p16蛋白在早期食管癌組織及癌旁正常鱗狀上皮組織中的表達，探討兩者在早期食管癌發(fā)生中的作用及兩者的相關(guān)性，旨在為診斷早期食管癌提供新方法。

1 材料與方法

1.1一般資料選取淮安市腫瘤醫(yī)院2012年1月～2015年12月手術(shù)后經(jīng)病理證實的早期食管癌患者69例，其中男性42例，女性27例，年齡46～78歲，平均62歲。所選取組織肉眼分型有糜爛型、斑塊型、隱伏型，以斑塊型為主；病理組織學類型均為鱗狀細胞癌，其中原位癌9例，黏膜內(nèi)癌22例，黏膜下癌38例，高分化23例，中分化30例，低分化16例；癌旁組織均為早期食管癌患者手術(shù)后大標本的切緣組織，組織學上均為正常的鱗狀上皮組織。

1.2方法采用免疫組化SP法檢測ATM蛋白和p16蛋白的表達。免疫組化染色嚴格按試劑盒說明進行，用PBS緩沖液作為一抗，作為陰性對照；用已知的陽性片作為陽性對照。ATM抗體購自Abcam公司，p16抗體、SP試劑盒及DAB顯色劑均購自福州邁新公司。

1.3結(jié)果判定ATM蛋白和p16蛋白部分表達于細胞核，部分表達于細胞質(zhì)，鏡下細胞核或細胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色顆粒。(1)按著色程度評分：無陽性染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。(2)按陽性細胞百分比評分：陽性細胞數(shù)<10%為0分，10%～25%為1分，25%～50%為2分，>50%為3分。將兩項得分結(jié)果相乘：0分為陰性(-)；1分以上為陽性(+～)，其中1、2分為(+)，3、4分為()，6～9分為()。

1.4統(tǒng)計學方法采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。ATM蛋白和p16蛋白表達與早期食管癌的臨床病理特征的研究采用χ2檢驗，顯著性檢驗水準α=0.05，P<0.05為差異有計學意義。ATM蛋白和p16蛋白表達的相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析，r<1.0為兩者有相關(guān)性。

2 結(jié)果

本組實驗中ATM蛋白和p16蛋白部分表達于細胞核，部分表達于細胞質(zhì)。69例早期食管癌組織中ATM蛋白陽性率為60.9%，p16蛋白陽性率為68.1%，兩者在早期食管癌組織中的表達均低于癌旁正常鱗狀上皮組織(圖1、2)，兩者表達與患者年齡、性別、腫塊位置無關(guān)(P>0.05)，與分化程度、浸潤深度有關(guān)(P<0.05)，隨著分化程度的降低、浸潤深度的加深，兩者表達均下降(表1)。實驗亦發(fā)現(xiàn)ATM蛋白和p16蛋白的表達有一定的相關(guān)性(r=0.598，表2)。

3 討論

ATM基因是肌醇激酶-3(Phosphatidylinostiol 3-kinase, PI3K)基因家族的成員，是一種腫瘤抑制基因[2]。由其編碼的ATM蛋白是一種自動磷酸化蛋白[3]，主要存在于細胞核和細胞質(zhì)中。該蛋白最主要的功能區(qū)位于蛋白C末端，主要參與細胞周期的調(diào)控、DNA損傷識別和修復(fù)[4]。DNA損傷誘導(dǎo)ATM激活，ATM通過磷酸和去磷酸化一系列蛋白底物如p53等參與細胞周期檢測點的監(jiān)管和DNA損傷后修復(fù)信號網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，使受損的DNA阻滯細胞周期的G1/S期、S期和G2/M期這3個檢測點，并對其進行修復(fù)。但當ATM由于突變而造成功能受損時，細胞則喪失這一功能，不能對受損的DNA給予正常修復(fù)，這樣受損的DNA很容易隨細胞分裂而傳入子代細胞，最終導(dǎo)致細胞癌變。Seshagiri等[5]報道ATM蛋白和結(jié)腸癌也有一定的關(guān)系，Roberts等[6]報道ATM蛋白和胰腺癌有一定的關(guān)系，可見ATM蛋白在消化道腫瘤中起很大作用。本實驗采用免疫組化法檢測發(fā)現(xiàn)ATM在早期食管癌組織中的表達低于癌旁正常鱗狀上皮組織，且其表達與組織分化程度、浸潤深度有關(guān)。實驗亦發(fā)現(xiàn)隨著分化程度的降低、浸潤深度的加深，ATM蛋白在早期食管癌組織中的表達越低。這說明當ATM由于突變而造成功能受損時，不能對受損的DNA給予正常修復(fù)，使得受損的DNA很容易隨細胞分裂而傳入子代細胞，最終導(dǎo)致細胞癌變。表明ATM蛋白低表達在早期食管癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。

表2 早期食管癌組織中ATM蛋白和p16蛋白表達的相關(guān)性

①②

圖1 ATM在早期食管癌中的表達，SP法圖2 p16蛋白在早期食管癌中表達，SP法

p16是一種非常重要的抑癌基因[7]，編碼表達一個含148個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。該蛋白可以特異性地與細胞周期素4(CDK4)結(jié)合，抑制CDK4的活性，從而使細胞生長停滯在G1期，細胞的生長受到抑制[8]。在腫瘤細胞內(nèi)，p16基因突變或甲基化后失去正常的蛋白表達功能，出現(xiàn)細胞周期素D與CDK4結(jié)合增加，使細胞增殖加速，最終演變?yōu)榧毎纳L活動失去控制。本組免疫組化檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，p16蛋白在早期食管癌組織中低表達，且其與組織分化程度、浸潤深度有關(guān)，且隨著分化程度的降低、浸潤深度的加深，在早期食管癌組織中的表達越低。這些均說明p16蛋白的低表達或表達缺失在早期食管癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要的促進作用。Noushin等[9]研究發(fā)現(xiàn)在食管癌中p16蛋白表達也下降，還有研究發(fā)現(xiàn)p16蛋白表達缺失可能出現(xiàn)在食管鱗狀細胞癌發(fā)生的早期階段[10]。

ATM和p16均為抑癌基因，可以使細胞周期停滯于G1期，使受損的DNA得到修復(fù)或者細胞生長得以抑制。在食管鱗狀細胞癌中p16蛋白和多種蛋白相關(guān)性研究報道很多，趙醒等[11]報道p16蛋白和Cyclin D1的表達無明顯相關(guān)性，本組實驗結(jié)果顯示，在早期食管癌中p16蛋白和ATM蛋白表達呈正相關(guān)(r=0.598)，兩者表達是否有高度相關(guān)或者顯著性相關(guān)，可能還要進一步擴大樣本研究。實驗亦發(fā)現(xiàn)38例ATM蛋白和p16蛋白同時陽性者中有24例患者分化程度均為Ⅰ～Ⅱ級、浸潤深度在黏膜層以上，這表明聯(lián)合檢測兩者的表達，對判斷早期食管癌的分化程度和浸潤深度上有一定提示作用，這也間接表明兩者對預(yù)后有一定提示作用。

本組69例早期食管癌患者手術(shù)后均未行放、化療，有2例死于腦血管疾病，1例術(shù)后隨訪胸部X線發(fā)現(xiàn)肺部小粟粒狀陰影，拒絕進一步檢查治療，所以不能確定是否是轉(zhuǎn)移灶。本組實驗對ATM蛋白和p16蛋白在早期食管癌中的表達情況進行觀察，旨在為診斷早期食管癌提供新的診斷思路和方向，且兩者表達呈正相關(guān)，對判斷早期食管癌的分化程度和浸潤深度上有一定的提示作用。

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