尿脫落細胞瓊脂石蠟雙包埋連續(xù)切片法對膀胱癌的診斷價值

郭智俊，彭桂香，張丹芳，鐘勝華，黃風琴，劉 浩

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤。尿液細胞學檢查是臨床上應用廣泛且最有效的無創(chuàng)性膀胱癌診斷方法之一。其操作簡易、快速，標本取樣簡便、容易，患者無損傷、無痛苦，并能早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷膀胱癌，適合于大規(guī)模人群普查。但涂片法往往造成細胞不集中、量少，細胞易退變，易脫落，血尿標本涂片常常出現(xiàn)細胞堆積、厚薄不一致，細胞結(jié)構(gòu)及背景不清晰等現(xiàn)象，導致癌細胞低檢出率，使患者漏診人數(shù)增加。近年來，切片技術(shù)在脫落細胞學中的應用，提高了腫瘤細胞的陽性檢出率。關(guān)于胸腹水脫落細胞檢查的有關(guān)技術(shù)報道較多[1-4]，但未見尿脫落細胞切片的研究報道。作者在實際工作中經(jīng)過探索，借助胸腹水細胞切片的制做方法，設(shè)計了尿脫落細胞瓊脂石蠟雙包埋連續(xù)切片法，同時對尿脫落細胞瓊脂石蠟雙包埋連續(xù)切片法和涂片法在膀胱癌中的診斷價值進行了對比分析，效果滿意，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1材料收集膀胱鏡活檢組織病理檢查確診為膀胱癌患者的尿液標本71份，離心采用普通水平式離心機，脫水、包埋、切片、染色采用病理科的常規(guī)組織脫水機、包埋機、石蠟切片機和染色機。

1.2方法

1.2.1標本處理 (1)非血性尿液標本的處理：收到尿液標本后自然靜止沉淀25 min，將容器底部60 mL左右的尿液分別倒入4個15 mL的離心管中，經(jīng)1 200 r/min離心沉淀5 min，把上清液棄去；然后將沉淀物集中收集到1只尖底塑料試管內(nèi)，經(jīng)1 500 r/min離心沉淀3 min，棄上清液，取少量沉淀物直接涂片2張，行常規(guī)HE染色，再在剩余的沉淀物中加入0.3%伊紅乙醇溶液(0.3 g醇溶性伊紅加入95%乙醇100 mL)0.5～1.5 mL，以1 500 r/min離心5 min，棄上清液，留下試管底部的沉淀物備用。加入0.3%伊紅乙醇溶液既能固定細胞，又能使沉淀物中的細胞著色，便于包埋和切片。(2)血性尿液標本的處理：收到尿液標本后自然靜止沉淀25 min，將容器底部60 mL左右的尿液分別倒入4個15 mL的離心管中，經(jīng)1 200 r/min離心沉淀5 min，把上清液棄去；然后將沉淀物集中收集到1只尖底塑料試管內(nèi)，經(jīng)1 500 r/min離心沉淀3 min，棄上清液，取少量沉淀物做直接涂片2張，常規(guī)HE染色，再在剩余的沉淀物中加入5%醋酸乙醇溶液(5 mL冰醋酸加入95%乙醇95 mL)0.5～1.5 mL，以1 500 r/min離心沉淀5 min，棄上清液，留下試管底部的沉淀物備用。5%醋酸乙醇溶液既可以固定細胞，又可以溶解血尿中的紅細胞。

1.2.2沉淀物瓊脂石蠟雙包埋處理 將4.5%瓊脂(稱取廣東汕頭市水產(chǎn)品綜合加工廠生產(chǎn)的瓊脂粉4.5 g倒入三角燒杯中，加蒸餾水100 mL加熱使瓊脂充分溶解，置63 ℃恒溫箱中保存?zhèn)溆?倒入預熱到63 ℃左右的包埋模子里，待溫度稍降，冷卻至瓊脂表面將要凝固時迅速將上述保留在管底備用的沉淀物注入瓊脂內(nèi)，即可形成有顏色(淡或暗紅色)的細胞團塊。之后，待瓊脂自然冷卻凝固或可將石蠟包埋模子放在冰上以加速瓊脂凝固。取出瓊脂包埋好的細胞團塊，用刀片切去細胞團塊周圍多余的瓊脂，使之成為小塊。較小的沉淀物周圍的瓊脂可多些，以便于定位和操作。將細胞團塊放入已編號的組織脫水包埋盒中，置組織脫水機中按常規(guī)方法進行脫水、透明、浸蠟，取出細胞團塊按常規(guī)組織石蠟包埋方法進行包埋。

1.2.3連續(xù)切片和染色 把細胞團塊周邊的石蠟修掉，越小越好，3～4 μm厚連續(xù)切片，沉淀物少的標本連續(xù)性切完。按常規(guī)方法脫蠟、HE染色、封片。

1.2.4尿脫落細胞診斷方法 由經(jīng)驗豐富的腫瘤病理學專家對尿脫落細胞常規(guī)涂片和尿脫落細胞瓊脂石蠟雙包埋連續(xù)切片做出診斷。診斷結(jié)果分為五級：Ⅰ級：未見腫瘤細胞；Ⅱ級：查見核異質(zhì)細胞；Ⅲ級：查見可疑癌細胞；Ⅳ級：查見高度可疑癌細胞；Ⅴ級：查見癌細胞。統(tǒng)計學分析時將Ⅰ～Ⅱ級定為陰性，Ⅲ～Ⅴ級定為陽性。

1.3統(tǒng)計學方法采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學分析。數(shù)據(jù)比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計意義。

2 結(jié)果

尿脫落細胞瓊脂石蠟雙包埋連續(xù)切片法鏡下細胞數(shù)目多，細胞集中，形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰，厚薄一致，圖像背景干凈(只是在細胞塊周圍略微可見瓊脂痕跡)，易于觀察診斷(表1)。經(jīng)膀胱鏡活檢病理檢查確診為膀胱癌的71例尿液標本中尿脫落細胞常規(guī)涂片法檢測出陽性標本51例，陽性率為71.8%(51/71)，尿脫落細胞瓊脂石蠟雙包埋連續(xù)切片法檢測出陽性標本65例，陽性率為91.5%(65/71)。尿脫落細胞瓊脂石蠟雙包埋連續(xù)切片法陽性率明顯高于尿脫落細胞常規(guī)涂片法(P<0.01，表2)。尿脫落細胞瓊脂石蠟雙包埋連續(xù)切片法癌細胞的檢出率顯著高于尿脫落細胞常規(guī)涂片法，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

表1 兩種方法細胞形態(tài)及制片質(zhì)量比較

表2 兩種方法檢測膀胱癌的結(jié)果比較

3 討論

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，也是泌尿外科的常見病之一。尿路上皮癌是其最為常見的病理類型，占膀胱腫瘤的90%～95%，其余5%～10%是間葉性腫瘤和其他罕見型上皮性腫瘤[5]。近年來，膀胱癌的發(fā)病率和病死率逐年上升[6-7]。全球每年約35.6萬新增病例，發(fā)病率位居所有腫瘤的第9位[8]。男性發(fā)病率是女性的3倍。在美國，膀胱尿路上皮癌位居男性最常見癌癥的第4位，在女性中位居第8位[9]。膀胱癌的發(fā)病和吸煙有關(guān)，也和各種環(huán)境及職業(yè)的化學物質(zhì)接觸有關(guān)。膀胱癌的發(fā)病機制包括復雜的多種基因變化[10]。隨著我國工業(yè)化進程加快、吸煙人數(shù)增加以及環(huán)境污染不斷加重，膀胱腫瘤患者數(shù)量也呈逐漸增加趨勢。據(jù)統(tǒng)計，中國人膀胱癌的發(fā)病率在60歲以后超過腎腫瘤，居中國泌尿系惡性腫瘤發(fā)病的第1位[11]。惡性度高、術(shù)后易復發(fā)[12]是膀胱癌的主要臨床特點。約70%患者起病時表現(xiàn)為淺表性病變，復發(fā)率高達60%～85%，10%～20%最終發(fā)展為浸潤性癌或轉(zhuǎn)移性癌[13-15]，因此，對膀胱癌的早期診斷以及對術(shù)后復發(fā)的監(jiān)測非常重要。2001年由美國食品藥品管理局批準的運用FISH探針來識別膀胱癌的畸變?nèi)旧w，其靈敏度明顯高于尿脫落細胞學檢查，是目前診斷和發(fā)現(xiàn)膀胱癌很有價值的無創(chuàng)方法，但國內(nèi)FISH技術(shù)仍處于臨床研究階段，靈敏度和特異性與國外也多有不同[16]。而且FISH檢測費用昂貴、所需設(shè)備及技術(shù)要求高、操作流程復雜，不適于大規(guī)模人群普查。許多學者通過多種尿液腫瘤標志物檢測間接診斷膀胱癌，但均存在一定的缺陷，傳統(tǒng)的膀胱鏡和尿脫落細胞學檢查仍是目前臨床上診斷、隨訪膀胱癌的金標準[17-18]。膀胱鏡檢查具有較高的敏感性和特異性，但其為有創(chuàng)檢查，患者痛苦，花費較高，患者難以接受[19-20]，而且觀察范圍有限，可能會遺漏位于難以窺視部位的腫瘤。同時，膀胱鏡的有創(chuàng)檢查可能導致尿道感染性疾病的發(fā)生，因此膀胱鏡難以作為普查手段。在無創(chuàng)篩查手段中，尿液脫落細胞學檢查是目前臨床泌尿系腫瘤的有效篩查手段[21]，尿脫落細胞學涂片檢查具有高特異性，其操作簡便、準確、經(jīng)濟，標本來源容易，患者無痛苦、無損傷，并能早期發(fā)現(xiàn)早期診斷膀胱癌，患者容易接受，適合于大規(guī)模人群普查，但其敏感性較低[22-23]，易漏診。導致其敏感性低的原因主要由于尿脫落細胞學涂片法只能取少量沉淀物涂片，而且涂片范圍大，細胞不集中、量少，鏡下觀察費時、易漏診；同時涂片法細胞固定較困難，如果直接將玻片放入95%乙醇內(nèi)固定，會造成大多數(shù)細胞脫落，如果干燥后再固定，細胞易退變，細胞核模糊不清，易誤診。血尿標本涂片常常出現(xiàn)細胞堆積、厚薄不一致，細胞結(jié)構(gòu)及背景不清晰等現(xiàn)象。從而導致癌細胞檢出率低，使患者漏診人數(shù)增加。因此探索一種簡便、經(jīng)濟、適用于普查手段兼顧敏感性和特異性的無創(chuàng)檢查方法十分必要。筆者借助胸腹水細胞切片的制做方法。設(shè)計了尿脫落細胞瓊脂石蠟雙包埋連續(xù)切片法，并與涂片法對比，取得了滿意的效果。尿脫落細胞瓊脂石蠟雙包埋連續(xù)切片法可避免上述缺點。尿脫落細胞瓊脂石蠟雙包埋切片提高了尿脫落細胞檢查的制片質(zhì)量，鏡下細胞厚薄一致，呈薄片狀排列、形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰。同時，該方法幾乎能將送檢尿液標本中的所有脫落細胞收集起來，使被檢細胞數(shù)量明顯增加，而且細胞集中，密度高，便于觀察診斷，從而可減少漏診，提高陽性細胞的檢出率。王蓉等[24]報道，連續(xù)切片法可顯著提高癌周淋巴結(jié)癌轉(zhuǎn)移的檢出率和可信度，特別是對于常規(guī)切片法一個切面容易漏診的微小轉(zhuǎn)移灶能明顯提高檢出率，是一種經(jīng)濟、簡便、準確的病理組織學方法。王春建等[25-26]研究結(jié)果也證實連續(xù)病理切片后HE染色能提高乳腺癌前哨淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的檢出率。本組實驗借助組織學連續(xù)切片法可保證切片時各細胞及碎小組織完整切出，從而進一步提高陽性細胞的檢出率。本組實驗結(jié)果顯示，尿脫落細胞常規(guī)涂片法陽性率為71.8%，尿脫落細胞瓊脂石蠟雙包埋連續(xù)切片法陽性率為91.5%，尿脫落細胞瓊脂石蠟雙包埋連續(xù)切片法癌細胞檢出率明顯高于尿脫落細胞常規(guī)涂片法(P<0.01)。 本組實驗采用將細胞沉淀物注入包埋模子里的瓊脂內(nèi)，比將瓊脂加入離心管內(nèi)與細胞沉淀物混合的方法操作更方便，可避免瓊脂在與細胞混合前受冷凝固的問題。值得注意的是，瓊脂需要冷卻且在沒有凝固之前將細胞注入，溫度過高，細胞受熱會影響細胞形態(tài)；溫度過冷，瓊脂凝固狀態(tài)時難以將細胞注入進去。

膀胱癌早期診斷和預后監(jiān)測是提高診治的關(guān)鍵。尿脫落細胞瓊脂石蠟雙包埋連續(xù)切片法是一種簡便、經(jīng)濟、適用于普查手段兼顧敏感性的無創(chuàng)檢查方法。該方法將有助于早期診斷、術(shù)后監(jiān)測膀胱癌，提高膀胱癌患者生存率、改善預后，在臨床上有較高的應用價值，值得普及推廣應用。

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