UPLC—MS/MS測(cè)定復(fù)方丹參方中丹參酮ⅡA、丹參酚酸B、人參皂苷Rg1及其在大鼠血漿和腦組織的藥代動(dòng)力學(xué)研究

張杰+劉勝蘭+王慧+陽(yáng)國(guó)平+李勁平+劉世坤+唐智+裴奇+黃攀豪

[摘要]建立大鼠血漿和腦組織中丹參酮Ⅱ_a（TSⅡ_a）、丹酚酸B（SAB）、人參皂苷Rg₁（GRg₁）的UPLC-MS/MS分析方法，并開(kāi)展藥物動(dòng)力學(xué)研究。選用SD大鼠，單劑量灌胃（ig）復(fù)方丹參方，采集血液與腦組織樣品，采用UPLC-MS/MS測(cè)定血漿和腦組織中TSⅡ_a、SAB和GRg₁的濃度，以Phoenix WinNolin 6.1藥動(dòng)學(xué)程序軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行非房室模型擬合，采用統(tǒng)計(jì)矩法計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。經(jīng)方法學(xué)考證，3種成分的峰面積與其在血樣及腦組織中的濃度線(xiàn)性關(guān)系良好（r>0.992 2）；回收率為58.86%～112.1%，日內(nèi)、日間RSD≤9.7%，準(zhǔn)確度及穩(wěn)定性均符合體內(nèi)藥物分析的要求。大鼠ig給復(fù)方丹參方后的血漿藥動(dòng)參數(shù)如下：丹參酮Ⅱ_atmax（1.58±0.081） h，Cmax（725.4±88.20） μg·L^-1，AUC0-t（2 101.3±124.85） μg·h·L^-1， MRT0-t（3.66±0.05） h；丹酚酸B tmax（1.29±0.21） h，Cmax（307.9±46.75） μg·L^-1，AUC0-t（537.4±88.24） μg·h·L^-1， MRTlast （2.08±0.11） h；人參皂苷Rg₁tmax（1.42±0.20） h，Cmax（460.38±154.60） μg·L^-1，AUC0-t（383.4±88.16） μg·h·L^-1， MRTlast （1.87±0.046） h。腦組織藥動(dòng)參數(shù)如下：丹參酮ⅡA tmax（0.75±0.22） h，Cmax（1.41±0.420） ng·g^-1，AUC0-t（4.34±2.48） ng·h·g^-1， MRT0-t （4.00±1.90） h；丹酚酸B tmax（1.08±0.20） h，Cmax（21.09±4.850） ng·g^-1，AUC0-t（14.83±3.160） ng·h·g^-1， MRT0-t（0.99±0.08） h；人參皂苷Rg₁tmax（0.50±0.16） h，Cmax（130.96±54.220） ng·g^-1，AUC0-t（136.24±34.350） ng·h·g^-1， MRT0-t（2.87±0.33） h。該研究所建立的UPLC-MS/MS方法可用于大鼠血漿及腦組織中丹參酮Ⅱ_a、丹酚酸B、人參皂苷Rg₁中的藥動(dòng)學(xué)研究。

[關(guān)鍵詞]UPLC-MS/MS； 丹參酮Ⅱ_a； 丹酚酸B； 人參皂苷Rg₁； 藥動(dòng)學(xué)

[Abstract]A sensitive and specific ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry （UPLC-MS/MS） method was developed for analysis of tanshinone Ⅱ_a（TSⅡ_a）， salvianolic acid B（SAB） and ginsenoside Rg₁（GRg₁） in rat plasma and brain tissues. Male healthy Sprague-Dawley（SD） rats were orally given single dose of Fufang Danshen preparation （TS Ⅱ_a 60 mg·kg^-1， SAB 300 mg·kg^-1， GRg₁ 150 mg·kg^-1， borneol 300 mg·kg^-1）， and their blood samples and brain tissues were collected at different time points. The drug plasma and brain tissue concentrations of the three analytes were determined by UPLC-MS/MS method. Subsequently， the main pharmacokinetics parameters of plasma and brain tissues were calculated by using Phoenix WinNolin 6.1 software. The methodological test showed that all of analytes in both plasma and brain homogenate exhibited a good linearity within the concentration range（r>0.992 2）. Their mean recoveries were between 58.86% and 112.1%. Intra-day and inter-day precisions of the investigated components exhibited RSD≤9.7%， and the accuracy（RE） ranged from -9.68% to 8.20% at all quality control levels. The results of accuracy and stability meet the requirements for biopharmaceutical analysis. For TSⅡ_a， the pharmacokinetics parameters tmax， Cmax， AUC0-t， MRTlast in the plasma were （1.58±0.081） h， （725.4±88.20） μg·L^-1， （2 101.3±124.85） μg·h·L^-1 and （3.66±0.05） h， respectively. For SAB， the pharmacokinetics parameters tmax， Cmax， AUC0-t， MRTlast in the plasma were （1.29±0.21） h， （307.9±46.75） μg·L^-1， （537.4±88.24） μg·h·L^-1 and （2.08±0.11） h， respectively. For GRg₁， the pharmacokinetics parameters tmax， Cmax， AUC0-t， MRTlast in the plasma were （1.42±0.20） h， （460.38±154.60） μg·L^-1， （383.4±88.16） μg·h·L^-1 and （1.87±0.046） h， respectively. For TSⅡ_a， the pharmacokinetics parameters tmax， Cmax， AUC0-t， MRTlast in the brain tissue were （0.75±0.22） h， （1.41±0.42） ng·g^-1， （4.34±2.48） ng·h·g^-1 and （4.00±1.90） h， respectively. For SAB， the pharmacokinetics parameters tmax， Cmax， AUC0-t， MRTlast in the plasma were （1.08±0.20） h， （21.09±4.850） ng·g^-1， （14.83±3.160） ng·h·g^-1 and （0.99±0.08） h， respectively. For GRg₁， the pharmacokinetics parameters tmax， Cmax， AUC0-t， MRTlast in the plasma were （0.50±0.16） h， （130.96±54.220） ng·g^-1， （136.24±34.350） ng·h·g^-1 and （2.87±0.33） h， respectively. The developed method was successfully applied in pharmacokinetic studies on content of TS Ⅱ_a， SAB and GRg1 in rat plasma and brain tissues.

[Key words]UPLC-MS/MS； tanshinone Ⅱ_a； salvianolic acid B； ginsenoside Rg₁； pharmacokinetic

復(fù)方丹參方由丹參、三七和冰片3味中藥組成，活血化瘀，理氣止痛，被廣泛用于冠心病、心復(fù)絞痛、腦缺血再灌注損傷、腦缺血、阿爾茲海默病等^[1-3]，療效確切，《中國(guó)藥典》1977年版至2015年版均有收載，且已列入國(guó)家基本藥品目錄。研究表明，丹參主要有效成分為丹參酮Ⅱ_a、隱丹參酮等脂溶性丹參酮類(lèi)和丹參酚酸B、丹參素等水溶性丹參酚酸類(lèi)，對(duì)心肌缺血、腦缺血以及腦缺血再灌注損傷具有明顯的保護(hù)作用^[4]。三七皂苷R₁、人參皂苷Rg₁和Rb₁等三七皂苷類(lèi)是三七的主要有效成分，具有改善微循環(huán)、抗血栓形成和擴(kuò)張血管等作用^[5]。冰片為佐使藥，芳香走竄，“引藥上行”。

近年來(lái)，有關(guān)復(fù)方丹參方藥理藥效、藥代動(dòng)力學(xué)、劑型、質(zhì)量控制等研究報(bào)道較多。在藥代動(dòng)力學(xué)領(lǐng)域，大多局限于丹參、三七單獨(dú)或聯(lián)合給藥后大鼠血漿藥動(dòng)學(xué)行為研究，或注射單體后于某一時(shí)間點(diǎn)在大鼠腦組織中的分布情況研究^[6-9]。本研究采用UPLC-MS/MS技術(shù)，建立了復(fù)方丹參方中主要有效成分丹參酮Ⅱ_a、丹參酚酸B、人參皂苷Rg₁在大鼠血漿和腦組織中定量分析方法，并應(yīng)用此分析方法對(duì)大鼠血漿及腦組織中的藥動(dòng)學(xué)特征進(jìn)行了研究，為進(jìn)一步開(kāi)展復(fù)方丹參方配伍規(guī)律、臨床應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

Waters Xevo TQ-S型三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀，包括Waters Acquity I 型 UPLC液相色譜儀帶自動(dòng)進(jìn)樣器和柱溫箱，帶電噴霧離子化源（ESI）和MassLynx V4.1軟件數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（Waters，美國(guó)）；METTLER TOLEDO MS105DU型1/10萬(wàn)天平（METTLER，美國(guó)）；VORTEX-6旋渦混合器（江蘇海門(mén)其林貝爾儀器制造有限公司）；VIBRAX VXR 振蕩器（德國(guó)IKA公司）；Eppendorf Centrifuge 5415型冷凍高速離心機(jī)（德國(guó)）；吉爾森移液器；ND100-1 氮?dú)獯祾邇x（杭州瑞誠(chéng)儀器有限公司）。

丹參酮Ⅱ_a（TSⅡ_a，純度99.08%，批號(hào)Must-15081916）、丹酚酸B（SAB，純度99.08%，批號(hào)Must-15092512）、人參皂苷Rg₁（GRg₁，純度98.10%，批號(hào)Must-15042215）對(duì)照品購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司；多潘立酮對(duì)照品（批號(hào)100304-201103）和雙氯酚酸鈉對(duì)照品（批號(hào)100334-200302）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；三七總皂苷（批號(hào)Must-15060601，人參皂苷Rg₁的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為44.8%）；冰片（湖南科瑞鴻泰股份有限公司）和丹參（湖南崇善堂中藥飲片有限公司）經(jīng)中南大學(xué)藥學(xué)院李勁平副教授鑒定均符合藥典規(guī)定；丹參煎液的制備：取丹參飲片300 g，按2015年版《中國(guó)藥典》中復(fù)方丹參片中丹參的提取工藝進(jìn)行提取，并濃縮至200 mL。用HPLC測(cè)定丹參煎液中TSⅡ_a 6 g·L^-1，SAB 30 g·L^-1。甲醇、乙腈（色譜純，Merck）；甲酸（色譜純，ACS）；水（娃哈哈純凈水）；其他為分析純?cè)噭?/p>

SPF級(jí)SD雄性大鼠66只，體重（220±20） g，由中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)SCXK（湘）2014-0016。

2 方法

2.1 給藥與樣品采集

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，實(shí)驗(yàn)前12 h 禁食不禁水，并隨機(jī)分為11組，每組6只，各組大鼠均按丹參15 g·kg^-1（TSⅡ_a 60 mg·kg^-1，SAB 300 mg·kg^-1），三七5 g·kg^-1（GRg1 150 mg·kg^-1），冰片300 mg·kg^-1ig給藥。于給藥前和給藥后15，30，45 min 和1，1.5，2，4，6，8，10 h 摘除眼球采血，肝素抗凝。并立即在冰臺(tái)上快速取大鼠腦組織，剝離軟腦膜，生理鹽水洗凈，濾紙吸干表面水分，稱(chēng)重，以生理鹽水為勻漿液，按1 mL生理鹽水含0.45 g腦組織進(jìn)行勻漿，將血漿以及腦組織勻漿樣品均放置于-20 ℃冰箱保存。

2.2 樣品處理

2.2.1 血漿中TSⅡ_a，GRg₁測(cè)定樣品處理 精密吸取100 μL血漿，精密加入15 μL 多潘立酮（20 μg·L^-1）混勻，加入300 μL乙腈，于震蕩器上震蕩10 min（1 500 r·min^-1），13 200 r·min^-1離心8 min，吸取上清液100 μL置于新EP管中，加入200 μL水，渦旋混勻，取10 μL進(jìn)樣檢測(cè)。

2.2.2 腦組織TSⅡ_a，GRg₁測(cè)定樣品處理 精密吸取100 μL腦組織勻漿，精密加入5 μL 多潘立酮溶液（20 μg·L^-1）混勻，加入150 μL乙腈，于震蕩器上震蕩10 min（1 500 r·min^-1），13 200 r·min^-1離心8 min，吸取上清液100 μL置于新EP管中，加入150 μL水，渦旋混勻，取10 μL進(jìn)樣檢測(cè)。

2.2.3 血漿及腦組織中SAB測(cè)定樣品處理 精密吸取200 μL血漿或腦組織勻漿，精密加入10 μL雙氯芬酸鈉溶液（1 mg·L^-1）混勻，加入80 μL HCl溶液（1 mol·mL^-1）混勻，再以2 mL乙酸乙酯震蕩（1 500 r·min^-1）提取10 min，吸取上清，于40 ℃下N₂吹干，150 μL 50%乙腈溶液復(fù)溶，13 200 r·min^-1離心8 min，取上清10 μL進(jìn)樣檢測(cè)。

2.3 測(cè)定條件

2.3.1 色譜條件 分別建立測(cè)定血漿與腦組織樣品中TSⅡ_a，GRg₁，SAB濃度的色譜條件。色譜柱ACQUITY UPLCTM BEH 苯基柱（2.1 mm× 50 mm，1.7 μm），流動(dòng)相A為乙腈（含0.1%甲酸），B為0.25%甲酸水，柱溫為35 ℃，進(jìn)樣體積10 μL。TSⅡ_a，GRg₁和內(nèi)標(biāo)多潘立酮的梯度洗脫程序?yàn)?～3 min，24% A，3～4 min，24%～85% A，4～6 min，85%A，6～7 min，24% A，流速0.2 mL·min^-1。SAB和內(nèi)標(biāo)雙氯芬酸鈉梯度洗脫程序?yàn)?～1.8 min，35%A，1.8～4 min，35%～60%A，4～5 min，60%～35%A，流速為0.25 mL·min^-1。

2.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI），分別以正、負(fù)離子模式檢測(cè)。正離子模式檢測(cè)TSⅡ_a，GRg₁和多潘立酮，負(fù)離子模式檢測(cè)SAB和雙氯芬酸鈉。工作參數(shù)設(shè)置為：離子源溫度500 ℃，噴霧電壓3.0 kV，霧化氣N₂的流速為1 000 L·h^-1，碰撞氣氬氣的流速為0.12 mL·min^-1。掃描方式為多反應(yīng)檢測(cè)（MRM），檢測(cè)以下離子反應(yīng)m/z 295/249.3（TSⅡ_a），碰撞能量為20 V；m/z 823.09/643.17（GRg₁），碰撞能量為35 V；m/z 426.20/147.0（多潘立酮），碰撞能量為35 V；m/z 716.81/518.83（SAB），碰撞能量為14 V；m/z 293.95/249.85（雙氯芬酸鈉），碰撞能量為10 V。

3 結(jié)果

3.1 專(zhuān)屬性考察

取大鼠空白血漿或腦勻漿、大鼠空白血漿或腦勻漿加對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)、給藥后的大鼠血漿或腦勻漿（加內(nèi)標(biāo)），按2.2項(xiàng)下操作，色譜圖見(jiàn)圖1，結(jié)果表明，血漿和腦組織中內(nèi)源性雜質(zhì)不干擾待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)的測(cè)定，方法專(zhuān)屬性良好。

3.2 線(xiàn)性范圍及定量下限考察

取對(duì)照品儲(chǔ)備液、大鼠空白血漿以及空白腦勻漿，通過(guò)倍比稀釋得到標(biāo)準(zhǔn)血樣和腦組織勻漿樣品，按2.2項(xiàng)下樣品前處理后進(jìn)行分析，以被測(cè)化合物的峰面積（Y）對(duì)其在血漿或腦勻漿中的濃度（C）用加權(quán)（1/C²） 最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，所得TSⅡ_a，SAB，GRg₁在大鼠血漿及腦勻漿中的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程、線(xiàn)性范圍、相關(guān)系數(shù)以及定量下限見(jiàn)表1。試驗(yàn)以S/N≥10作為定量標(biāo)準(zhǔn)。

3.3 精密度及準(zhǔn)確度試驗(yàn)

取空白血漿和空白腦勻漿90 μL或180 μL，分別加入不同濃度的TSⅡ_a，SAB，GRg₁對(duì)照品溶液10 μL或20 μL制備低、中、高質(zhì)量濃度（TSⅡ_a血漿質(zhì)量濃度為10，80，800 μg·L^-1；SAB血漿質(zhì)量濃度為10，32，320 μg·L^-1；GRg₁血漿質(zhì)量濃度為2，16，160 μg·L^-1；TSⅡ_a腦勻漿質(zhì)量濃度為0.1，0.8，8 μg·L^-1；SAB腦勻漿質(zhì)量濃度為10，32，320 μg·L^-1；GRg₁腦勻漿質(zhì)量濃度為2，16，160 μg·L^-1）的QC樣品，按2.2項(xiàng)下方法處理，每個(gè)濃度點(diǎn)5個(gè)樣品，依法與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)同批測(cè)定，連續(xù)測(cè)定3批（分別于3 d內(nèi)完成），用隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算QC樣品的濃度。據(jù)此求算方法的準(zhǔn)確度和精密度。結(jié)果表明，血漿中TSⅡ_a日內(nèi)、日間準(zhǔn)確度分別為91.60%～93.14%（RSD≤4.1%，N=5），89.74%～91.48%（RSD≤5.8%，N=15）；腦勻漿中TSⅡ_a日內(nèi)、日間準(zhǔn)確度分別為95.20%～104.2%（RSD≤3.8%，N=5），102.7%～106.2%（RSD≤6.6%，N=15）；血漿中SAB日內(nèi)、日間準(zhǔn)確度分別為99.17%～110.5%（RSD≤6.3%，N=5），102.5%～106.2%（RSD≤7.3%，N=15）；腦勻漿中SAB日內(nèi)、日間準(zhǔn)確度分別為105.8%～106.5%（RSD≤3.4%，N=5），101.2%～105.2%（RSD≤8.0%，N=15）；血漿中GRg₁日內(nèi)、日間準(zhǔn)確度分別為101.9%～111.2%（RSD≤4.0%，N=5），96.37%～105.6%（RSD≤8.8%，N=15）；腦勻漿中GRg₁日內(nèi)、日間準(zhǔn)確度分別為87.42%～96.86%（RSD≤3.7%，N=5），90.31%～96.44%（RSD≤5.0%，N=15）。結(jié)果均符合生物樣品分析方法指導(dǎo)原則的要求。

3.4 回收率考察

準(zhǔn)確配制血漿或腦勻漿的低、高濃度質(zhì)控（QC）樣品，按2.2項(xiàng)下方法操作，記錄待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)的峰面積；同時(shí)用空白基質(zhì)配制相應(yīng)濃度的待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)溶液進(jìn)樣得到的峰面積作為對(duì)照，每個(gè)濃度平行操作6份，回收率=血漿或腦勻漿樣品的平均峰面積/空白基質(zhì)樣品平均峰面積×100%，結(jié)果用±s表示，見(jiàn)表2。采用同樣的方法考察內(nèi)標(biāo)多潘立酮和雙氯芬酸鈉在血漿和腦勻漿中的回收率，結(jié)果多潘立酮在血漿及腦勻漿中的回收率分別為（98.1±2.97）%，（100.0±1.31）%；雙氯芬酸鈉在血漿及腦勻漿中的回收率分別為（69.8±1.85）%，（77.5±3.85）%。

3.5 基質(zhì)效應(yīng)

取空白血漿或空白腦組織勻漿和相對(duì)應(yīng)體積的純水，按2.2項(xiàng)下方法處理后，加入相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，使得各待測(cè)組分的濃度與低、高質(zhì)控樣品濃度相當(dāng)，每個(gè)濃度重復(fù)6次，記錄空白生物基質(zhì)峰面積A₁和水作為基質(zhì)的峰面積A₂，基質(zhì)效應(yīng)=A₁/A₂×100%，結(jié)果用±s表示，見(jiàn)表2。內(nèi)標(biāo)多潘立酮在血漿及腦勻漿中的基質(zhì)效應(yīng)分別為（102.2±1.59）%，（83.4±0.520）%；內(nèi)標(biāo)雙氯芬酸鈉在血漿及腦勻漿中的基質(zhì)效應(yīng)分別為（176.4±2.760）%，（100.3±1.930）%。

3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取空白血漿和空白腦勻漿80 μL或180 μL，分別加入不同濃度的TSⅡ_a，SAB，GRg₁對(duì)照品溶液制備低、高濃度的QC樣品，并置于以下4種條件下考察其穩(wěn)定性： ①Q(mào)C 樣品于室溫放置6 h后處理進(jìn)樣，結(jié)果顯示在血漿及腦勻漿中各藥物的準(zhǔn)確度為-12.5%～6.34%；②將QC樣本反復(fù)凍融3次后處理進(jìn)樣，結(jié)果顯示各藥物的準(zhǔn)確度為-5.80%～13.9%；③將QC樣品按2.2項(xiàng)下方法處理后，置于4 ℃放置24 h后進(jìn)樣，結(jié)果顯示各藥物的準(zhǔn)確度為-12.5%～8.23%；④QC樣本置于-20 ℃下儲(chǔ)存2周后，處理進(jìn)樣，各藥物的準(zhǔn)確度為-7.72%～8.65%。每個(gè)濃度點(diǎn)平行制備3份。結(jié)果表明血漿樣本和腦勻漿樣本在上述的4種處理?xiàng)l件下均穩(wěn)定。

3.7 稀釋方法學(xué)試驗(yàn)

配制高于定量上限的TSⅡ_a，SAB，GRg₁大鼠血漿樣本，分別測(cè)定稀釋8倍、3倍、8倍后的樣品，用實(shí)測(cè)值乘以稀釋倍數(shù)后，計(jì)算濃度是否為標(biāo)示值的85%～115%。結(jié)果顯示TSⅡ_a稀釋8倍、SAB稀釋3倍、GRg₁稀釋8倍不會(huì)影響測(cè)定的準(zhǔn)確度。

3.8 血漿及腦組織藥動(dòng)學(xué)研究

所取血漿樣本和腦勻漿樣本分別按2.2項(xiàng)下方法處理，按2.3.1項(xiàng)下條件測(cè)定，記錄各檢測(cè)成分和內(nèi)標(biāo)的峰面積，代入回歸方程，計(jì)算大鼠給藥不同時(shí)相TSⅡ_a，SAB，GRg₁的血藥濃度和腦組織濃度。所得數(shù)據(jù)用Phoenix WinNolin 6.1藥動(dòng)學(xué)程序軟件進(jìn)行非房室模型擬合，采用統(tǒng)計(jì)矩法計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。各被測(cè)成分平均血藥濃度-時(shí)間曲線(xiàn)、平均腦組織藥物濃度-時(shí)間曲線(xiàn)見(jiàn)圖2，主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表3。

4 討論

4.1 檢測(cè)方法的確定

由于TSⅡ_a，SAB，GRg₁的極性、色譜行為等差別很大，SAB結(jié)構(gòu)中有7個(gè)酚羥基和2個(gè)羧基，流動(dòng)相的pH直接影響到峰形及響應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)考察了不同流動(dòng)相體系、流動(dòng)相pH調(diào)節(jié)劑及色譜柱種類(lèi)對(duì)三者保留時(shí)間、峰形、響應(yīng)的影響，以同時(shí)達(dá)到峰形對(duì)稱(chēng)、分析時(shí)間短、響應(yīng)高的目的。本研究發(fā)現(xiàn)以乙腈（0.1%甲酸）-0.25%甲酸水為流動(dòng)相，在A(yíng)CQUITY UPLCTM BEH 苯基柱上分析時(shí)間較短（7 min），響應(yīng)較高和峰形對(duì)稱(chēng)。

本實(shí)驗(yàn)嘗試使用正負(fù)離子同時(shí)檢測(cè)以及正負(fù)離子模式分時(shí)間段檢測(cè)TSⅡ_a，SAB，GRg₁，但效果不理想，即降低了3種被測(cè)物質(zhì)的響應(yīng)，其中以SAB最為明顯，達(dá)不到本研究的測(cè)定要求，故只能2種模式分開(kāi)測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)在優(yōu)選各被測(cè)物質(zhì)及內(nèi)標(biāo)的離子對(duì)時(shí)，發(fā)現(xiàn)TSⅡ_a的離子對(duì)m/z 295/277.1比m/z 295/249.30響應(yīng)更高，但是離子對(duì)m/z 295/277.1在空白血漿中干擾很大，且選擇離子對(duì)m/z 295/249.30仍能滿(mǎn)足本實(shí)驗(yàn)定量下限的測(cè)定要求，故選擇離子對(duì)m/z 295/249.30對(duì)TSⅡ_a進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)，本研究在內(nèi)標(biāo)化合物選取上也進(jìn)行了大量的摸索，先后試用了地西泮、多潘立酮、泮托拉唑作為正離子模式內(nèi)標(biāo)，以其穩(wěn)定性、色譜行為、質(zhì)譜響應(yīng)及回收率為指標(biāo)，綜合評(píng)價(jià)后確定以多潘立酮作為檢測(cè)TSⅡ_a和GRg₁的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)；在選擇內(nèi)標(biāo)物時(shí)，本研究曾嘗試文獻(xiàn)[8]中使用過(guò)的氯霉素作為負(fù)離子模式下的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，但由于空白血漿中干擾很大，所以選擇峰型對(duì)稱(chēng)、穩(wěn)定，與SAB有相似萃取行為的雙氯芬酸鈉作為內(nèi)標(biāo)。

4.2 提取方法的確定

本實(shí)驗(yàn)曾嘗試使用沉淀法一步進(jìn)行樣品前處理，該法雖簡(jiǎn)單但同時(shí)也稀釋了待測(cè)樣品，導(dǎo)致待測(cè)物質(zhì)SAB定量下限不能滿(mǎn)足本實(shí)驗(yàn)的測(cè)定要求，因此改用液-液萃取法對(duì)SAB進(jìn)行提取。本研究考察了不同提取溶劑，酸化試劑種類(lèi)、濃度、體積對(duì)SAB提取率的影響，發(fā)現(xiàn)不同的提取溶劑對(duì)SAB的提取率影響較大，乙醚、二氯甲烷、乙酸乙酯-乙醚等有機(jī)溶劑提取回收率均低于乙酸乙酯，酸化試劑的種類(lèi)、濃度及體積對(duì)SAB提取回收率影響較大，10%三氯乙酸、10%HCl溶液及其他體積1 mol· mL^-1HCl 溶液對(duì)SAB的提取率均低于1 mol· mL^-1HCl 溶液。同時(shí)也考察了1.5，2，3 mL乙酸乙酯對(duì)SAB萃取率的影響，2 mL與3 mL并無(wú)明顯區(qū)別，均比1.5 mL 乙酸乙酯提取效率高，所以本實(shí)驗(yàn)樣品處理時(shí)先用80 μL 1 mol· mL^-1鹽酸酸化血漿樣品，然后用2 mL乙酸乙酯直接提取血漿樣品，SAB的提取回收率可達(dá)70%以上。本實(shí)驗(yàn)與文獻(xiàn)[10-11]比較，極大地減少了有機(jī)溶劑乙酸乙酯的使用，得到了較好的提取回收率。

4.3 血漿及腦組織藥動(dòng)學(xué)結(jié)果分析

從圖2中可知，給藥后15 min，大鼠血漿及腦組織中均能測(cè)到TSⅡ_a，SAB，GRg₁，說(shuō)明三者吸收速率和腦分布速率都很快，對(duì)腦缺血或腦缺血再灌注損傷等急性腦部疾病能起到速效的作用。TSⅡ_a和GRg₁在給藥后10 h仍能在大鼠血漿及腦組織中檢測(cè)到，但SAB于給藥后8，1.5 h，分別在血漿及腦組織中清除完全。從表3中可知，TSⅡ_a在血漿中的AUC0-t均大于SAB 和GRg₁，而TSⅡ_a的給藥劑量（60 mg·kg^-1）均小于SAB（300 mg·kg^-1）和GRg₁（150 mg·kg^-1），提示TSⅡ_a的口服吸收較SAB，GRg₁更充分，可能是由于SAB與GRg₁為親水物質(zhì)，很難透過(guò)小腸壁的脂質(zhì)雙分子層而造成口服生物利用度低下。從表3中可知，GRg₁的腦選擇性指數(shù)（0.43±0.24）高于TSⅡ_a和SAB（分別為0.001 8±0.002 1，0.031±0.013），可能是由于GRg₁與血紅蛋白結(jié)合率較低，使其較易透過(guò)血腦屏障。有研究表明，單獨(dú)靜注單體SAB，口服丹參或者靜注SAB，TSⅡ_a與三七總皂苷提取物后，腦內(nèi)無(wú)法檢測(cè)到SAB^{[8，12-13]}，而本研究于給藥后15，30，60，90 min內(nèi)均檢測(cè)到SAB，可能是本研究用UPLC-MS/MS檢測(cè)SAB有更低的檢出限和更高的靈敏度，或者復(fù)方丹參方中復(fù)雜的成分以及芳香藥冰片有開(kāi)放血腦屏障的作用所致，同時(shí)也提示中醫(yī)藥復(fù)方配伍對(duì)方中有效成分藥代動(dòng)力學(xué)行為有顯著影響，這也是中醫(yī)藥復(fù)方配伍優(yōu)勢(shì)所在，但仍需進(jìn)一步研究考證。

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[責(zé)任編輯 曹陽(yáng)陽(yáng)]