基于UPLC—Q—TOF—MS技術(shù)的芩百清肺濃縮丸血清藥物化學(xué)初步研究

劉燁+魏文峰+霍金海+王偉明

[摘要]應(yīng)用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)和血清藥物化學(xué)理論分析檢測芩百清肺濃縮丸的入血成分。灌胃給予大鼠芩百清肺濃縮丸溶液后，肝門靜脈采血，血清經(jīng)SPE處理，采用ACQUITY UPLC BEH C₁₈色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），0.1%甲酸水（A） -0.1%甲酸乙腈（B）流動相系統(tǒng)進行梯度洗脫，流速0.3 mL·min^-1，柱溫35 ℃。通過對比分析體外樣品、空白血清及含藥血清，同時結(jié)合Peakview和Metabolitepilot軟件鑒定和表征其血中移行成分，在給藥后的大鼠血清中分析鑒定了28個血中移行成分，其中18個原型成分，10個代謝產(chǎn)物。應(yīng)用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)和血清藥物化學(xué)理論較為全面地闡明了芩百清肺濃縮丸在大鼠血清中的移行成分，為進一步研究其體內(nèi)代謝過程以及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了科學(xué)依據(jù)。

[關(guān)鍵詞]芩百清肺濃縮丸； 血清藥物化學(xué)； 血中移行成分； UPLC-Q-TOF-MS

[Abstract]To analyze the main components of Qinbai Qingfei concentrated pellets in rat serum with UPLC-Q-TOF-MS technology and serum pharmacochemistry theory. After gavage administration with Qinbai Qingfei concentrated pellets， blood was collected from hepatic portal vein. ACQUITY UPLC BEH C₁₈（2.1 mm×100 mm， 1.7 μm） was used， with 0.1% formic acid agueous solution（A）-0.1%formic acid and acetonitrile（B） as the mobile phase for gradient elution. The flow rate was 0.3 mL·min^-1， the column temperature was maintained at 35 ℃. Through the comparative analysis fingerprints of Qinbai Qingfei concentrated pellets， drug containing-serum and blank serum， and with the help Peakview and Metabolitepilot software， components in serum were defined. A total of 28 compounds were identified， including 18 prototypes and 10 metabolites. As a result， UPLC-Q-TOF-MS technology and serum pharmacochemistry theory were applied to comprehensively expound Qinbai Qingfei concentrated pellets′constituents migrating to rat serum， and provide scientific basis for further studies for in vivo metabolic process and effective material base.

[Key words]Qinbai Qingfei concentrated pellets； serum pharmacochemistry； constituents migrating to serum； UPLC-Q-TOF-MS

中藥血清藥物化學(xué)是以傳統(tǒng)藥物化學(xué)方法為基礎(chǔ)，綜合應(yīng)用多種現(xiàn)代技術(shù)，分析鑒定口服中藥后血清中移行成分，研究其與藥效相關(guān)性，確定中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的應(yīng)用學(xué)科^[1]。此方法自提出以來已經(jīng)被成功應(yīng)用于多種中藥以及中藥復(fù)方的研究^[2-3]，研究結(jié)果不僅揭示中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，而且為解析方劑配伍規(guī)律、闡釋中藥藥理學(xué)特性及創(chuàng)新藥物設(shè)計等中醫(yī)藥關(guān)鍵科學(xué)問題提供了科學(xué)有效的方法。

芩百清肺濃縮丸（以下簡稱芩百，發(fā)明專利證書號ZL03102049.6），是國家食品藥品監(jiān)督管理總局批準的第一個用于臨床觀察治療小兒支原體肺炎的中藥制劑，由黃芩、百部、紫菀、桔梗、麥冬、地龍6味中藥組成，具有清熱解毒、降氣平喘、潤肺止咳之功效，適用于兒童支原體肺炎的治療。前期實驗表明，其能提高免疫功能和促進氣道上皮細胞的修復(fù)，能有效減輕支原體對肺部組織的炎性病變，促進上皮細胞的恢復(fù)^[4-6]。然而芩百的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚未完全闡明，本文利用血清藥物化學(xué)方法以及UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)進一步研究芩百的血中移行成分，旨在揭示其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料

Waters ACQUITYTM UPLC液相色譜儀（Waters，USA）；AB Sciex 5600+型質(zhì)譜儀（Sciex，USA）；Analyst TF 1.6工作站（Sciex，USA）；PeakView 2.0軟件（Sciex，USA）；Metabolitepilot 1.5 軟件（Sciex，USA）；IKA MS3 digital渦旋振蕩器（廣州儀科實驗室技術(shù)有限公司，中國）；MTN-2800W氮吹濃縮裝置（天津奧特賽恩斯儀器有限公司，中國）；RAININ E4 XLS自動單道移液器[規(guī)格：0.1～1 mL，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司，中國]；SBP100-200手動單道移液器[規(guī)格：20～200 μL，賽比奧科技（廣州）有限公司，中國]； AccuBOND ODS-C₁₈固相萃取小柱（規(guī)格100 g· L^-1，Agilent，USA）。

芩百清肺濃縮丸（黑龍江中醫(yī)藥科學(xué)院制劑室提供，批號20150401，規(guī)格3 g/袋）；黃芩（Scutellariae Radix，批號20141201，產(chǎn)地內(nèi)蒙古）；蜜百部（Stemonae Radix，批號20141101，產(chǎn)地東北）；蜜紫菀（Asteris Radix et Rhizoma，批號20141201，產(chǎn)地河北）；桔梗（Platycodonis Radix，批號20141201，產(chǎn)地河北）；麥冬（Ophiopogonis Radix，批號20141201，產(chǎn)地四川）；地龍（Pheretima，批號20141201，產(chǎn)地河北），所有飲片購自北京同仁堂哈爾濱藥店，各藥材均由黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院王偉明研究員鑒定為正品。甲醇和乙腈（色譜級，Merck公司）；甲酸（色譜級，F(xiàn)isher公司）；蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）。

健康SD雄性大鼠，體重（300±20） g，SPF級，許可證號SCXK（京）2012-0001，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。

2 方法

2.1 芩百水煎液以及凍干粉制備

取單味藥適量，按芩百清肺濃縮丸制備工藝提取，制成凍干粉。

2.2 供試品溶液制備

取芩百清肺濃縮丸凍干粉末1 g（過40目篩），精密稱定，加入30 mL 75%甲醇，超聲30 min，13 000 r·min^-1離心10 min，取上清液，即得。

2.3 體內(nèi)分析樣品的制備

取SD大鼠，禁食12 h（自由飲水），給藥組按照23.085 g·kg^-1灌胃給予芩百凍干粉灌胃液，空白組按照20 mL·kg^-1灌胃給予蒸餾水。給藥1 h后，腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉，肝門靜脈取血，3 000 r·min^-1離心10 min，取上清液，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

取大鼠空白血清及給藥血清各400 μL，各加10 μL磷酸，渦旋震蕩60 s，分別上樣到預(yù)先以2 mL甲醇、2 mL水活化平衡的SPE柱上，以2 mL水淋洗，淋洗液棄去，再以2 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，氮氣吹干，殘渣用200 μL甲醇復(fù)溶，渦旋震蕩60 s后，4 ℃，13 000 r·min^-1離心10 min，取上清液，進樣2 μL供UPLC-Q-TOF-MS分析。

2.4 分析條件

2.4.1 質(zhì)譜條件 離子化模式為電噴霧正、負離子模式，正負離子源電壓分別為5 500，-4 500 V，離子源溫度為550 ℃，霧化氣體為N₂，霧化氣（Gas1）為55 psi（1 psi=6.895 kPa），輔助氣（Gas2）為55 psi，氣簾氣（curtain gas）為35 psi，裂解電壓（DP）分別為80，-80 V，碰撞能量（CE）分別為35，-35 eV，碰撞能量擴展（CES）均為15 eV。TOF-MS掃描范圍為100～1 500，IDA設(shè)置響應(yīng)值超過100 cps的8個最高峰進行二級質(zhì)譜掃描，Product Ion掃描范圍為50～1 500，開啟動態(tài)背景扣除（DBS）。數(shù)據(jù)采集所用軟件為Analyst TF 1.6 software，數(shù)據(jù)處理軟件為Peakview 2.0/Masterview 1.0 software。

2.4.2 色譜條件 Waters ACQUITYTM UPLC液相色譜儀；ACQUITYTM BEH C₁₈色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；預(yù)柱ACQUITYTM UPLC BEH C₁₈保護柱（2.1 mm×5 mm，1.7 μm）；柱溫35 ℃；流動相0.1%甲酸水（A）-0.1%甲酸乙腈（B），梯度洗脫，0～4 min，95%～73%A，4～5 min，73%A，5～10 min，73%～50%A，10～13 min，50%～30% A，13～14 min，30%A，14～20 min，30%～0%A，流速0.3 mL·min^-1；樣品倉溫度4 ℃；進樣量2 μL；色譜儀流出液不分流直接進行正負離子掃描檢測。

2.5 數(shù)據(jù)分析方法

利用Peakview軟件通過對比給藥后血清和空白血清的質(zhì)譜圖，扣除血清中的內(nèi)源性成分，將剩余離子峰與體外藥材提取液離子峰的保留時間，質(zhì)荷比及二級質(zhì)譜圖進行對比，如果一致則確認為芩百清肺濃縮丸中的原型成分；利用MetabolitePilot數(shù)據(jù)處理軟件，將空白血清及給藥血清樣品導(dǎo)入，建立Compound library，設(shè)置Biotransformation parameters，選擇Ⅰ和Ⅱ相代謝途徑，根據(jù)軟件數(shù)據(jù)結(jié)果和參考文獻資料推測其代謝產(chǎn)物。

3 結(jié)果

3.1 UPLC-Q-TOF-MS色譜圖的采集

根據(jù)建立的芩百血中移行成分分析方法，在正、負離子模式下采集以上樣品的色譜圖，見圖1。

3.2 血中移行成分鑒定

本課題組前期已經(jīng)應(yīng)用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)對芩百的化學(xué)成分進行了分析，在分析過程中根據(jù)精確相對分子質(zhì)量、同位素豐度比、分子碎片峰，參考相關(guān)文獻、對照品色譜保留時間及二級譜圖，共推斷了78個化合物，其中14個來自黃芩，29個來自百部，10個來自麥冬，13個來自紫菀，3個來自桔梗，9個來自地龍^[7]。本試驗在此基礎(chǔ)上根據(jù)2.5項下方法，結(jié)合以往文獻報道^[8-14]，鑒定了大鼠口服芩百后的28個血中移行成分，其中18個為原型成分，10個為代謝產(chǎn)物，并對其來源進行了歸屬，結(jié)果見表1。

3.3 主要色譜峰的質(zhì)譜分析

3.3.1 原型成分 試驗共鑒定和表征出18個原型成分，分別以化合物3，13為例說明推測過程?；衔?：正離子模式下，其在含藥血清總離子圖與芩百樣品總離子流圖中金剛大堿的保留時間基本一致^[7]，二級質(zhì)譜碎片一致，準分子離子峰m/z 322[M+H]⁺相對豐度較強，擁有共同二級碎片m/z 248，230，174等，故推測其結(jié)構(gòu)為金剛大堿，二級質(zhì)譜圖見圖2，可能的裂解途徑見圖3。

化合物13：正離子模式下，其與芩百樣品總離子流圖中亞油酸的保留時間基本一致，二級質(zhì)譜碎片一致，準分子離子峰m/z 281[M+H]⁺相對豐度較弱，擁有共同二級碎片m/z 263，245，133等，故推測其結(jié)構(gòu)為亞油酸，二級質(zhì)譜圖見圖4，可能的裂解途徑見圖5。

3.3.2 代謝產(chǎn)物 根據(jù)2.5項下方法結(jié)合MetabolitePilot代謝物數(shù)據(jù)處理軟件給出的代謝物最優(yōu)化峰匹配，最終推測10個代謝產(chǎn)物，以黃芩苷甲基化產(chǎn)物和甲基麥冬黃烷酮B氧化產(chǎn)物為例說明鑒定過程。

黃芩中黃芩苷的代謝較為簡單^[15]，其7位上葡萄糖醛酸基可脫去，也可重新結(jié)合至6位或7位，因此在體內(nèi)代謝時間較長，另外 B環(huán)的苯環(huán)性質(zhì)也比較活潑，可發(fā)生甲基化、羥基化等Ⅰ相反應(yīng)。代謝物正離子模式下，準分子離子峰m/z 461[M+H]⁺，比黃芩苷準分子離子峰m/z 447[M+H]⁺多14，提示增加1個CH₂，發(fā)生甲基化，結(jié)合其特征碎片m/z 385，270，與黃芩苷二級碎片比較，符合其甲基化過程，結(jié)合文獻報道黃芩苷甲基化產(chǎn)物代謝位點可能在B環(huán)的4號位。代謝產(chǎn)物匹配度見圖6，可能的裂解途徑見圖7。

麥冬中的高異黃酮是黃酮中特殊的一類，其母體結(jié)構(gòu)僅比異黃酮多1個碳原子。但是其裂解方式與黃酮有明顯區(qū)別。麥冬中黃酮類化合物B環(huán)變化產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物較多^[16-17]，尤其是B環(huán)有羥基取代的化合物，代謝位點多發(fā)生在B環(huán)上。

代謝物在負離子模式下，準分子離子峰m/z 343[M-H]-，比甲基麥冬黃烷酮B準分子離子峰m/z 327 [M-H]-多16，提示增加1個O，發(fā)生氧化反應(yīng)，結(jié)合碎片m/z 175，167，152，137等，與甲基麥冬黃烷酮B二級碎片比較，符合其氧化過程，結(jié)合文獻報道甲基麥冬黃烷酮B氧化產(chǎn)物代謝位點可能在B環(huán)的3號位。代謝產(chǎn)物匹配度見圖8，可能的裂解途徑見圖9。

4 討論

試驗中在灌胃給予大鼠芩百后，分別在15，30 min，1，2，4，8 h于肝門靜脈采血。通過對含藥血清色譜圖峰強度、峰數(shù)目及共有入血成分的峰含量對比分析，確定給藥后1 h為最佳采血時間點。血清處理時考察了有機溶劑沉淀（甲醇，乙腈）以及固相萃?。⊿PE）等多種方法，結(jié)果有機溶劑沉淀后樣品色譜圖的背景較高，而SPE方法處理后的色譜圖背景較低，故選用SPE方法處理。試驗中血清處理時還考察了是否加磷酸，結(jié)果表明血清處理加入10 μL磷酸后，所得到的移行成分更多，且響應(yīng)值有明顯提高。

本試驗并沒有檢測到來自桔梗的入血成分，可能是由于目前文獻中報道的桔梗成分大多數(shù)為皂苷類成分，其結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，易發(fā)生源內(nèi)裂解，測定該類化合物時需要的DP及CE較其他類成分低，為了檢測到其他大部分化合物，DP設(shè)為80，-80 V，CE設(shè)為35，-35 eV，CES設(shè)為15 eV。推測這可能是桔梗類成分檢測不到的重要因素，尚需開展針對桔梗類成分的深入研究。

在大鼠灌胃芩百溶液后的含藥血清中共鑒定出18個原型成分，其中來自百部的多為生物堿類成分，生物堿具有鎮(zhèn)咳平喘的作用，能延長小鼠濃氨水引咳的潛伏期，減少咳嗽次數(shù)，增加大鼠毛細管排痰量，尤其是葉百部堿，它對豚鼠腹腔給藥枸櫞酸后引起的咳嗽具有劑量依賴性抑制作用^[18]。黃芩的主要成分是黃酮及其苷類，其具有解熱抗炎，抗微生物的藥理作用。其中黃芩苷和黃芩素能夠通過干擾花生四烯酸的代謝通路、抑制細胞因子的活性等產(chǎn)生解熱抗炎作用^[19]。黃芩苷更是有直接誘殺支原體的作用，其對支原體的MIC為0.97～3.90 g·L^-1[20]。地龍有止咳平喘的作用，研究表明，地龍能顯著減弱哮喘小鼠炎性反應(yīng)，尤其能抑制嗜酸性粒細胞的增加和浸潤，并可抑制或逆轉(zhuǎn)膠原蛋白沉積以及氣道黏液的高分泌，從而減緩或抑制哮喘氣道重組的進程，并可改善哮喘小鼠的生活質(zhì)量及生存狀態(tài)，達到治療哮喘的目的^[21]。而不飽和脂肪酸類成分等更是具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，增強免疫功能的作用。結(jié)合各味藥藥理活性相關(guān)報道和傳統(tǒng)功效，初步推斷入血的28種成分可能為其體內(nèi)發(fā)揮作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，有待進一步研究。

本試驗應(yīng)用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)通過比較分析芩百體外提取液與扣除空白血清內(nèi)源性成分后的含藥血清，初步推測出28個入血成分，包括18個原型成分，10個代謝產(chǎn)物。結(jié)果表明該方法簡便、準確，為芩百藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的進一步研究奠定了基礎(chǔ)。

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[責(zé)任編輯 曹陽陽]