藏藥波棱瓜子總木脂素對四氯化碳致大鼠肝纖維化的保護作用及機制探討

劉偉+符小紅+黃思遠+石晏丞+石林琳+顧健

[摘要]該實驗探討藏藥波棱瓜子總木脂素對四氯化碳（CCl4）致大鼠肝纖維化的保護作用及其作用機制。將SD大鼠48只隨機分為空白對照組、模型組、總木脂素低、中、高劑量（100，200，400 mg·kg^-1）組、陽性藥甘利欣（25 mg·kg^-1）組，每組8只。空白組正常飼養(yǎng)，模型組、總木脂素低、中、高劑量組以及甘利欣組大鼠均隔2～3 d皮下注射3 mL·kg^-1含40%CCl4的橄欖油溶液連續(xù)造模8周。期間空白組、模型組灌胃等量生理鹽水2 mL，總木脂素低、中、高劑量組、甘利欣組灌胃給藥相應(yīng)劑量。8周后最后一次造模6 d后處死大鼠。生化分析法測定各組大鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）含量。ELISA法檢測血清肝纖維化指標轉(zhuǎn)化生長因子-β₁（TGF-β₁）、透明質(zhì)酸（HA）、羥脯氨酸（HYP）、超氧化物歧化酶（SOD）的水平，肝組織進行HE和Masson膠原染色，進行病理分析并評分。結(jié)果顯示與模型組大鼠比較，總木脂素組大鼠血清中ALT，AST，ALP，TGF-β₁，HA和HYP水平顯著降低（P<0.05，P<0.01），肝臟組織勻漿液中SOD濃度水平明顯升高（P<0.05，P<0.01），肝臟病理損傷明顯減輕（P<0.05，P<0.01），肝纖維化評分明顯降低（P<0.05，P<0.01）。通過以上實驗說明波棱瓜子總木脂素能有效減輕CCl4致大鼠肝纖維化的肝臟損傷，降低肝纖維化程度，其機制可能與其保肝降酶抑制TGF-β₁表達有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]總木脂素； 肝纖維化； TGF-β₁

[Abstract]This experiment was aimed to discuss the protective effect and mechanism of total lignans from Tibetan medicinal Herpetospermum seeds on carbon tetrachloride （CCl4）-induced liver fibrosis in rats. Forty-eight male Sprague-Dawley rats were randomly divided into the blank control group （G1）， model group （G2）， total lignans high， middle and low dose groups （400，200， and 100 mg·kg^-1·d^-1）（G3/4/5） and the glycyrrhizin positive control group （25 mg·kg^-1·d^-1）（G6）， N=8 in each group. The rats in blank group received normal feeding； the rats in model group， total lignans low， middle and high dose groups and glycyrrhizic group were subcutaneously in jected with 3 mL·kg^-1 olive oilsolution containing 40%CCl4every two or three days for Eight weeks. During the course， the rats inblank group and model group were orally administered with 2 mL normal saline， and the rats in total lignans groups and the glycyrrhizin positive control group received corresponding doses of drugs by intragastric administration. Eight weeks later， after the the last time modeling， the rats were sacrificed. Then the biochemical analysis was used to determine alanine aminotransferase（ALT）， aspartate aminotransferase（AST）， and alkaline phosphatase （ALP） levels in serum while enzyme-linked immuno sorbent assay（ELISA） was applied for detecting transforming growth factor β₁（TGF-β₁）， hyaluronic acid（HA）， hydroxy-proline（HYP） and superoxide dismutase（SOD） levels in serum. HE and Masson's trichrome stainings were conducted in liver tissues to observe the pathological variations and grades of hepatic fibrosis. The results showed that as compared with the model group， the levels of ALT， AST， ALP， TGF-β₁， HA， HYP and SOD in serum of total lignans groups were significantly decreased （P<0.05， P<0.01）； levels of SOD in the liver tissue homogenate were increased（P<0.05， P<0.01）； the pathological damage of the liver tissues were relieved （P<0.05， P<0.01）， and liver fibrosis scores were decreased（P<0.05， P<0.01）. The above experimentsindicated that total lignans from Tibetan medicinal Herpetospermum seeds can effectively reduce carbon tetrachloride-induced hepatic injury of rat liver fibrosis， reduce the degree of liver fibrosis， and its mechanism maybe associated with down-regulating TGF-β₁ expression.

[Key words]total lignans； liver fibrosis； TGF-β₁

波棱瓜子是葫蘆科波棱瓜的干燥成熟種子，常用于藏藥方劑中，具有助消化、清熱降火的作用，性寒、味苦，在民間主要用來醫(yī)治消化不良，赤巴病，膽病，肝病（肝熱、黃疸型傳染性肝炎）等^[1]。前期研究過程中，發(fā)現(xiàn)波棱瓜子對治療各類肝病有很好的療效，如抗乙肝病毒，保肝降酶，對免疫性肝損傷有較好活性^[2]。并在前期試驗中確定了其有效部位為總木脂素部位。然而其治療和預(yù)防肝纖維化的研究還未見報道，作用機制尚不明確。故本課題擬建立CCl4致大鼠肝纖維化病理模型，探討波棱瓜子總木脂素對肝纖維化的保護作用及其作用機制，為該藥的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品與試劑 波棱瓜子總木脂素部位（經(jīng)西南民族大學(xué)顧健教授提供，Abcam公司）；轉(zhuǎn)化生長因子-β₁（TGF-β₁，貨號XL-Er0400）、透明質(zhì)酸（HA，貨號XL-Er0451）、羥脯氨酸（HYP，貨號XL-Er1602）、超氧化物歧化酶（SOD，貨號XL-Er1377）ELISA試劑盒，北京永輝生物科技有限公司進口分裝；HE染色試劑；Masson三色膠原試劑。

1.2 動物 SPF級雄性SD大鼠48只，合格證號SCXK（川）2013-24，適應(yīng)環(huán)境1周后開始實驗。

1.3 儀器 TFT185W80PS計算機（冠捷顯示科技有限公司）；Multlskan Mk3酶標儀（賽默飛世爾儀器有限公司）；BA200 Digital數(shù)碼三目攝像顯微攝像系統(tǒng)（麥克奧迪實業(yè)集團有限公司）；Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)（美國Media Cybernetics公司）。

2 方法

2.1 分組及給藥 大鼠稱重后隨機分為空白對照組、模型組、總木脂素低、中、高劑量（100，200，400 mg·kg^-1）組、陽性藥甘利欣（25 mg·kg^-1）組，每組8只。除空白對照組外，其他各組大鼠由皮下注射40%CCl4的橄欖油溶液，首次注射5 mL·kg^-1，而后每隔2～3 d注射3 mL·kg^-1，連續(xù)造模9周^[3-4]。期間每天按時給予空白組、模型組灌胃等量生理鹽水2 mL，總木脂素低、中、高劑量組、甘利欣組灌胃給藥相應(yīng)劑量2 mL。末次給藥后禁食不禁水24 h，大鼠稱體重，腹主動脈取血，離心取上層血清，-20 ℃保存待檢，取新鮮肝臟，稱重，切下一小部分10%福爾馬林浸泡，另一部分制備肝勻漿，-80 ℃保存待檢。

2.2 肝臟指數(shù) 處死大鼠前稱體重，取出肝臟，濾紙拭干后立即稱質(zhì)量，計算肝臟指數(shù)。肝臟指數(shù)=肝臟質(zhì)量（g）/體重（g）×100。

2.3 肝功能 應(yīng)用自動生化儀檢測大鼠血清中肝功能指標丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）的水平。

2.4 ELISA法檢測大鼠血清中肝纖維化指標TGF-β₁，HA，HYP的水平 ELISA法檢測大鼠肝勻漿SOD水平，按ELISA試劑盒說明書操作，酶標儀檢測大鼠血清中TGF-β₁，HA，HYP及肝勻漿SOD水平。

2.5 病理形態(tài)學(xué)觀察 取處理過的大鼠肝組織，HE染色，光鏡下觀察（×100/400）肝組織病理學(xué)改變。

2.6 Masson三色膠原染色 取處理過的大鼠肝組織，Masson染色，先于100倍光鏡下觀察全部組織，再根據(jù)組織大小及表達情況分別選取100倍和400倍采集圖像。對各組大鼠肝纖維化程度進行評分，得分越高，表示纖維化程度越重。

2.7 統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用 SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（One-Way ANOVA），數(shù)據(jù)以±s表示。

3 結(jié)果

3.1 模型成功判定標準及大鼠死亡情況 造模第9周末，各組隨機處死大鼠2只。模型組大鼠體重較輕，肝臟色澤暗黃、表面粗糙、體積未見明顯改變、邊緣較鈍、質(zhì)地較實、有結(jié)節(jié)感；血清ALT，AST，ALP水平均明顯升高；病理組織學(xué)觀察可見肝纖維化，Masson三色膠原染色可見明顯的纖維結(jié)締組織，證實肝纖維化造模成功。隨即處死所有大鼠。實驗期間大鼠死亡2只，第4周，第5周模型組和總木脂素低劑量組在造模后的第2天各死亡1只。

3.2 對大鼠一般狀態(tài)和肝臟系數(shù)的影響 對照組大鼠發(fā)育良好，無死亡。模型組大鼠精神萎靡、毛色無光澤、活動較少、厭食、發(fā)育緩慢、體重減輕?？偰局刂?、高劑量組大鼠體重增加，每次造模的第3天活動較為正常，另甘利欣組大鼠體重明顯低于總木脂素組，并出現(xiàn)了脫毛現(xiàn)象。與對照組比較，模型組大鼠肝臟指數(shù)顯著增加（P<0.001），與模型組比較，總木脂素各組大鼠肝臟指數(shù)顯著降低（P<0.05），見表1。

3.3 對肝纖維化大鼠肝功能指標的影響 與對照組比較，模型組大鼠血清中ALT，AST，ALP水平顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，總木脂素低、中、高、甘利欣各劑量組大鼠血清中ALT，AST，ALP水平顯著降低（P<0.05，P<0.01），其中總木脂素中、高劑量組與甘利欣組組間無顯著差異，見表2。

3.4 對肝纖維化大鼠血清中肝纖維化指標的影響 與對照組比較，模型組大鼠血清中TGF-β1，HA，HYP的水平明顯升高（P<0.01）。與模型組比較，總木脂素低、中、高、甘利欣各劑量組上述指標顯著下降（P<0.05，P<0.01）。其中總木脂素中、高劑量組與甘利欣組組間無顯著差異，見表3。

3.5 對纖維化大鼠肝勻漿SOD水平的影響 與對照組比較，模型組大鼠肝勻漿SOD水平明顯降低（P<0.01）。與模型組比較，總木脂素低、中、高、甘利欣各劑量組上述指標顯著上升（P<0.05，P<0.01）。其中總木脂素中、高劑量組與甘利欣組組間無顯著差異，見表4。

3.6 各組大鼠肝組織病理學(xué)觀察 HE染色可見，對照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝索排列整齊，肝細胞無變性壞死和淋巴細胞浸潤，未見纖維沉積。模型組大鼠匯管區(qū)纖維結(jié)締組織大量增生，肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，肝索排列紊亂，肝細胞壞死明顯，有大量淋巴細胞浸潤，部分可見假小葉形成?？偰局刂?、高劑量組大鼠肝臟匯管區(qū)有少量纖維組織增生，肝細胞變性壞死明顯減輕，少量淋巴細胞浸潤，未見假小葉形成；總木脂素低劑量組大鼠匯管區(qū)纖維結(jié)締組織增生較明顯，個別小葉結(jié)構(gòu)被破壞，少部分出現(xiàn)假小葉，肝損傷程度介于模型組和總木脂素中、高劑量組之間。高劑量肝損傷程度較輕于甘利欣組，見圖1。

Masson三色膠原染色顯示，對照組大鼠肝臟匯管區(qū)有極少量膠原纖維存在，肝小葉間未見纖維組織增生，無假小葉形成。模型組大鼠肝臟匯管區(qū)大量膠原纖維增生，增生的膠原纖維形成纖維分隔，并破壞肝小葉結(jié)構(gòu)，分割、包繞肝小葉，假小葉形成明顯。總木脂素中、高劑量組大鼠肝臟膠原纖維明顯減少，只見匯管區(qū)有一定的纖維組織增生，少部分亦見膠原向周邊延伸，無假小葉存在；其低劑量組大鼠肝組織纖維結(jié)締組織增生較明顯，個別小葉結(jié)構(gòu)被破壞，未出現(xiàn)假小葉，肝損傷程度介于模型組和總木脂素中、高劑量組之間。纖維化程度評分見表5；結(jié)果見圖2。

4 討論

肝纖維化（hepatic fibrosis，HF）是肝臟對各種原因所致肝損傷的創(chuàng)傷愈合反應(yīng)，是各種慢性肝病共有的病理過程。肝纖維化的發(fā)生以細胞外基質(zhì)（ex-tracellular matrix，ECM）的合成與降解的失衡后，ECM過度沉積為病理特征。ECM主要來源于肝星形細胞（hepatic stellate cells，HSC），并由涉及HSC的激活與分化調(diào)控機制最終形成ECM過度沉積，導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生^[6-8]。

本實驗通過組織病理學(xué)和血液生化實驗發(fā)現(xiàn)，波棱瓜子總木脂素對CCl4致肝纖維化大鼠肝臟在具有明顯的組織形態(tài)保護作用的同時，能夠明顯降低肝纖維化大鼠血清中AST，ALT和ALP的水平。結(jié)果說明，波棱瓜子總木脂素對CCl4致肝纖維化大鼠的肝組織及肝功能損傷具有明顯的保護作用。

HA是一種糖胺多糖，是細胞體基質(zhì)的主要組成成分，主要由肝內(nèi)皮細胞攝取分解。肝細胞持續(xù)受損時，HA合成增加。而肝竇內(nèi)皮細胞受損，數(shù)量減少的同時使分解HA的能力減弱，導(dǎo)致釋放入血清中的HA含量增加。血清HA升高能反映活動性肝纖維化程度，是反映肝纖維化最具價值的臨床診斷血清學(xué)標志物^[9-11]。人體HYP占膠原蛋白比例最大，膠原蛋白是組織中膠原纖維的主要成分，膠原纖維廣泛分布于人體各個組織。因此，膠原蛋白占人體蛋白質(zhì)很大比例。根據(jù)HYP在膠原蛋白中含量最高這一屬性，通過對肝組織中HYP的測定，可以了解肝臟中膠原蛋白的代謝情況，也可間接反映肝纖維化的程度和發(fā)展過程^[10-11]。通過本試驗發(fā)現(xiàn)波棱瓜子總木脂素可以明顯降低造模后HA，HYP含量。結(jié)果表明，波棱瓜子總木脂素是通過降低血清中HA，HYP含量來達到對CCl4致肝纖維化大鼠的肝組織及肝功能的保護作用。

TGF-β₁是重要的肝纖維化調(diào)節(jié)因子。當肝組織受到各種損傷因素攻擊時，HSC受Kupffer氏細胞分泌的TGF-β₁激活分泌大量ECM的同時，又進一步分泌大量的TGF-β₁，激活周圍靜止更多的HSC。這種正反饋作用是TGF-β₁加強HSC合成基質(zhì)膠原進而致肝纖維化持續(xù)發(fā)展的原因之一^[12-14]。實驗結(jié)果得出，波棱瓜子總木脂素能夠減少肝纖維化大鼠肝臟膠原蛋白合成的同時，下調(diào)肝組織中TGF-β₁的蛋白的表達。說明波棱瓜子總木脂素對CCl4致肝纖維化大鼠的肝組織及肝功能損傷的保護作用可能與下調(diào)TGF-β₁的蛋白的表達，減少基質(zhì)膠原的合成、沉積有關(guān)。也間接表明，波棱瓜子總木脂素很有可能會參與到誘導(dǎo)肝星狀細胞的凋亡之中。而其參與肝纖維化的細胞內(nèi)信號通路的影響，則有待于進一步的研究。此外在實驗中發(fā)現(xiàn)，其下調(diào)TGF-β₁的蛋白的表達能力要強于陽性藥甘利欣。

目前，就肝纖維化形成機制的研究已初步完成，尚有很多影響纖維化形成的原因尚不明確。在本實驗中，已初步證明波棱瓜子總木脂素對CCl4致肝纖維化大鼠的肝組織及肝功能損傷具有明顯的保護作用。在后續(xù)工作中，會繼續(xù)研究其對肝星狀細胞的凋亡影響，以及在治療肝纖維化的藥效和機制上做進一步的深入研究，為臨床用藥提供強有力的證據(jù)。

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[責任編輯 張寧寧]