HIV-1 CN54 Pol P51抗原高效表達(dá)、純化、復(fù)性及在抗體檢測(cè)中的應(yīng)用

侯爵，孫靜，徐智勇，范文玲，張怡軒，劉勇，郝彥玲

1 沈陽(yáng)藥科大學(xué) 生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，沈陽(yáng) 110016 2 中國(guó)疾病預(yù)防控制中心 性病艾滋病預(yù)防控制中心 傳染病防治國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050

HIV-1 CN54 Pol P51抗原高效表達(dá)、純化、復(fù)性及在抗體檢測(cè)中的應(yīng)用

侯爵1,2，孫靜2，徐智勇2，范文玲2，張怡軒1，劉勇2，郝彥玲2

1 沈陽(yáng)藥科大學(xué) 生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，沈陽(yáng) 110016 2 中國(guó)疾病預(yù)防控制中心 性病艾滋病預(yù)防控制中心 傳染病防治國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050

為獲得可溶性高純度HIV-1中國(guó)株CN54 Pol P51抗原，將攜帶CN54 pol p51基因的重組質(zhì)粒pTHioHisA51轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 codonplus-RIL，用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。用Chelating Sepharose FF-Ni親和層析柱及DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換層析柱純化目的蛋白，采用透析復(fù)性法得到可溶性抗原，Western blotting檢測(cè)目的蛋白。用純化的P51抗原蛋白標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶及包被酶標(biāo)板進(jìn)行雙抗原夾心法ELISA檢測(cè)。結(jié)果顯示P51以包涵體的形式表達(dá)，表達(dá)量占菌體總蛋白的50%，經(jīng)兩步層析和透析復(fù)性，目的蛋白純度大于95%。Western blotting和雙抗原夾心法ELISA檢測(cè)均顯示了良好的靈敏度和特異性。本研究可以為HIV-1疫苗研究和開(kāi)發(fā)檢測(cè)試劑提供支持。

HIV-1 CN54，逆轉(zhuǎn)錄酶P51，純化，復(fù)性，抗體檢測(cè)

Abstract:To obtain the pure and soluble P51 antigen of HIV-1 strain CN54, we transformed the Escherichia.coli strain BL21 codonplus-RIL with recombinant plasmid pTHioHisA51 which carries a gene encoding the Polymerase(Pol)P51 antigen of HIV-1 CN54 formerly, and induced protein expression by IPTG.We purified the recombinant protein with Chelating Sepharose FF-Ni and DEAE-Sepharose FF column chromatography, then renatured the recombinant protein by dialyzation.Purified protein was identified by Western blotting.We labeled and coated antigen P51 in a dual-antigen sandwich system, and tested it with serum samples from HIV-infected individuals.The results showed that P51 was expressed as inclusion body, and represented about 50% of total cellular protein.After purification and renaturation, the purity of P51 was up to 95%.Western blotting and sandwich ELISA demonstrated that recombinant P51 had good anti-HIV antibody specificity and sensitivity.The results suggested that recombinant HIV-1 P51 can be prepared as diagnostic reagent, and provides valuable support for HIV-1 detection and vaccine research.

Keywords:HIV-1 CN54, reverse transcriptase P51, purification, renaturation, antibody detection

HIV逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)是pol基因編碼的一個(gè)異源二聚體蛋白，由P66和P51兩個(gè)亞單位組成，分子量約為117 kDa。逆轉(zhuǎn)錄酶在HIV生活史中具有逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶H和整合酶活性，發(fā)揮著十分重要的作用。已有研究發(fā)現(xiàn)P66和P51作為抗原與HIV-1陽(yáng)性血清具有很高的結(jié)合活性，P51抗原在進(jìn)行 ELISA和Western blotting測(cè)定時(shí)，陽(yáng)性檢出率與 HIV-1 Gp41相當(dāng)，比HIV-1 Gag高[1-2]。P51是檢測(cè)HIV-1抗體檢測(cè)試劑中最常用的抗原，無(wú)論在初篩試劑還是確認(rèn)試劑都要求有P51抗原的存在。

HIV-1 CN54是我國(guó)科學(xué)家從云南分離的HIV-1 B’/C重組毒株(CRF07-BC)，代表了我國(guó)很多地區(qū)的優(yōu)勢(shì)流行株，也是國(guó)內(nèi)眾多課題組研制的 HIV-1疫苗所針對(duì)的靶毒株。因此，制備高純度的 CN54毒株P(guān)51抗原對(duì)于我國(guó)HIV-1疫苗的免疫原性研究及臨床樣本的檢測(cè)具有非常重要的意義。本研究利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)對(duì) P51全長(zhǎng)蛋白進(jìn)行高效表達(dá)，對(duì)尿素溶解后的包涵體蛋白進(jìn)行復(fù)性，摸索出簡(jiǎn)便、快捷的純化工藝，并對(duì) P51在雙抗原夾心ELISA檢測(cè)中的使用條件進(jìn)行了探討。純化后的CN54 P51重組蛋白為針對(duì)HIV-1中國(guó)流行株的疫苗和診斷試劑研究提供了關(guān)鍵材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒及菌株

表達(dá)HIV-1中國(guó)株CN54 P51抗原全長(zhǎng)基因的質(zhì)粒pTHioHisA51由本課題組構(gòu)建[3]，抗原蛋白 N端采用非融合表達(dá)策略，C端引入6個(gè)組氨酸作為純化標(biāo)簽。大腸桿菌菌株BL21 codonplus-RIL購(gòu)自Stratagene公司。

1.1.2 試劑和培養(yǎng)基

iBlot? Dry Blotting System Western blotting電轉(zhuǎn)系統(tǒng)購(gòu)自 Invitrogen公司。Vivaflow50膜包購(gòu)自Sartorius公司。

異丙基-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)為Merck公司產(chǎn)品。酵母提取物和蛋白胨均為Oxoid公司產(chǎn)品。低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)為天根公司產(chǎn)品。預(yù)染蛋白標(biāo)準(zhǔn)品為 Fermentas公司產(chǎn)品。ELISA試劑盒為金豪公司為本室研發(fā)的HIV臨床檢測(cè)試劑盒。檢測(cè)血清來(lái)自本室臨床樣本。層析填料是GE Healthcare公司產(chǎn)品。BCA試劑盒為PIERCE公司產(chǎn)品。常用化學(xué)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 目的蛋白的表達(dá)及細(xì)胞破碎

將質(zhì)粒 pTHioHisA51轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21 codonplus感受態(tài)細(xì)胞，單菌落接種于5 mL含氨芐青霉素(Amp)的 LB培養(yǎng)基中，過(guò)夜培養(yǎng)后接種于500 mL含Amp的LB培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，37℃振蕩培養(yǎng)3 h后加入0.01%(V/V)IPTG，誘導(dǎo)表達(dá)15 h后取樣，SDS-PAGE分析表達(dá)量。4000×g離心10 min收集菌體，高壓勻漿破碎后13 000×g離心10 min，SDS-PAGE分析目的蛋白表達(dá)量及在上清和沉淀中的分布。

1.2.2 包涵體的溶解

將 37℃下誘導(dǎo)表達(dá)的菌體高壓勻漿破碎，分別用洗滌緩沖液(pH 7.0，20 mmol/L Tris-HCl，50 mmo1/L NaCl，1 mmo1/L EDTA，1% Triton X-100)洗滌2遍。以pH 10.0的8 mol/L 尿素的溶解液懸起，吹打均勻，室溫放置 30 min，13 000×g離心15 min，SDS-PAGE分析目的蛋白的溶解情況。

1.2.3 層析純化

金屬離子螯合層析：將包涵體用上樣緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl，pH 10.0，50 mmol/L NaCl，50 mmol/L 咪唑，8 mol/L 尿素)溶解后，用 0.45 μm濾膜過(guò)濾，上樣于Chelating Sepharose FF-Ni螯合柱，用上樣緩沖液洗滌4個(gè)柱體積，再以20%的洗脫緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl，pH 10.0，1 mol/L NaCl，500 mmol/L 咪唑，8 mol/L尿素)洗脫，收集主峰，之后以100%洗脫緩沖液洗脫。

離子交換層析：使用Vivaflow50膜包將親和層析收集目的峰緩沖液更換成離子交換上樣緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl，pH 10.0，8 mol/L 尿素)并上樣于DEAE Sepharose Fast Flow柱，用上樣緩沖液洗滌柱子，之后用洗脫緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl，pH 10.0，8 mol/L 尿素，1 mol/L NaCl)階段洗脫，收集各峰，SDS-PAGE分析后合并高純度樣品。

1.2.4 蛋白的復(fù)性

將得到的純品蛋白加入N-十二烷基肌氨酸鈉，置于4℃透析24 h，之后逐步降低變性劑濃度直至完全沒(méi)有變性劑，蛋白溶液呈現(xiàn)清亮透明，無(wú)沉淀無(wú)渾濁，即完成了復(fù)性。

1.2.5 Western blotting檢測(cè)P51蛋白

取純化后的P51蛋白進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，使用 iBlot? Dry Blotting System 系統(tǒng)將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜(Millipore)；用 5%脫脂奶粉封閉液(4%BSA，10 mmol/L Tris-HCl，15 mmol/L NaCl，0.1%Tween20)封閉2 h，以HIV-1質(zhì)控陽(yáng)性血清作為一抗，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗人IgG抗體作為二抗，分別于室溫下作用2 h；顯色劑(0.3% NiCl2，0.01 mol/L Tris-HCl，3'-3′二氨基聯(lián)苯胺，雙氧水)顯色10 min，終止反應(yīng)。

1.2.6 P51抗原標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶

采用過(guò)碘酸鈉法將P51抗原標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶(HRP)?？乖兔傅馁|(zhì)量比為1～1.2∶1，HRP和抗原混合后置4℃過(guò)夜，然后以0.02 mol/L PBST(pH 7.4)4℃透析，其他參見(jiàn)常規(guī)標(biāo)記方法[3]。

1.2.7 雙抗原夾心法ELISA檢測(cè)質(zhì)控血清樣本

取臨床樣本中已知HIV-1陽(yáng)性血清及陰性血清作為實(shí)驗(yàn)樣本。陽(yáng)性血清從 1∶50倍比稀釋至 1∶6400，陰性樣本只做 1∶50稀釋?zhuān)浑p抗原夾心法的二抗(HRP標(biāo)記的P51抗原)做1∶2000、1∶4000、1∶8000三個(gè)稀釋度，間接法的二抗(HRP標(biāo)記的IgG)做 1∶10 000、1∶20 000、1∶40 000三個(gè)稀釋度。每個(gè)樣本在梯度稀釋下均有不同二抗稀釋度與之相對(duì)應(yīng)。其余操作按照常規(guī)ELISA實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 P51抗原的原核表達(dá)

本實(shí)驗(yàn)考察了不同誘導(dǎo)溫度(37℃、25℃)時(shí)間(2 h、4 h、6 h、8 h)及誘導(dǎo)劑用量(0.1%、0.01%(V/V)IPTG)對(duì)目的蛋白表達(dá)的影響，綜合各種因素選擇37℃、0.01%(V/V)IPTG的誘導(dǎo)條件，在大腸桿菌BL21 codonplus中表達(dá)目的蛋白P51，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)抗原蛋白得到了大量表達(dá)(圖1)。

2.2 尿素溶解包涵體結(jié)果

通過(guò)設(shè)置梯度pH(7.0、8.0、9.0、10.0)及尿素濃度(2、4、6、8 mol/L)洗滌包涵體實(shí)驗(yàn)可知，在 pH 10.0時(shí) 8 mol/L尿素的溶解效果最佳，但仍不能完全溶解，結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.3 層析結(jié)果

2.3.1 金屬離子螯合層析結(jié)果

綜合SDS-PAGE電泳結(jié)果可知，螯合色譜特異性較好，填料對(duì)非特異性蛋白吸附量較低，大量雜蛋白在穿透峰中，進(jìn)而一步洗脫即可使P51抗原純度達(dá)到85%以上(圖3、4)。

2.3.2 離子交換層析結(jié)果

結(jié)合SDS-PAGE電泳結(jié)果可知，P51在較低鹽濃度時(shí)即可完全洗脫，提高鹽濃度，將有少量雜蛋白伴隨洗脫，因此梯度洗脫可獲得較高純度P51蛋白(圖5、6)。

圖1 P51在大腸桿菌BL21 codonplus中的表達(dá)Fig.1 P51 antigen expressed in E.coli BL21 codonplus.M:protein marker; 1: E.coli BL21 codonplus strain without plasmid; 2: E.coli BL21 codonplus/pTHioHisA51 without IPTG induction; 3: E.coli BL21 codonplus/pTHioHisA51 induced with IPTG; 4: supernatant of lysed cells(E.coli BL21 codonplus/pTHioHisA51 induced with IPTG); 5: precipitate of lysed cells(E.coli BL21 codonplus/pTHioHisA51 induced with IPTG).

圖2 P51包涵體在尿素中的溶解Fig.2 Dissolution of inclusion bodies with 8 mol/L urea at pH 10.0.M: protein marker; 1: the supernatant after 8 mol/L urea dissolution; 2: the precipitation after 8 mol/L urea dissolution.

圖3 Ni螯合柱層析圖譜Fig.3 Ni-Chelating chromatography.Peak 1: flow through fraction; Peak 2: elution with 20% elution buffer; Peak 3:elution with 100% elution buffer.

圖4 經(jīng)Ni親和層析樣品的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of the samples from Ni-chelating chromatography.M: protein marker; 1: sample before chromatography; 2: sample from Peak 1(flow through fraction);3,4: samples from Peak 2(eluted with 20% elution buffer); 5:sample from Peak 3(eluted with 100% elution buffer).

圖5 DEAE離子交換層析圖譜Fig.5 DEAE IE chromatogram.Peak 1: flow through fraction;Peak 2: the first elution fraction; Peak 3: the second elution fraction; Peak 4: the third elution fraction.

2.4 Western blotting檢測(cè)結(jié)果

Western blotting結(jié)果表明，純化的蛋白可與HIV陽(yáng)性血清發(fā)生結(jié)合，大小準(zhǔn)確，條帶清晰、單一，顯示了極好的特異性。見(jiàn)圖7。

2.5 ELISA結(jié)果

如圖8所示，間接法的cutoff值在二抗各稀釋度下依次為 0.9、0.4、0.2，而同樣的陰性樣本夾心法cutoff值均為0.01左右(數(shù)據(jù)未標(biāo)明)，體現(xiàn)出夾心法具有較高特異性；陽(yáng)性樣本在稀釋度為1∶6400時(shí)也能夠較好的判陽(yáng)，未出現(xiàn)漏檢和假陽(yáng)性情況，表現(xiàn)出較好的靈敏度。

3 討論

圖6 離子交換層析樣品的SDS-PAGE分析Fig.6 SDS-PAGE analysis of samples from the DEAE-IE chromatography.M: protein marker; 1: sample from the first elution fraction; 2: sample from the second elution fraction; 3:sample form the third elution fraction.

圖7 Western blotting檢測(cè)純化的P51蛋白Fig.7 Western blotting analysis of the purified P51.M:prestained protein marker; 1: recombinant P51 after purification;2: cell lysate of E.coli transformed with pThioHisA plasmid vector and induced with IPTG.

圖8 P51的ELISA檢測(cè)Fig.8 ELISA assay of P51.The OD values of positive sample≥2.1 folds the OD values of negative sample means.

P51蛋白在HIV-1中較為保守，在HIV-1各亞型中同源性在85%以上，與HIV-2之間也有60%的同源性。因此其用做檢測(cè)試劑，假陽(yáng)性率及漏檢率均較低，能夠真實(shí)地反映感染者血清學(xué)狀況。在HIV-1感染者中，P51的檢出率僅次于HIV膜蛋白，為90%以上，隨著疾病的進(jìn)展，其檢出率稍有下降，但波動(dòng)不大[4-5]。

本研究室曾成功表達(dá)純化該蛋白，采用的策略為包涵體復(fù)性后采用DEAE精純，得到較純蛋白[6]，但由于收率較低，且樣品中仍含有變性劑，因而本實(shí)驗(yàn)改用金屬離子螯合層析配合離子交換色譜技術(shù)，獲得了單一條帶的高純度蛋白，并成功復(fù)性。

重組p51抗原易于形成包涵體，需要通過(guò)變性、復(fù)性手段，使重組蛋白折疊成天然構(gòu)象狀態(tài)[7]。包涵體蛋白的復(fù)性效率往往較低，復(fù)性成本較高，有的蛋白甚至不易成功地復(fù)性。研究證明，采用低pH(≤2.6)和高溫(85℃)[8]或用高 pH(≥12)結(jié)合低濃度的變性劑[9]有利于包涵體復(fù)性。

溶解包涵體時(shí)，pH值和尿素濃度對(duì)其都有較大影響[10-11]，結(jié)果表明在高尿素濃度(6 mol/L及8 mol/L)下，較高pH有利于包涵體的溶解。而且，適當(dāng)提高pH可以保持包涵體中存在的具有天然狀態(tài)二級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白，有利于后續(xù)的復(fù)性過(guò)程[12-13]，因此選擇pH 10.0、8 mol/L尿素作為包涵體溶解的條件。

目的蛋白的復(fù)性過(guò)程中，添加N-十二烷基肌氨酸鈉可起到2種作用：1)當(dāng)N-十二烷基肌氨酸鈉濃度較高時(shí)可作為變性劑，保持包涵體處于溶解狀態(tài)；2)當(dāng) N-十二烷基肌氨酸鈉濃度較低時(shí)起到保護(hù)劑的作用，可幫助蛋白折疊復(fù)性。采用較高的復(fù)性pH，有利于防止自由硫醇的質(zhì)子化作用對(duì)形成正確二硫鍵的不利影響。過(guò)高或過(guò)低的 pH都會(huì)降低復(fù)性效率，最適宜的復(fù)性pH值一般是9.0左右。同時(shí)在復(fù)性緩沖液中添加高濃度Tris及甘油，有利于提高蛋白折疊效率[12-13]。

較之間接法 ELISA，雙抗原夾心法可以同時(shí)檢測(cè)血液中的IgG和IgM，有利于提高檢出靈敏度并縮短“窗口期”。同時(shí)，酶標(biāo)抗原與被包被抗原所捕獲的抗體之間的結(jié)合具有高度特異性，不受非特異性抗體的干擾，因而雙抗原夾心法的特異性更好[14-15]。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，采用間接法其本底值隨二抗用量增多而加大，意味著有較多的非特異性結(jié)合，而夾心法由于其特異性優(yōu)勢(shì)，本底值極低，能很好地排除非特異性干擾，因此在保證特異性及靈敏度的前提下，可以加大抗原包被量得以更加靈敏的檢測(cè)樣本。由于 P51在大腸桿菌中表達(dá)極易形成包涵體，而雙抗原夾心法做酶標(biāo)記時(shí)要求抗原最好以可溶形式存在，因而其復(fù)性成功與否成為能否開(kāi)發(fā)成功雙抗原夾心法P51抗體檢測(cè)試劑的關(guān)鍵。近年來(lái)逆轉(zhuǎn)錄酶抗原表位不斷發(fā)現(xiàn)和闡明，為研究HIV疫苗提供了新思路，由于逆轉(zhuǎn)錄酶自身保守性，以逆轉(zhuǎn)錄酶作為抗原的病毒疫苗和核酸疫苗將對(duì)病毒的變異有更大的適應(yīng)性[16-17]，因此本研究為 HIV抗體檢測(cè)及疫苗研究提供了關(guān)鍵試劑。

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Expression, purification and renaturation of Pol P51 antigen of HIV-1 strain CN54 and its application in antibody detection

Jue Hou1,2, Jing Sun2, Zhiyong Xu2, Wenling Fan2, Yixuan Zhang1, Yong Liu2, and Yanling Hao2
1 College of Life Science and Biopharmaceutics, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China 2 State Key Laboratory for Infectious Disease Prevention and Control, National Center for AIDS/STD Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100050, China

Received:September 29, 2009;Accepted:December 25, 2009

Supported by:Special Project of the “Eleventh Five-year Plan”(Nos.2008ZX1001-1010, 2009ZX10004-713).

Corresponding author:Yanling Hao.Tel: +86-10-67887758; Fax: +86-10-67887758; E-mail: hylyuer@yahoo.com.cn國(guó)家十一五科技重大專(zhuān)項(xiàng)(Nos.2008ZX1001-1010, 2009ZX10004-713)資助。