利用Tol2轉(zhuǎn)座子構(gòu)建斑馬魚心臟組織特異表達(dá)轉(zhuǎn)基因載體及其表達(dá)分析

陳婷芳，羅娜，謝華平，吳秀山，鄧云

湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 心臟發(fā)育研究中心，長沙 410081

利用Tol2轉(zhuǎn)座子構(gòu)建斑馬魚心臟組織特異表達(dá)轉(zhuǎn)基因載體及其表達(dá)分析

陳婷芳，羅娜，謝華平，吳秀山，鄧云

湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 心臟發(fā)育研究中心，長沙 410081

為了制備用于在斑馬魚心臟中特異表達(dá)目的基因的轉(zhuǎn)基因載體，通過分子克隆的方法對能夠在斑馬魚心臟中特異表達(dá)EGFP報(bào)告基因的Tol2載體進(jìn)行了改造，在原有的CMLC2啟動(dòng)子與EGFP編碼區(qū)之間插入帶有多克隆位點(diǎn)的IRES序列，獲得pTol2-CMLC2-IRES-EGFP轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體，該載體可以實(shí)現(xiàn)在同一個(gè)啟動(dòng)子CMLC2的驅(qū)動(dòng)下分別同時(shí)表達(dá)目的基因和 EGFP；為了驗(yàn)證該表達(dá)載體的有效性，進(jìn)一步在 CMLC2啟動(dòng)子與 IRES序列之間插入DsRed-Monome編碼區(qū)，利用得到的pTol2-CMLC2-RED-IRES-EGFP轉(zhuǎn)基因載體顯微注射到斑馬魚單細(xì)胞期胚胎中進(jìn)行表達(dá)分析，結(jié)果表明外源目的基因DsRed-Monome和報(bào)告基因EGFP均能以相同的表達(dá)模式在斑馬魚心臟組織中特異表達(dá)。pTol2-CMLC2-IRES-EGFP轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體的成功構(gòu)建對于建立心臟發(fā)育候選基因的斑馬魚轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)?zāi)Ｐ途哂兄匾饬x。

Tol2轉(zhuǎn)座子，斑馬魚，轉(zhuǎn)基因，心臟特異表達(dá)

Abstract:In an effort to generate a desired expression construct for making heart-specific expression transgenic zebrafish, a Tol2 plasmid, which can drive EGFP reporter gene specifically expressed in the heart, was modified using subcloning technology.An IRES fragment bearing multiple cloning site(MCS)was amplified directly from pIRES2-EGFP plasmid and was inserted between the CMLC2 promoter and EGFP fragment of the pDestTol2CG vector.This recombinant expression plasmid pTol2-CMLC2-IRES-EGFP can drive any interested gene specifically expressed in the zebrafish heart along with EGFP reporter gene.To test the effectiveness of this new expression plasmid, we constructed pTol2-CMLC2-RED-IRES-EGFP plasmid by inserting another reporter gene DsRed-Monome into MCS downstream of the CMLC2 promoter and injected this transgenic recombinant plasmid into one-cell stage embryos of zebrafish.Under fluorescence microscope, both the red fluorescence and the greenfluorescence produced by pTol2-CMLC2-RED-IRES-EGFP were detected specifically in the heart tissue in the same expression pattern.This novel expression construct pTol2-CMLC2-IRES-EGFP will become an important tool for our research on identifying heart development candidate genes’ function using zebrafish as a model.

Keywords:Tol2 transposon, zebrafish, transgenesis, heart-specific expression

轉(zhuǎn)座子作為插入突變源和分子標(biāo)簽被廣泛應(yīng)用于基因的分離、克隆以及基因功能分析，利用基因的轉(zhuǎn)座原理可研究基因的調(diào)控模式，可為脊椎動(dòng)物細(xì)胞的分化和發(fā)育提供依據(jù)[1]。Tol2是近年發(fā)現(xiàn)的唯一的天然存在且具有轉(zhuǎn)座活性的脊椎動(dòng)物轉(zhuǎn)座子，存在于中國、韓國、日本等國的一種淡水魚——青鳉Oryzias latipes的基因組中[2]。Kawakami等利用Tol2轉(zhuǎn)座子構(gòu)建了含有特異性啟動(dòng)子調(diào)節(jié)基因表達(dá)的序列(SIX3.2:gfp)載體，該質(zhì)粒DNA和體外合成的相應(yīng)轉(zhuǎn)座酶基因 mRNA共注射到單細(xì)胞期斑馬魚胚胎中。插入基因組的轉(zhuǎn)座子序列能高頻率傳遞 F1斑馬魚，其中特異性啟動(dòng)子調(diào)節(jié)基因表達(dá)的序列(SIX3.2:gfp)可以穩(wěn)定存在于轉(zhuǎn)基因魚[3]。Tol2轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)在脊椎動(dòng)物的基因克隆和基因功能分析方面具有重要的應(yīng)用前景，對分子生物學(xué)的發(fā)展有著深遠(yuǎn)的意義。但是，目前還沒有適合斑馬魚心臟組織特異性表達(dá)外源目的基因的Tol2轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)基因載體。

Kwan等將Tol2轉(zhuǎn)座子中轉(zhuǎn)座酶編碼基因切除，代之以 CMLC2-EGFP-polyA 表達(dá)序列和其他重組篩選序列，如CCDB(Control of cell death)基因序列等，構(gòu)建了pDestTol2CG2質(zhì)粒，將該質(zhì)粒與轉(zhuǎn)座酶mRNA 一起顯微注射斑馬魚單細(xì)胞期胚胎，觀察到斑馬魚心臟組織中有綠色熒光蛋白特異表達(dá)，同時(shí)外源片段整合效率高[4]。但是直接將 pDestTol2CG2質(zhì)粒用于心臟發(fā)育候選基因的斑馬魚轉(zhuǎn)基因載體還有許多缺陷。首先，CMLC2啟動(dòng)子下游沒有可供選擇的多克隆位點(diǎn)以便插入一個(gè)心臟發(fā)育候選基因編碼序列；其次，如果將EGFP編碼基因切除，代之以其他心臟發(fā)育候選基因編碼序列，失去報(bào)告基因——綠色熒光蛋白的表達(dá)對分析目的基因的表達(dá)非常不方便；第三，如果將心臟發(fā)育候選基因編碼序列與EGFP編碼基因直接連接，在CMLC2啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下兩個(gè)蛋白融合表達(dá)，目的基因蛋白的生物活性可能受到影響。

為了構(gòu)建適用于在斑馬魚心臟中特異表達(dá)目的基因的轉(zhuǎn)基因載體，本實(shí)驗(yàn)利用分子克隆的方法對能夠在斑馬魚心臟中特異表達(dá) EGFP報(bào)告基因的Tol2轉(zhuǎn)座子載體進(jìn)行了改造，在原有的CMLC2啟動(dòng)子與EGFP編碼區(qū)之間插入帶有多克隆位點(diǎn)的IRES序列，獲得pTol2-CMLC2-IRES-EGFP轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體，該載體可以實(shí)現(xiàn)在同一個(gè)啟動(dòng)子CMLC2的驅(qū)動(dòng)下分別同時(shí)表達(dá)目的基因和EGFP；為了驗(yàn)證該表達(dá)載體的有效性，在CMLC2啟動(dòng)子與IRES序列之間插入DsRed-Monomer編碼區(qū)，將得到的表達(dá)外源基因 DsRed-Monomer的重組載體 pTol2-CMLC2-RED-IRES-EGFP顯微注射到斑馬魚單細(xì)胞期胚胎中進(jìn)行表達(dá)分析：外源目的基因(DsRed-Monomer)和報(bào)告基因(EGFP)均能以相同的模式在斑馬魚心臟組織中特異表達(dá)。pTol2-CMLC2-IRES-EGFP轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體的成功構(gòu)建為以斑馬魚作為動(dòng)物模型，研究人類心臟發(fā)育候選基因在心臟發(fā)育中的功能奠定了重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

pDestTol2CG2等質(zhì)粒為日本國立遺傳研究所Kawakami教授惠贈(zèng)，Tol2轉(zhuǎn)座子中含有 CCDB(Control of cell death)基因和CMLC2-EGFP-polyA表達(dá)序列，其詳細(xì)的載體結(jié)構(gòu)圖見 Kawakami教授實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)站 http://chien.neuro.utah.edu/tol2kitwiki/index.php/PDestTol2CG。pDsRed-Monomer-C1、pIRES2-EGFP質(zhì)粒以及大腸桿菌 DH5α菌株為湖南師范大學(xué)心臟發(fā)育研究中心保存。凝膠回收試劑盒、DNA連接試劑盒、DNA補(bǔ)平試劑盒、LA Taq DNA聚合酶和各種限制性內(nèi)切酶為 TaKaRa公司產(chǎn)品。大腸桿菌One Shot ccdB Survival Competent Cells購自Invitrogen公司，–80℃保存。條紋斑馬魚品系購自中國科學(xué)院武漢水生生物研究所，28℃自動(dòng)水循環(huán)魚缸培養(yǎng)。

1.2 pTol2-CMLC2-IRES-EGFP多克隆位點(diǎn)表達(dá)載體的構(gòu)建

pTol2-CMLC2-IRES-EGFP多克隆位點(diǎn)表達(dá)載體及其下游表達(dá)載體的構(gòu)建流程見圖1。

pDestTol2CG2轉(zhuǎn)化入大腸桿菌One Shot ccdB Survival Competent Cells，氨卞青霉素篩選，混收菌落，提取質(zhì)粒后用限制性內(nèi)切酶SalⅠ和KpnⅠ切除pDestTol2CG2質(zhì)粒中的CCDB片段，回收骨架目的片段后用DNA補(bǔ)平試劑盒補(bǔ)平后連接環(huán)化，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，純化得到pTol2-CMLC2-EGFP質(zhì)粒。以 pIRES2-EGFP質(zhì)粒 DNA為模板，以 IRES-F3(5'?3')：TCCATGGTTCGAATTCTGCAGTCGACGG(下劃線部分為 Nco I酶切位點(diǎn))和 IRES-R3(5'?3')：GGTCATGATTGTGGCCATATTATCATCG(下劃線部分為BspHⅠ酶切位點(diǎn))為引物，利用LA Taq PCR擴(kuò)增帶有EcoR I、Sal I、BamH I等克隆位點(diǎn)的IRES序列，克隆到pUM18-T質(zhì)粒上，酶切、測序鑒定獲得pUM18-T/IRES質(zhì)粒。然后用Nco I/BspH I雙酶切pUM18-T/IRES質(zhì)粒，回收IRES目的片段克隆至pTol2-CMLC2-EGFP質(zhì)粒中 CMLC2啟動(dòng)子下游的Nco I位點(diǎn)。經(jīng)酶切、測序鑒定獲得pTol2-CMLC2-IRES-EGFP表達(dá)質(zhì)粒。

圖1 斑馬魚心臟組織特異表達(dá)轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建Fig.1 Construction of the zebrafish heart-specific transgenetic vector.

1.3 pTol2-CMLC2-RED-IRES-EGFP表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)紅色熒光蛋白的表達(dá)序列，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物 DSRED-F(5'?3')：GCCATGGACAACACCGAG GACGTC(下劃線部分為 Nco I酶切位點(diǎn))和DSRED-R(5'?3')：GGAATTC TTACTACTGGGAGCC GGAGTGG(下劃線部分為EcoR I酶切位點(diǎn))。利用引物DSRED-F/DSRED-R，以 pDsRed-Monomer-C1質(zhì)粒DNA為模板，通過PCR 擴(kuò)增出DsRed-Monomer編碼序列的DNA 片段，克隆到pUC18-T 質(zhì)粒上，經(jīng)酶切，測序鑒定得到pUC18-T/DsRed- Monomer質(zhì)粒。Nco I/EcoR I雙酶切pUC18-T/DsRed-Monomer質(zhì)粒后，將回收到的DsRed-Monomer編碼序列的DNA片段克隆到 pTol2-CMLC2-IRES-EGFP多克隆位點(diǎn)表達(dá)質(zhì)粒中。經(jīng)PCR、測序鑒定獲得pTol2-CMLC2-RED-IRES-EGFP表達(dá)質(zhì)粒。

1.4 斑馬魚心臟特異表達(dá)轉(zhuǎn)基因載體的表達(dá)分析

斑馬魚受精卵的獲?。菏芫皩⒋菩塾H魚分開飼喂2～3 d后按1:1～2比例放入產(chǎn)卵池中進(jìn)行產(chǎn)卵受精。分選和洗凈的卵移到有瓊脂糖的表面皿中，注射外源 DNA 濃度為 0.15 μg/μL， DNA 體積約 2 nL。受精卵的動(dòng)物極注射完畢后，慢慢抽出注射針，將受精卵放入裝有無菌水的培養(yǎng)皿中，使其恢復(fù)發(fā)育；25℃～28℃培養(yǎng)胚胎，分別在24 h、48 h、72 h后，熒光顯微鏡下觀察篩選心臟組織具有熒光蛋白的胚胎個(gè)體。有綠色熒光的個(gè)體表示成功載入報(bào)告基因EGFP的嵌合個(gè)體。

2 結(jié)果與分析

2.1 pTol2-CMLC2-IRES-EGFP多克隆位點(diǎn)表達(dá)載體的鑒定

pDestTol2CG2質(zhì)粒是把Tol2轉(zhuǎn)座子中轉(zhuǎn)座酶切除后，將CCDB(Control of cell death)基因和CMLC2-EGFP-polyA 表達(dá)序列并入到Tol2轉(zhuǎn)座子中，其中CCDB基因的上游和下游均帶有同源重組臂。如果沒有外源 DNA片段同源重組置換 CCDB片段，CCDB基因則會(huì)表達(dá)蛋白，會(huì)破壞細(xì)菌的 DNA gyrase，造成細(xì)菌染色體的降解導(dǎo)致細(xì)菌死亡，因此不能轉(zhuǎn)入DH5α中進(jìn)行擴(kuò)增。pDestTol2CG2質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶Sal I和Kpn I切除其中的CCDB片段，回收骨架目的片段用 DNA補(bǔ)平試劑盒補(bǔ)平后連接環(huán)化；限制性內(nèi)切酶 Sal I的酶切位點(diǎn)在得到的pTol2-CMLC2-EGFP質(zhì)粒中并未消失，該位點(diǎn)位于poly A序列的下游。將帶有EcoR I、Sal I、BamH I等克隆位點(diǎn)的IRES序列正確連接到pTol2-CMLC2-EGFP質(zhì)粒的 Nco I位點(diǎn)，得到 pTol2-CMLC2-IRES-EGFP重組質(zhì)粒。本實(shí)驗(yàn)共制備了6個(gè)重組質(zhì)粒DNA，經(jīng)Sal I酶切后電泳結(jié)果見圖2，有5個(gè)質(zhì)粒酶切片段的大小與預(yù)期大小一致(5044 bp和1779 bp)。結(jié)果表明，帶有EcoR I、Sal I、BamH I等克隆位點(diǎn)的 IRES序列已成功地克隆到pTol2-CMLC2-EGFP質(zhì)粒中，該結(jié)果經(jīng)進(jìn)一步的測序分析得到證實(shí)。

2.2 pTol2-CMLC2-RED-IRES-EGFP表達(dá)載體的鑒定

用引物 DSRED-F/DSRED-R從質(zhì)粒 pDsRed-Monomer-C1克隆到 DsRed-Monomer編碼序列的DNA 片段，經(jīng)測序鑒定后連接到 pTol2-CMLC2-IRES-EGFP 表達(dá)質(zhì)粒的Nco I/ EcoR I位點(diǎn)，獲得pTol2-CMLC2-RED-IRES-EGFP表達(dá)質(zhì)粒。用Nco I/EcoR I雙酶切的方法鑒定獲得pTol2-CMLC2-REDIRES-EGFP表達(dá)質(zhì)粒，用 0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析雙酶切產(chǎn)物，結(jié)果如圖3所示。質(zhì)粒雙酶切后DNA片段的大小與預(yù)期的DsRed-Monomer編碼序列片段(687 bp)和表達(dá)載體片段(6823 bp)的大小一致。結(jié)果表明，已成功地構(gòu)建了 pTol2-CMLC2-REDIRES-EGFP表達(dá)載體，也進(jìn)一步證實(shí)了測序結(jié)果。

圖2 pTol2-CMLC2-IRES-EGFP質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.2 Identification of pTol2-CMLC2-IRES-EGFP plasmid by enzyme digestion.M: DNA marker; 1–6: agarose electrophoresis of the six different pTol2-CMLC2- IRES-EGFP plasmids digested with Sal I.1, 2, 3, 4 and 6 are the positive plasmids.

圖3 pTol2-CMLC2-RED-IRES-EGFP質(zhì)粒的Nco I和EcoR I雙酶切鑒定Fig.3 Identification of pTol2-CMLC2-RED-IRES-EGFP plasmids by enzyme digestion with Nco I and EcoR I.M: DNA marker; 1, 2: agarose electrophoresis of the two different pTol2-CMLC2-RED-IRES-EGFP plasmids digested with Nco I and EcoR I.1 and 2 are both the positive plasmids.

2.3 斑馬魚心臟特異表達(dá)轉(zhuǎn)基因載體的表達(dá)分析

將目的基因序列連接到 pTol2-CMLC2-IRES-EGFP質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)(MCS)，得到目的基因的表達(dá)載體；該載體在CMLC2啟動(dòng)子作用下，可以在心臟組織中特異轉(zhuǎn)錄目的基因的 mRNA；該mRNA實(shí)際上也包括 IRES轉(zhuǎn)錄序列和報(bào)告基因EGFP轉(zhuǎn)錄序列。因此，該mRNA能在細(xì)胞中翻譯成目的蛋白和綠色熒光蛋白，綠色熒光蛋白在心臟組織中的表達(dá)時(shí)空模式可以間接地反映外源目的蛋白的時(shí)空表達(dá)模式。為了分析IRES序列或克隆位點(diǎn)插入的目的基因?qū)G色熒光蛋白表達(dá)的影響，pTol2-CMLC2-IRES-EGFP和pTol2-CMLC2-REDIRES-EGFP表達(dá)質(zhì)粒純化后顯微注射到斑馬魚單細(xì)胞期胚胎，在24 h后，在熒光顯微鏡下可以觀察到綠色熒光蛋白在顯微注射了 pTol2-CMLC2-IRESEGFP表達(dá)質(zhì)粒的斑馬魚胚胎心臟組織中特異表達(dá)(圖4)。顯微注射pTol2-CMLC2-RED-IRES-EGFP表達(dá)質(zhì)粒的斑馬魚胚胎心臟組織中既有紅色熒光蛋白又有綠色熒光蛋白特異表達(dá)，且綠色熒光蛋白的時(shí)空表達(dá)模式與紅色熒光蛋白相同；綠色熒光的熒光強(qiáng)度比紅色熒光弱(圖5)。

3 討論

圖4 綠色熒光蛋白在斑馬魚心臟組織中的表達(dá)分析Fig.4 EGFP protein was specifically expressed in the heart tissue of the zebrafish embryos microinjected with pTol2-CMLC2-IRES-EGFP.Lateral(A)and ventral(B)side observation was performed with Nikon fluorescence microscope,and green fluorescence was detected in the heart of the zebrafish embryos using green light excitated.Ventricle marked by red arrow and atria marked by white arrow.

圖5 綠色和紅色熒光蛋白在斑馬魚心臟組織中的表達(dá)分析Fig.5 EGFP protein and RED protein were specifically and coinstantaneously expressed in the heart tissue of the zebrafish embryos microinjected with pTol2-CMLC2-RED-IRES-EGFP.Observation of fluorescence of the heart tissue of the zebrafish embryos microinjected with pTol2-CMLC2-RED-IRES-EGFP was performed with a Nikon fluorescence microscope.The green fluorescence(B)and red fluorescence(C)was displayed specifically and coinstantaneously in the heart tissue of the zebrafish embryos(A)microinjected and excited by blue light and red light respectively.Ventricle marked by red arrow and atria marked by white arrow.

Koga等[5]將Tol2轉(zhuǎn)座子中119 kb的轉(zhuǎn)座酶編碼基因切除，代之以GFP基因，將改造后的片段與轉(zhuǎn)座酶mRNA一起顯微注射到基因組不含Tol2轉(zhuǎn)座元件的菲律賓青鳉受精卵中。將存活的成年青鳉與未注射轉(zhuǎn)座元件的青鳉交配，后代中有約 1/5的基因組中帶有GFP基因，表明GFP基因在當(dāng)代通過Tol2的轉(zhuǎn)座整合到基因組中了。已經(jīng)有研究表明，Tol2可攜帶長達(dá)9.7 kb的外源標(biāo)記基因，整合到受體基因組的染色體上[6]。

Kwan將 Tol2轉(zhuǎn)座子中轉(zhuǎn)座酶編碼基因切除，代之以 CMLC2-EGFP-polyA表達(dá)序列，構(gòu)建了pDestTol2CG2質(zhì)粒，將該質(zhì)粒與轉(zhuǎn)座酶 mRNA 一起顯微注射斑馬魚單細(xì)胞期胚胎，觀察到斑馬魚心臟組織中有綠色熒光蛋白特異表達(dá)，同時(shí)外源片段整合效率高[4]。正如上述所言，直接將pDestTol2CG2質(zhì)粒用于心臟發(fā)育候選基因的斑馬魚轉(zhuǎn)基因載體還有許多缺陷。內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)序列來源于腦心肌炎病毒[7]，它可翻譯一條mRNA上的兩個(gè)開放閱讀框，由其連接的兩個(gè)基因的表達(dá)效率相同[8-9]。本實(shí)驗(yàn)切除了pDestTol2CG2質(zhì)粒中的CCDB片段，同時(shí)將帶有多克隆位點(diǎn)的IRES片段克隆到質(zhì)粒中CMLC2啟動(dòng)子下游的Nco I位點(diǎn)。改造后的表達(dá)質(zhì)粒 pTol2-CMLC2-IRES-EGFP在斑馬魚心臟組織中有綠色熒光蛋白特異表達(dá)(圖4)；同時(shí)，綠色熒光在心房和心室中表達(dá)的強(qiáng)度有差異，心室熒光信號很強(qiáng)，而心房的熒光信號很弱；該結(jié)果與其他文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致[4]，這種情況可能是與CMLC2啟動(dòng)子特性有關(guān)[10]。因此，插入 IRES片段后對綠色熒光蛋白特異表達(dá)沒有影響。

根據(jù)基因工程原理將目的基因和報(bào)告基因(如EGFP)通過 IRES序列連接起來，兩個(gè)基因在同一個(gè)啟動(dòng)子作用下轉(zhuǎn)錄成單鏈 mRNA，但翻譯時(shí)又是相互獨(dú)立的，不會(huì)形成嵌合蛋白[8-9]，保證了目的基因蛋白的生物活性，并且理論上只要有報(bào)告基因(如 EGFP)的表達(dá)，目的基因也肯定會(huì)表達(dá)，因此便于通過檢測報(bào)告基因EGFP的表達(dá)來進(jìn)行轉(zhuǎn)基因生物個(gè)體的篩選[11]。對于pTol2-CMLC2-RED-IRESEGFP表達(dá)質(zhì)粒來說，在CMLC2啟動(dòng)子作用下，在心臟組織中特異轉(zhuǎn)錄目的基因 DsRed-Monomer的mRNA實(shí)際上也包括 IRES轉(zhuǎn)錄序列和報(bào)告基因EGFP轉(zhuǎn)錄序列。該mRNA能在細(xì)胞中翻譯出目的蛋白——紅色熒光蛋白和報(bào)告基因蛋白——綠色熒光蛋白；EGFP蛋白與DsRed-Monomer蛋白的編碼框是獨(dú)立的，均有各自的起始位點(diǎn)ATG和終止位點(diǎn)TGA或TAA等，核糖體與該mRNA的5′端前導(dǎo)序列結(jié)合翻譯成目的蛋白——紅色熒光蛋白后脫離，同時(shí)，核糖體也可以與該mRNA的IRES序列結(jié)合翻譯下游的綠色熒光蛋白。因此，在細(xì)胞中紅色熒光蛋白和綠色熒光蛋白是兩個(gè)獨(dú)立蛋白，而不是融合蛋白。同時(shí)，只要有綠色熒光蛋白的表達(dá)就可以證明IRES在斑馬魚胚胎中的有效性。將質(zhì)粒純化后顯微注射到斑馬魚單細(xì)胞期胚胎，24 h后，在熒光顯微鏡下觀察斑馬魚胚胎心臟組織中紅色熒光蛋白和綠色熒光蛋白均同時(shí)特異表達(dá)，綠色熒光的熒光強(qiáng)度比紅色熒光弱(圖5)。因此，在CMLC2啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)下，與 IRES序列相連接的雙基因可同時(shí)表達(dá)，綠色熒光蛋白表達(dá)時(shí)空模式可以間接地反映RED基因的表達(dá)時(shí)空模式。

根據(jù)已有的文獻(xiàn)報(bào)道共注射編碼轉(zhuǎn)座酶 mRNA整合率高達(dá) 50%[3]，在向單細(xì)胞期斑馬魚胚胎中注射實(shí)驗(yàn)中，本實(shí)驗(yàn)曾嘗試表達(dá)質(zhì)粒與轉(zhuǎn)座酶 mRNA共注射和表達(dá)質(zhì)粒單獨(dú)注射兩種方法，結(jié)果表明：表達(dá)質(zhì)粒與轉(zhuǎn)座酶mRNA共注射和表達(dá)質(zhì)粒單獨(dú)注射均能觀察到紅色熒光和綠色熒光在斑馬魚心臟組織中特異表達(dá)，并且兩者的時(shí)空模式相同(圖4)；且有無轉(zhuǎn)座酶mRNA的顯微注射，陽性個(gè)體之間紅色熒光和綠色熒光在心臟組織中分布和均一性等均有不同程度的差異，并未發(fā)現(xiàn)共注射陽性個(gè)體的均一性明顯優(yōu)于單獨(dú)注射陽性個(gè)體；只是共注射編碼轉(zhuǎn)座酶mRNA的斑馬魚胚胎表達(dá)紅色熒光和綠色熒光的陽性率高達(dá)18%，單獨(dú)注射Tol2轉(zhuǎn)座子重組表達(dá)載體只有 3%～6%，但表達(dá)陽性率的高低并不影響轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體的定性分析[12]。

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的 pTol2-CMLC2-IRES-EGFP的斑馬魚轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體引入一個(gè)多克隆位點(diǎn)片段，能方便插入一個(gè)心臟發(fā)育候選基因；與轉(zhuǎn)座酶 mRNA一起顯微注射斑馬魚單細(xì)胞期胚胎，Tol2 轉(zhuǎn)座子整合效率高可以實(shí)現(xiàn)心臟發(fā)育候選基因表達(dá)序列的高效整合，通過熒光顯微鏡觀測報(bào)告基因EGFP有無表達(dá)，即能準(zhǔn)確分析目的基因的表達(dá)情況，且方法簡單易行。因此，該載體的成功構(gòu)建對于建立心臟發(fā)育候選基因的斑馬魚轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)?zāi)Ｐ途哂兄匾饬x。

REFERENCES

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Tingfang Chen, Na Luo, Huaping Xie, Xiushan Wu, and Yun Deng
College of Life Sciences, Hunan Normal University, Changsha 410081, China

Received:August 14, 2009;Accepted:December 16, 2009

Supported by:National Natural Science Foundation of China(No.30671137), Postgraduate Scientific Innovation Fund of Hunan Province(No.CX2009B108).

Corresponding author:Yun Deng.Tel: +86-731-88872780; Fax: +86-731-88615078; E-mail: dengyun2008@yahoo.com.cn國家自然科學(xué)基金(No.30671137)，湖南省研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目(No.CX2009B108)資助。