酪丁酸梭菌代謝工程菌的構建及其發(fā)酵特性

楊貴清，劉剛，楊長得

1 深圳大學生命科學學院 深圳市微生物基因工程重點實驗室，深圳 518060 2 深圳市羅湖疾病預防控制中心，深圳 518020

酪丁酸梭菌代謝工程菌的構建及其發(fā)酵特性

楊貴清1,2，劉剛1，楊長得1

1 深圳大學生命科學學院 深圳市微生物基因工程重點實驗室，深圳 518060 2 深圳市羅湖疾病預防控制中心，深圳 518020

酪丁酸梭菌Clostridium tyrobutyricum可以利用葡萄糖、木糖、纖維二糖、阿拉伯糖等多種底物進行產(chǎn)酸發(fā)酵，主要發(fā)酵產(chǎn)物為丁酸和乙酸，是一種適合于木質纖維素同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)丁酸的菌種。將酪丁酸梭菌乙酸發(fā)酵關鍵基因取代為丁酸發(fā)酵關鍵基因來構建突變株，可使突變株丁酸發(fā)酵量增多，乙酸發(fā)酵量減少。分別獲得來源于丙酮丁醇梭菌的丁酸代謝關鍵酶基因——乙酰乙酰輔酶A轉移酶基因(thl)、來源于酪丁酸梭菌本身的乙酸代謝關鍵酶基因片段——磷酸轉乙?；富蚱?pta)和來源于質粒pIMP1的紅霉素抗性基因(em)。將它們與質粒pUC19相連構建為非復制性質粒pUC19-EPT。通過電轉化將其導入酪丁酸梭菌中。利用紅霉素抗性平板篩選獲得轉化子，通過PCR驗證發(fā)現(xiàn)，獲得的突變株染色體上pta被thl替換。在以葡萄糖為底物的發(fā)酵中，突變株丁酸得率為0.47，較野生型增大了34%，乙酸得率為0.05，較野生型下降了29%。

酪丁酸梭菌，丁酸，乙酰乙酰輔酶A轉移酶，磷酸轉乙?；?，代謝工程

Abstract:Clostridium tyrobutyricum is suitable for simultaneous saccharification and fermentation of lignocellulosic.It can produce butyric acid, acetic acid as its main fermentation products from a wide variety of carbohydrates such as glucose, xylose,cellobiose and arabinose.In order to decrease acetic acid content and increase butyric acid content in C.tyrobutyricum, we replaced genes on the acetic acid fermentation pathway with genes on the butyric acid fermentation pathway.Three genes were selected.They were acetyl-CoA acetylrtansfers gene(thl)which is the key enzyme gene associated with acetic acid fermentation pathway from Clostridium acetobutylicum, erythromycin gene(em)from plasmid pIMP1 and phosphotransacetylase gene(pta)which is the key enzyme gene associated with butyric acid fermentation pathway from C.tyrobutyricum.We fused these genes with pUC19 to construct nonreplicative integrated plasmids pUC19-EPT.Then we transformed pUC19-EPT into C.tyrobutyricum through electroporation.The recombinant transformants grown on plates containing erythromycin were validated by PCR.A mutant whose pta gene was displaced by thl gene on the chromosome was selected.In the fermentation from glucose, the mutant’s yield of butyric acid is 0.47, increased by 34% compared with wild type; and the yield of acetic acid is 0.05, decreased by 29%compared with wild type.

Keywords:Clostridium tyrobutyricum, butyric acid, acetyl coenzyme A acetyltransferase, phosphotransacetylase, metabolic engineering

正丁酸(分子式CH3(CH2)2COOH，以下簡稱為丁酸)是一種用途廣泛的化工原料和醫(yī)藥原料，可以用于各類丁酸酯類、丁酸纖維、清漆、香料等的生產(chǎn)制造，也可以用作乳化劑、殺菌劑和萃取劑[1]，還可作為組蛋白去乙?；傅囊种苿┮种贫喾N腫瘤細胞的增殖，誘導腫瘤細胞分化、衰老和調亡[2-4]。當前，丁酸工業(yè)化生產(chǎn)屬于石油加工行業(yè)，隨著石油資源的快速消耗，通過石油加工獲得丁酸必將受到原料來源的限制。通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)丁酸的傳統(tǒng)原料是富含淀粉的糧食，隨著全球可耕地的減少和人口的增長，全球范圍內的糧食短缺問題將不可避免，將來利用糧食作為原料發(fā)酵生產(chǎn)丁酸的規(guī)模必然受到限制。在這種情況下，利用木質纖維素為原料發(fā)酵生產(chǎn)丁酸將是可能的解決途徑。

梭菌中酸產(chǎn)物的代謝途徑已經(jīng)得到了較廣泛的研究，例如丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum和酪丁酸梭菌Clostridium tyrobutyricum[5-7]。乙酰輔酶A(Acetyl-CoA)是乙酸途徑和丁酸途徑的分支點，它在磷酸轉乙酰基酶的催化下形成磷酸乙酰開始乙酸代謝，在乙酰乙酰CoA轉移酶的催化下形成乙酰乙酰CoA開始丁酸代謝。研究也表明[7]，在酪丁酸梭菌發(fā)酵中，沒有乙醇、丁醇等醇類物質出現(xiàn)。其代謝途徑見圖1。

酪丁酸梭菌是主要的丁酸發(fā)酵菌之一，研究表明酪丁酸梭菌可以利用纖維二糖、木糖、阿拉伯糖等多種碳源進行發(fā)酵[8-9]，解決了木質纖維素同步糖化發(fā)酵中存在的五碳糖利用不足問題，特別適合于進行木質纖維素的同步糖化發(fā)酵。然而，酪丁酸梭菌的發(fā)酵產(chǎn)物不單一，除丁酸外還產(chǎn)生部分乙酸，雜酸的產(chǎn)生有可能降低整個發(fā)酵過程的效率。敲除突變可使宿主染色體中不受歡迎的基因失活，已經(jīng)成功地應用于構建梭菌屬代謝工程突變菌[10-11]。同樣的代謝工程方法也能在酪丁酸菌中用于減少或消除乙酸產(chǎn)物[12-13]。

本實驗構建了非復制性重組質粒轉入酪丁酸梭菌，對其進行遺傳改造，敲除其乙酸代謝關鍵酶基因pta，取代上來自丙酮丁醇梭菌丁酸代謝關鍵酶基因thl，獲得的酪丁酸梭菌代謝工程菌發(fā)酵產(chǎn)物丁酸得率提高，且產(chǎn)物較單一，為丁酸的工業(yè)化生產(chǎn)以及利用木質纖維素同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)丁酸提供了新的技術支撐，具有較主要的社會、經(jīng)濟意義。

1 材料和方法

1.1 菌株和質粒

表 1列舉了本研究所用到的菌株、質粒的來源及特點。野生株為酪丁酸菌ATCC 25755，在厭氧室中用加強型梭菌培養(yǎng)基(RCM)培養(yǎng)傳代，液體培養(yǎng)置于梭菌生長培養(yǎng)基(CGM)中，37℃、厭氧環(huán)境中培養(yǎng)[14]。在篩選突變株時，這些培養(yǎng)基中都加入了 50 μg/mL 的紅霉素(Erythromycin)。

圖1 酪丁酸梭菌的代謝途徑Fig.1 Metabolic pathway of C.tyrobutyricum.1: acetyl-CoA acetyltransferase(thl gene); 2: phosphotransacetylase(pta gene).

表1 菌株和質粒Table 1 Bacterial strains and plasmids

1.2 酪丁酸梭菌生長與發(fā)酵分析

挑取酪丁酸梭菌單菌落置于CGM液體培養(yǎng)基，于37℃厭氧箱中靜置培養(yǎng)24 h后，按5%的接種量轉接于新鮮的CGM液體培養(yǎng)基中，于37℃厭氧箱中靜置培養(yǎng)，每隔4 h左右取樣，記錄菌的生長情況、發(fā)酵液中殘余葡萄糖含量以及發(fā)酵產(chǎn)物中有機酸含量。為確保實驗數(shù)據(jù)準確可靠，每次發(fā)酵均進行平行實驗，具體做法為：分別挑取 3個單菌落于等體積CGM液體培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h制備種子培養(yǎng)液，再各按 5%的接種量將種子培養(yǎng)液轉接于 10份等體積新鮮的CGM液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，以平均數(shù)據(jù)作圖。

生長情況用600 nm下菌液吸光值表示，發(fā)酵液中殘余葡萄糖含量通過 3,5-二硝基水楊酸(DNS)比色法測定，有機酸含量采用氣相色譜分析。發(fā)酵結束后計算有機酸得率，其得率定義為發(fā)酵過程中每消耗 1 g葡萄糖生成的有機酸量。氣相色譜分析發(fā)酵產(chǎn)物方法如下：

色譜型號為 TRACE GC；色譜柱為：Agilent DB-624毛細管柱，30 m×0.32 mm；進樣口為：S/SL型；檢測器為FID檢測器；載氣為：N2。爐溫程序：初始溫度 40℃，2 min；10℃/min升溫；最終溫度210℃，2 min。FID 溫度：220℃。載氣恒流：1.5 mL/s。載氣N2流速為30 mL/min，氫氣流速為35 mL/min，空氣流速為350 mL/min；進樣器：自動進樣，不分流，進樣量為0.5 μL。

1.3 基因替換載體的構建

1.3.1 基因的分離

以酪丁酸梭菌基因組 DNA為模板，PCR擴增與乙酸代謝途徑關鍵酶——磷酸轉乙酰基酶基因片段pta；以丙酮丁醇梭菌基因組DNA為模板，PCR擴增與丁酸代謝途徑關鍵酶——乙酰乙酰CoA轉移酶基因thl；以pIMP1為模板，PCR擴增紅霉素基因em。將獲得的各基因片段連接T載體，構建成T-pta、T-thl、T-em載體，送英駿公司測序驗證。本研究所用引物序列見表2。

1.3.2 pUC19-EPT的構建

首先用EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切重組載體T-pta，回收約610 bp的DNA片段，純化連接到經(jīng)同樣處理的pUC19載體，構建成pUC19P；接著用SalⅠ和SphⅠ雙酶切重組載體T-thl，回收大小約1880 bp的DNA片段，純化后連接經(jīng)同樣處理的pUC19P載體，構建成pUC19PT；最后分別用Sph I和Aat Ⅱ分步單酶切重組載體T-em，回收大小約1000 bp的DNA片段，純化后連接經(jīng)同樣處理的pUC19PT載體，構建成pUC19-EPT。質粒物理圖譜如圖2。

1.4 酪丁酸梭菌的電轉

將酪丁酸梭菌接種于含 40 mmol/L DL-蘇氨酸的CGM培養(yǎng)基中，待其生長至OD ≈1.2時收集細胞。先用預先冰冷的無菌水洗滌2次，再用預冰冷的SMP電轉緩沖液(蔗糖 270 mmol/L，MgCl21 mmol/L，Na3PO47 mmol/L，pH 6.0)洗滌2次后，將細胞懸浮于預冰冷的電轉緩沖液中。將處理好的細胞懸浮液放入預冰冷的直徑為4 mm的電轉杯中，冰上放置4～5 min后加入25 μg非復制性質粒pUC19-EPT進行脈沖刺激(2500 V)。電擊后將轉化細胞轉入大概5 mL的CGM(不帶抗性)中37℃溫孵2～4 h，然后低速(約4000～6000 r/min)離心使細胞沉降，棄上清，留200 μL左右涂板(帶Em+50 μg/mL的 RCM固體培養(yǎng)基)。

表2 本研究所用引物Table 2 Primers used in this study

圖2 非復制性質粒pUC19-EPT的物理圖譜Fig.2 Physical map of nonreplicative integrational plasmids pUC19-EPT.The directions of each gene are shown by arrows;pta: the middle sequence of pta gene; thl: the full thl gene; amp:ampicillin resistance gene; em: erythromycin resistance gene;ori: the origin of replication in E.coli.

1.5 重組酪丁酸梭菌的篩選與鑒定

目標菌應是在染色體上整合了來自丙酮丁醇梭菌的thl基因，且原染色體上pta基因失活的重組菌株。因此，在篩選鑒定時，根據(jù)野生型酪丁酸梭菌無紅霉素抗性，利用重組質粒與酪丁酸梭菌染色體發(fā)生同源重組時，重組質粒上附帶的紅霉素抗性基因整合在染色體上使重組酪丁酸梭菌帶上紅霉素抗性基因來進行初篩。然后提取所獲得的轉化子的基因組DNA，進行相關PCR驗證。

1.6 重組酪丁酸梭菌的生理特性分析

重組酪丁酸梭菌生理特性分析主要包括3個方面，即其生長情況、底物利用情況和發(fā)酵情況，具體的分析方法與野生型酪丁酸梭菌分析方法相同。

2 結果與討論

2.1 酪丁酸梭菌生長與發(fā)酵分析

以葡萄糖為唯一碳源，于厭氧培養(yǎng)箱中37℃靜置培養(yǎng)酪丁酸梭菌，分析不同時相菌生長情況、底物利用情況以及發(fā)酵情況。結果見圖3。

結果表明，有機酸的發(fā)酵開始于對數(shù)生長期的后半段，在穩(wěn)定期開始大幅度生產(chǎn)，在穩(wěn)定期后期達到最大，發(fā)酵到50 h左右，發(fā)酵產(chǎn)物幾乎沒有增加。丁酸最大發(fā)酵量約為(5±0.09)g/L，乙酸約為(1±0.07)g/L。結合同期底物消耗，計算得出：酪丁酸梭菌發(fā)酵結束后，丁酸得率為(0.35±0.02)g/g，乙酸得率為(0.07±0.004)g/g。另外由于發(fā)酵產(chǎn)物主要是有機酸，酸的積累使pH值下降，菌體生長受到抑制，從而導致殘?zhí)呛枯^高，底物得不到完全利用。當在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入 1%固體碳酸鈣來中和發(fā)酵過程產(chǎn)生的有機酸時，發(fā)現(xiàn)糖的利用和發(fā)酵產(chǎn)物量都有一定提高(圖4)。發(fā)酵結束后，發(fā)酵液中并無葡萄糖殘余，此時丁酸的產(chǎn)量約為(6.56±0.1)g/L，乙酸的產(chǎn)量約為(1.34±0.06)g/L，丁酸得率(0.33±0.03)g/g，乙酸得率(0.07±0.005)g/g。

綜合比較說明，野生型酪丁酸梭菌在含 2%葡萄糖的 CGM 培養(yǎng)基中主要發(fā)酵產(chǎn)物只有丁酸和乙酸，無醇類，就發(fā)酵產(chǎn)物得率來看，酪丁酸梭菌是一種優(yōu)良的丁酸發(fā)酵菌。采用固體碳酸鈣來中和發(fā)酵過程產(chǎn)生的有機酸雖然有利于底物的充分利用，但由于少量丁酸和碳酸鈣生成固體絡合物，使丁酸得率有所下降，不能很好地反應丁酸的實際得率，因此后續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)基中均未添加碳酸鈣成份。

2.2 基因替換載體pUC19-EPT的構建與驗證

分別提取酪丁酸梭菌和丙酮丁醇梭菌基因組DNA以及質粒PIMP1，并以酪丁酸梭菌基因組DNA為模板，設計相應引物，通過PCR擴增目的基因片段pta，使pta上游含EcoRⅠ位點，下游含XbaⅠ位點；以丙酮丁醇梭菌基因組DNA為模板，設計相應引物，通過 PCR擴增目的基因 thl，使 thl 上游含SalⅠ位點，下游含SphⅠ位點；以質粒PIMP1為模板，設計相應引物，通過PCR擴增目的基因em1使em1上游含 EcoRⅠ位點，下游含AatⅡ位點。測序證實所獲得片段的正確性。

圖3 酪丁酸梭菌在CGM培養(yǎng)基中的發(fā)酵情況Fig.3 Fermentation of C.tyrobutyricum in CGM.(A)Growth and substrate consumption of C.tyrobutyricum.(B)Application of fermentation production of C.tyrobutyricum.□: growth curve; ■: substrate consumption curve; △: butyric acid; ▲:acetic acid.

圖4 酪丁酸梭菌在CGM-CaCO3培養(yǎng)基中的發(fā)酵情況Fig.4 Fermentations of C.tyrobutyricum in CGM-CaCO3.(A)Growth and substrate consumption of C.tyrobutyricum.(B)Application of fermentation production of C.tyrobutyricum.□:growth curve; ■: substrate consumption curve; △ : butyric acid;▲: acetic acid.

對基因片段 pta進行 EcoRⅠ、XbaⅠ雙酶切處理，純化后與經(jīng)同樣處理的pUC19相連，構建為重組質粒 pUC19P；然后對基因片段 thl進行 SalⅠ、SphⅠ雙酶切，純化后與經(jīng)同樣處理的pUC19P相連，構建為重組質粒 pUC19PT；對基因片段 em進行EcoRⅠ、AatⅡ分步單切處理，純化后與經(jīng)同樣處理的pUC19PT相連，構建為重組質粒pUC19-EPT。

提取重組質粒pUC19-EPT，以其為模板，用相應引物對進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離。pta基因片段的PCR產(chǎn)物約為600 bp，thl約為1880 bp，em約為1000 bp，與預期的大小一致(圖5)。測序證明其序列正確。

2.3 重組菌株的篩選與鑒定

從紅霉素抗性平板上挑出單克隆到 CGM Em+進行液體培養(yǎng)，提重組菌的基因組DNA。以基因組DNA為模板，根據(jù)質粒pUC19-EPT中thl基因兩翼設計引物進行PCR擴增，獲得大小為2 kb的片段(圖6)。對PCR產(chǎn)物進行測序證明，2 kb大小片段中包含完整的thl基因(1880 bp)。說明thl基因隨pta片段與染色體同源區(qū)域發(fā)生重組而整合到染色體上，其重組方式為單交換(圖7)。將該轉化子命名為酪丁酸梭菌ME。

2.4 重組菌的生理生化分析

將重組菌與野生型同時按 5%的接種量接種于含2%的葡萄糖的CGM中，厭氧搖瓶培養(yǎng)，定期取樣，檢測同時相的菌的生長、發(fā)酵液殘?zhí)呛亢桶l(fā)酵產(chǎn)物含量。結果見圖8。

圖5 重組質粒pUC19-EPT的PCR驗證Fig.5 Identification of recombinational plasmid pUC19-EPT by PCR.M: DNA marker; 1–3: PCR products of plasmid pUC19-EPT; 1: em; 2: pta; 3: thl.

圖6 pUC19-EPT電轉獲得的轉化子驗證Fig.6 Identification of the transformant obtained by transfer pUC19-EPT into C.tyrobutyricum through electroporation.M:DNA marker; 1: PCR products.

圖7 pUC19-EPT轉入酪丁酸梭菌發(fā)生的單交換Fig.7 Single crossover of plasmid pUC19-EPT containing pta gene with the chromosome.

結果表明，與野生菌相比，重組菌進入對數(shù)生長期、穩(wěn)定期的時間與野生菌類似，但由于丁酸產(chǎn)率提高其生長更快進入衰亡期；丁酸、乙酸等發(fā)酵產(chǎn)物均是在對數(shù)生長期后期開始出現(xiàn)，穩(wěn)定期開始大量生成，丁酸發(fā)酵量均是在40 h左右停止增加，乙酸發(fā)酵量在50 h左右停止增加。在發(fā)酵終液中，野生菌、重組菌丁酸發(fā)酵量分別為：(4.7±0.31)g/L、(5.8±0.17)g/L，丁酸得率分別為：(0.352±0.013)g/g、(0.471±0.021)g/g；乙酸發(fā)酵量分別為：(0.97±0.08)g/L、(0.63±0.06)g/L，乙酸得率分別為：(0.072±0.003)g/g、(0.051±0.004)g/g。重組菌與野生型相比，丁酸得率增長34%，乙酸得率下降29%。同時比較野生菌搖瓶發(fā)酵與野生菌靜置培養(yǎng)，結果發(fā)現(xiàn)搖瓶發(fā)酵菌的生長較迅猛，使發(fā)酵丁酸速度加快，導致pH值下降更快，最終丁酸發(fā)酵量有所下降。

本研究在Zhu等[13]的研究基礎上，用丁酸關鍵酶基因thl取代了乙酸關鍵酶基因pta，使發(fā)酵產(chǎn)物中丁酸得率進一步提高，而乙酸得率下降(表3)。說明以thl基因取代pta基因，使細胞在關閉磷酸轉乙?；傅谋磉_的同時提高了乙酰乙酰輔酶A轉移酶的表達量，從而使更多的底物流向丁酸發(fā)酵。另外乙酸發(fā)酵并未完全停止也表明細胞乙酸代謝途徑并非僅通過磷酸轉乙?；复呋粭l途徑。

圖8 野生型酪丁酸梭菌與重組菌的發(fā)酵情況Fig.8 Fermentations of wild type and recombination C.tyrobutyricum.(A)Growth curves of wild type and recombination C.tyrobutyricum.(B)Utilization of carbon sources by wild type and recombination C.tyrobutyricum.(C)Butyric acid output of wild type and recombination C.tyrobutyricum.(D)Acetic acid output of wild type and recombination C.tyrobutyricum.□: wild type;■: ME.

表3 不同菌株有機酸得率的比較Table 3 Comparison of organic acid yield from different strains

3 結論

作為重要的化工原料，全世界對丁酸的需求量非常大，2006年全球丁酸產(chǎn)量達到30 000噸，依然供不應求[1]。而石油資源匱乏進一步導致丁酸生產(chǎn)跟不上需求，利用生物發(fā)酵木質纖維素生產(chǎn)丁酸將是可能的解決途徑。

酪丁酸梭菌可以利用葡萄糖、木糖、纖維二糖、阿拉伯糖等多種底物進行產(chǎn)酸發(fā)酵，這在一定程度上解決了木質纖維素同步糖化發(fā)酵過程中五碳糖利用不充分的問題。但酪丁酸梭菌發(fā)酵過程也因副產(chǎn)物乙酸的出現(xiàn)而減少丁酸產(chǎn)量提高了產(chǎn)品純化費用。

本工作分析了酪丁酸梭菌生理生化特點，并在這個基礎上構建了非復制性替換載體pUC19-EPT，電轉進入酪丁酸梭菌，通過同源重組將酪丁酸梭菌染色體上 pta基因替換為來自丙酮丁醇梭菌的 thl基因，關閉乙酸代謝途徑中關鍵酶磷酸轉乙酰基酶基因(pta)的表達，并提高丁酸代謝過程中關鍵酶基因(thl)的表達量。同時對野生菌和重組菌進行發(fā)酵分析，發(fā)現(xiàn)所獲得的重組菌，其丁酸得率為0.47 g/g，與野生菌相比，增加了34%，乙酸得率為0.05 g/g，與野生菌相比，下降了29%。基因替換突變株的獲得為丁酸的化工生產(chǎn)轉型為木質纖維素同步糖化發(fā)酵提供了新的研究思路。

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Engineering and metabolic characteristics of a Clostridium tyrobutyricum strain

Guiqing Yang1,2, Gang Liu1, and Changde Yang1
1 Shenzhen Key Laboratory of Microbial Genetic Engineering, College of Life Sciences, Shenzhen University, Shenzhen 518060, China 2 Shenzhen Luohu Center For Disease Control Prevention, Shenzhen 518020, China

Received:August 14, 2009;Accepted:December 24, 2009

Corresponding author:Guiqing Yang.Tel: +86-755-25508339; Fax: +86-755-25611283; E-mail: hawk80459@sohu.com