深黃被孢霉利用不同碳源產(chǎn)油脂比較

邢大輝，潘安龍，薛冬樺，方鳴玉，谷冉峰

1 長春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，長春 130012 2 長春長生基因藥業(yè)股份有限公司，長春 130012

深黃被孢霉利用不同碳源產(chǎn)油脂比較

邢大輝1，潘安龍1，薛冬樺1，方鳴玉1，谷冉峰2

1 長春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，長春 130012 2 長春長生基因藥業(yè)股份有限公司，長春 130012

本研究主要探討深黃被孢霉M2菌株對生物質(zhì)全糖的利用，考察其碳源同化能力、不同碳源下產(chǎn)脂情況以及對玉米皮渣的利用能力。研究結(jié)果表明，M2菌株能夠利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和甘露糖進(jìn)行生長和油脂積累。M2菌株以6%糖濃度的玉米皮渣水解液為底物發(fā)酵培養(yǎng)，油脂微生物生物量達(dá)18.2 g/L，干菌體油脂含量45.7%，單位體積發(fā)酵液油脂產(chǎn)量為8.3 g/L。

深黃被孢霉，微生物油脂，生物質(zhì)，玉米皮渣，發(fā)酵

Abstract:Biomass carbohydrates assimilation and lipid accumulation by Mortierella isabellina M2 strain were investigated.Corn fiber hydrolysate was specially studied.The results showed M.isabellina M2 strain achieved growth and lipid accumulation while glucose, xylose, mannose and arabinose were introduced as single carbon source, respectively.When M.isabellina M2 strain was cultivated on corn fiber hydrolysate with 6% sugars concentration, the biomass reached 18.2 g/L, the lipid content of dry mycelia was 45.7%, and the lipid yield achieved 8.3 g/L.It provided a promising perspective for microbial oils production with biomass hydrolysates.

Keywords:Mortierella isabellina, microbial oil, biomass, corn fiber, fermentation

微生物油脂又稱單細(xì)胞油脂，是指某些微生物在一定條件下將碳水化合物、碳?xì)浠衔锖推胀ㄓ椭忍荚崔D(zhuǎn)化為菌體內(nèi)大量儲存的油脂。這些油脂一般占菌體干重的 20%以上[1]。產(chǎn)油脂微生物主要包括酵母、霉菌、微藻和細(xì)菌，其中以對酵母菌和絲狀霉菌的研究居多[2-4]，少數(shù)產(chǎn)油微生物能在胞內(nèi)積累超過細(xì)胞干重 70%的油脂。早期微生物油脂的研究主要集中在功能性油脂的開發(fā)上，隨著國際能源危機(jī)和國內(nèi)生物柴油產(chǎn)業(yè)所面臨的原料困境，以微生物油脂進(jìn)行生物柴油生產(chǎn)的研究日益受到關(guān)注[5-8]。

生物質(zhì)是植物通過光合作用生成的有機(jī)物，主要包括淀粉、纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等。國內(nèi)外以深黃被孢霉發(fā)酵生產(chǎn)油脂的研究多集中在以高濃度葡萄糖為營養(yǎng)碳源進(jìn)行油脂生產(chǎn)或提取 γ-亞麻酸[9-11]，而以半纖維素、纖維素等生物質(zhì)資源進(jìn)行的發(fā)酵產(chǎn)脂研究鮮有報道。本實(shí)驗(yàn)主要研究目的在于探討深黃被孢霉對生物質(zhì)全糖的利用，針對深黃被孢霉的廣譜碳源同化能力以及在不同碳源上的油脂積累情況進(jìn)行考察，并進(jìn)一步以玉米淀粉加工業(yè)副產(chǎn)物——玉米皮渣為原料，采用酶法、酸法協(xié)同水解后考察深黃被孢霉的生長和油脂積累情況，為其更廣泛的工業(yè)化應(yīng)用提供依據(jù)，使微生物油脂制備具有更廣泛的原料基礎(chǔ)，為緩解生物柴油產(chǎn)業(yè)的原料來源問題提供可替代的解決途徑。

1 材料與方法

1.1 菌株

深黃被孢霉Mortierella isabellina M2菌株，由長春工業(yè)大學(xué)工業(yè)微生物實(shí)驗(yàn)室提供，保存于土豆汁斜面培養(yǎng)基。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

碳源同化實(shí)驗(yàn)：(NH4)2SO4，0.2%；MgSO4，0.1%；KH2PO4，0.1%；K2HPO4，0.1%；瓊脂，1.5%；添加2%碳源于28℃培養(yǎng)。

碳源發(fā)酵產(chǎn)脂：(NH4)2SO4，0.2%；MgSO4，0.1%；KH2PO4，0.1%；K2HPO4，0.1%；添加6%碳源28℃、80 r/min振蕩培養(yǎng)。

玉米皮渣水解液：以玉米淀粉加工業(yè)副產(chǎn)物-玉米皮渣為原料(長春大成集團(tuán)提供)，經(jīng)近紅外光譜分析玉米皮渣中主要含有纖維素12.54%，半纖維素41.33%，淀粉 20.38%。應(yīng)用酶酸兩步法水解玉米皮渣，取1000 g玉米皮渣按固液比1:6加水混勻，先后加入淀粉酶和糖化酶水解后收集濾液，濾渣按固液比1:6加入0.5%鹽酸，100℃水解4 h，壓榨過濾?；旌蟽刹綖V液獲得玉米皮渣水解液10.6 L，調(diào)整糖濃度至 6%，添加 0.2%氮源，28℃、80 r/min好氧培養(yǎng)。

1.3 分析方法

1.3.1 掃描電鏡形態(tài)觀察

將 M2菌劃線接種于瓊脂平板培養(yǎng)基，并將滅菌的潔凈蓋玻片斜插于劃線處，28℃下培養(yǎng)96 h，附著于載玻片上的菌絲體經(jīng)鋨酸固定、脫水、干燥及表面鍍金后掃描電鏡下觀察，工作電壓為 25 kV。

1.3.2 玉米皮渣水解液單糖組成分析

島津LC-10AT高效液相色譜儀，示差折光檢測器，美國博樂87C色譜柱，流動相為高純水，流速0.6 mL/min；柱溫80℃；采用面積歸一法定量分析。玉米皮渣水解液含葡萄糖36.95%；D-木糖20.18%；L-阿拉伯糖42.52%；甘露糖0.35%，五碳糖含量達(dá)60%以上。

1.3.3 蘇丹Ⅲ染色方法

菌體涂片后，采用 3%蘇丹Ⅲ的 70%乙醇溶液染色 15 min，二甲苯洗脫，干燥后 0.5%沙黃復(fù)染15 min，水洗脫色至洗脫液無色，干燥后觀察。顯微鏡下菌絲體呈粉紅色，油脂顆粒呈亮黃色。

1.3.4 生物量測定

將發(fā)酵的培養(yǎng)物抽濾得到濕菌絲體，自然條件下干燥，即得干菌體，以g干菌體/L發(fā)酵液表示菌體生物量[12-13]。

1.3.5 油脂提取和測定

利用索氏提取法提取油脂，差重法測菌油量[13]。計(jì)算公式：油脂含量(%)=W1/W×100。式中W1為粗油量(g)，W為菌體干重(g)。

2 結(jié)果

2.1 M2菌株廣譜碳源的同化利用

天然木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)是由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素3大部分組成。纖維素水解產(chǎn)物葡萄糖易被微生物利用，是常規(guī)發(fā)酵碳源。半纖維素主要是五碳糖的聚合物，水解產(chǎn)物以D-木糖和L-阿拉伯糖為主。許多微生物，如釀酒酵母，不能發(fā)酵五碳糖生產(chǎn)酒精。因此，高效利用半纖維素水解產(chǎn)物是工業(yè)微生物研究中的重要課題。

以葡萄糖、D-木糖、甘露糖和L-阿拉伯糖為單一碳源，在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行 M2菌株的培養(yǎng)，考察其對各單糖的同化能力(圖1)。研究結(jié)果表明深黃被孢霉Mortierella isabellina 能夠在葡萄糖、D-木糖、甘露糖和L-阿拉伯糖為碳源的培養(yǎng)基上生長，此菌株不但可以利用六碳糖作為營養(yǎng)碳源，而且能夠利用五碳糖進(jìn)行生長繁殖，具有良好的廣譜碳源同化能力。

2.2 深黃被孢霉M2菌絲體的顯微觀察

深黃被孢霉屬絲狀真菌，在適宜的培養(yǎng)基內(nèi)生長后菌絲粗壯且分叉較多，具有很多藕節(jié)狀膨大，內(nèi)含豐富油脂顆粒。掃描電鏡圖見圖2，參照經(jīng)蘇丹III染色的菌絲體(圖3)，可以推斷菌絲體內(nèi)呈亮白色的區(qū)域?yàn)橛椭蚊芗瘏^(qū)。

2.3 不同碳源下M2菌株中的油脂積累

分別以葡萄糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖和玉米皮渣水解液為碳源進(jìn)行液體培養(yǎng)，采用蘇丹Ⅲ染色法染色后鏡檢(圖3)。由圖可見，無論以五碳糖和六碳糖，或玉米皮渣水解液培養(yǎng)，M2菌株的菌絲體都有很多藕節(jié)狀膨大，明黃色脂肪滴清晰可見，尤其在菌絲的分叉處和菌絲體膨大處油脂積累明顯，按體積估算約占整個菌絲體的 50%。由此提示深黃被孢霉M2菌株在五碳糖、六碳糖和玉米皮渣水解液中培養(yǎng)后，油脂積累豐富，具有廣泛的應(yīng)用前景。

2.4 不同碳源對M2菌株發(fā)酵產(chǎn)脂的影響

圖1 深黃被孢霉廣譜碳源同化能力Fig.1 Broad-spectrum carbon sources assimilation by Mortierella isabellina.(a)Glucose.(b)Xyloses.(c)Mannose.(d)Alabinose.

圖2 深黃被孢霉M2菌株的掃描電鏡顯微圖Fig.2 Micrograph of M2 strain by SEM.(a)200×.(b)500×.(c)1000×.(d)1500×.(e)2000×.(f)3000×.

圖3 不同碳源下油脂積累的蘇丹Ⅲ染色觀察(1000×)Fig.3 Mortierella isabellina stained with Sudan III culturing with various carbon sources(1000×).(a)Glucose.(b)Xylose.(c)Mannose.(d)Arabinose.(e)Corn fiber hydrolysate.

分別以 6%糖濃度的葡萄糖、D-木糖、甘露糖、L-阿拉伯糖和玉米皮渣水解液為碳源，添加(NH4)2SO4氮源后發(fā)酵培養(yǎng) 96 h，結(jié)果見表 1。結(jié)果顯示，深黃被孢霉在葡萄糖為碳源時其油脂含量最高，達(dá)到66%，油脂產(chǎn)量達(dá)到6.9 g/L。以玉米皮渣水解液為發(fā)酵底物時其生物量和油脂含量分別達(dá)到 18.2 g/L和45.7%，與單糖碳源比較，玉米皮渣水解液獲得較高的生物量，其原因可能是由于玉米皮渣中含有利于菌體生長的生物素類物質(zhì)，有效促進(jìn)了菌體的生長繁殖，同時以玉米皮渣水解液培養(yǎng)時其油脂產(chǎn)量最高，達(dá)到8.3 g/L，表明M2菌株發(fā)酵生物質(zhì)全糖進(jìn)行油脂積累具有明顯的優(yōu)勢和良好的工業(yè)潛力。

與國內(nèi)外同類研究比較(表 2)，在以工業(yè)副產(chǎn)物為發(fā)酵基質(zhì)進(jìn)行微生物油脂代謝合成的研究中，深黃被孢霉 M2菌株獲得了較高的油脂產(chǎn)量。對于玉米淀粉加工業(yè)每年產(chǎn)生的大量玉米皮渣而言，本研究結(jié)果拓展了其應(yīng)用范圍，提高了生物質(zhì)資源的經(jīng)濟(jì)價值，同時可為生物柴油產(chǎn)業(yè)提供豐富的油脂資源，表現(xiàn)出良好的工業(yè)應(yīng)用前景。

表1 不同碳源發(fā)酵培養(yǎng)a,bTable 1 Fementation with various carbon sourcesa,b

表2 不同微生物利用工農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物油脂積累研究Table 2 Lipid production on agro-industrial residues by various microorganisms

3 討論

碳源是微生物生長繁殖和代謝的主要營養(yǎng)物質(zhì)，多數(shù)微生物對葡萄糖具有良好的利用能力，而對于木糖、阿拉伯糖等五碳糖的利用能力卻有很大區(qū)別。深黃被孢霉M2菌株能夠同化六碳糖(葡萄糖、甘露糖)和五碳糖(木糖、阿拉伯糖)進(jìn)行油脂積累，表現(xiàn)出良好的生物質(zhì)全糖利用能力，為理想的油脂微生物。

玉米皮渣是濕法生產(chǎn)玉米淀粉的副產(chǎn)物，約占玉米加工量的10%，主要含有淀粉、纖維素和半纖維素等組分，其中半纖維素和纖維素的比例超過50%，是典型的既含有五碳多聚糖又含有六碳多聚糖的生物質(zhì)資源。深黃被孢霉M2菌株能夠利用玉米皮渣水解液中的生物質(zhì)全糖進(jìn)行生長和油脂積累，以6%水解糖為底物發(fā)酵時，其油脂含量和生物量分別達(dá)到了45.7%和18.2 g/L。

因此，采用深黃被孢霉為生產(chǎn)菌株，以纖維素類生物質(zhì)資源為原料進(jìn)行油脂生產(chǎn)，具有廣泛的工業(yè)化應(yīng)用前景，不但能夠提高廢棄生物質(zhì)資源的利用效益，降低環(huán)境污染和減少資源浪費(fèi)，還可為生物柴油產(chǎn)業(yè)提供來源更為廣泛的油脂資源，為其產(chǎn)業(yè)發(fā)展所面臨的原料瓶頸提供解決途徑。

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Biomass carbohydrates assimilation and lipid accumulation by Mortierella isabellina

Dahui Xing1, Anlong Pan1, Donghua Xue1, Mingyu Fang1, and Ranfeng Gu2
1 School of Chemistry and Life Science, Changchun University of Technology, Changchun 130012, China 2 Changchun Changsheng Gene Pharmaceutical Company Limited, Changchun 130012, China

Received:September 10, 2009;Accepted:November 13, 2009

Supported by:Foundation of Department of Education of Jilin Province(No.2008100), Foundation of Bureau of Science and Technology of Changchun City(No.2009035).

Corresponding author:Donghua Xue.Tel:+86-431-85716471; E-mail: xuedonghua@mail.ccut.edu.cn吉林省教育廳科技重點(diǎn)項(xiàng)目(No.2008100)，長春市科技局科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(No.2009035)資助。