阿曼原油和溢油分散劑對(duì)斑馬魚(yú)(Danio rerio)胚胎形態(tài)發(fā)育的毒性效應(yīng)

李西山，姜曦，丁光輝，馬心蕊，齊志鑫，熊德琪

大連海事大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，大連 116026

原油及其煉制品引起的油污染是造成水生生態(tài)系統(tǒng)污染的重要來(lái)源之一。來(lái)自海上運(yùn)輸、海上鉆井開(kāi)采、溢油事故等的石油化合物釋放至水體中，會(huì)嚴(yán)重危害水生生態(tài)環(huán)境并嚴(yán)重危及潛鳥(niǎo)類(lèi)[1]、濱鳥(niǎo)類(lèi)[2]、無(wú)脊椎動(dòng)物[3]、哺乳動(dòng)物[4]和紅樹(shù)林[5]等水生生物的生存。為盡快清理溢油減小其對(duì)環(huán)境的影響，化學(xué)溢油分散劑越來(lái)越廣泛地被應(yīng)用到溢油事故應(yīng)急預(yù)案中?，F(xiàn)在常用的化學(xué)溢油分散劑是陰性和中性表面活性劑的烴類(lèi)混合物，其原理是減弱油水之間的界面張力，在極小的波浪作用或湍流情況下使得油分散成小油滴(<70 μm)進(jìn)入到水體中[6]。研究表明，大多數(shù)溢油分散劑本身是微毒的[7-8]。因其帶來(lái)的潛在危害尚不清楚[9]，故溢油分散劑的使用仍存在爭(zhēng)議。

斑馬魚(yú)(Danio rerio)作為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織(International Organization for Standardization, ISO)和經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(the Organization for Economic Co-operation and Development, OECD)等權(quán)威機(jī)構(gòu)認(rèn)可的經(jīng)典模式生物之一，近年來(lái)越來(lái)越廣泛地應(yīng)用在生態(tài)毒理學(xué)評(píng)估中。斑馬魚(yú)胚胎毒理試驗(yàn)，因其試驗(yàn)周期短、培養(yǎng)簡(jiǎn)便和易觀察等特點(diǎn)，逐漸應(yīng)用于評(píng)估污染物誘導(dǎo)硬骨魚(yú)胚胎早期發(fā)育毒性效應(yīng)[10-11]。目前，大多數(shù)研究都是基于幾個(gè)發(fā)育終點(diǎn)(如孵化、卵黃吸收和心率等)和致死率計(jì)算半數(shù)最大效應(yīng)濃度(EC50)或半數(shù)致死濃度(LC50)，卻沒(méi)有一個(gè)系統(tǒng)性標(biāo)準(zhǔn)來(lái)完整地評(píng)估胚胎形態(tài)發(fā)育狀況。為此Hermsen等[10]制定了斑馬魚(yú)胚胎—幼魚(yú)毒性暴露0～72 hpf形態(tài)學(xué)得分系統(tǒng)(General Morphology Score System, GMS)，該系統(tǒng)包含12個(gè)亞致死形態(tài)學(xué)終點(diǎn)，使得評(píng)估工作更為準(zhǔn)確化、系統(tǒng)化和標(biāo)準(zhǔn)化。而有研究報(bào)道指出斑馬魚(yú)胚胎—幼魚(yú)發(fā)育過(guò)程中，至72 hpf時(shí)主要器官發(fā)育完成，到120 hpf時(shí)斑馬魚(yú)幼魚(yú)才發(fā)育完全[12-13]；Jomaa等[7]研究甲狀腺活化物暴露對(duì)斑馬魚(yú)胚胎—幼魚(yú)毒性效應(yīng)時(shí)指出暴露至120 hpf的形態(tài)發(fā)育及致畸數(shù)據(jù)的可靠性高于72 hpf。

因此，本研究選取斑馬魚(yú)胚胎作為受試生物，采用半靜態(tài)急性暴露(0～120 hpf)的方法，應(yīng)用斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育毒性試驗(yàn)形態(tài)學(xué)得分系統(tǒng)(GMS)探討阿曼原油的水溶組分(water-accommodated fractions, WAF)、化學(xué)增強(qiáng)型水溶組分(chemically enhanced water-accommodated fractions, CEWAF)和化學(xué)濃縮型溢油分散劑(GM-2)對(duì)斑馬魚(yú)胚胎—幼魚(yú)形態(tài)發(fā)育的毒性效應(yīng)，并評(píng)估溢油分散劑的應(yīng)用對(duì)于水體環(huán)境造成的風(fēng)險(xiǎn)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

儀器：IX73型研究級(jí)倒置顯微鏡(日本奧林巴斯(Olympus)公司)，斑馬魚(yú)飼養(yǎng)系統(tǒng)ZebTec Active Blue(意大利泰百尼斯(Tecniplast)公司)，MGC-400B型光照培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)，EMS-10型磁力攪拌器(天津歐諾儀器股份有限公司)，F(xiàn)A1004型精密電子分析天平(上海衡平儀器儀表廠)，紫外分光光度計(jì)Epoch 2(美國(guó)寶特(Bio-Tek)公司)，Costar 24孔板(美國(guó)康寧(Corning)公司)，7103型單凹載玻片(帆船牌)，15 mm×60 mm玻璃培養(yǎng)皿(葡萄牙Normax公司)。

試劑：阿曼原油購(gòu)自大連石化公司，GM-2化學(xué)濃縮型溢油分散劑購(gòu)自青島光明環(huán)保技術(shù)有限公司(經(jīng)查詢(xún)其主要成分為乙二醇單丁醚、有機(jī)磺酸鹽和丙二醇等)，CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、NaHCO3、KCl和C6H14(均為分析純(AR))均購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，H2SO4(含量95%～98%，分析純(AR))購(gòu)自天津市化學(xué)試劑一廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用斑馬魚(yú)(Danio rerio，AB系)，購(gòu)自武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院水產(chǎn)科學(xué)研究所，雌雄分開(kāi)，飼養(yǎng)于ZebTec Active Blue系統(tǒng)。生長(zhǎng)環(huán)境參數(shù)：光暗周期14 h∶10 h，溫度(27.5 ± 0.5) ℃，pH 7.5 ± 0.5，電導(dǎo)率(550 ± 50) μS·cm-1，溶解氧≥80%，同時(shí)設(shè)定飼養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)水每天更新20%[14]。每天固定時(shí)間喂食2次，分別喂食新鮮孵化36 h的豐年蝦(Artemia salina)幼蟲(chóng)(購(gòu)自四川亞峰生物公司)和TetraMin營(yíng)養(yǎng)薄片飼料(德國(guó)德彩(Tetra)公司)。

1.3 斑馬魚(yú)受精卵的采集

暴露實(shí)驗(yàn)前1 d，暗周期開(kāi)始前30 min內(nèi)，將健康且達(dá)到性成熟的成魚(yú)按照雌雄比例1:2放入繁殖缸內(nèi)，并用隔板隔開(kāi)，置于光照培養(yǎng)箱中。暴露實(shí)驗(yàn)當(dāng)天給光5 min內(nèi)抽掉隔板，讓其交配；待1 h后，用3 mL吸管將魚(yú)卵吸出，并用27.5 ℃干凈的水清洗魚(yú)卵，在顯微鏡下篩選發(fā)育正常的受精卵。

1.4 暴露實(shí)驗(yàn)

1.4.1 WAF和CEWAF的制備

WAF和CEWAF的制備方法是在Singer等[15]的方法基礎(chǔ)上加以修正的。WAF制備方法如下：將阿曼原油和水按質(zhì)量體積比10 g∶1 L置于10 L的玻璃吸氣瓶?jī)?nèi)(留出20%上層空間)，用磁力攪拌器以低能、恒定的轉(zhuǎn)速(100 r·min-1，無(wú)渦流)避光攪拌23.5 h，靜置30 min后分離下層水相即為WAF儲(chǔ)存液。CEWAF制備方法如下：將阿曼原油和水按質(zhì)量體積比10 g∶1 L置于10 L的玻璃吸氣瓶?jī)?nèi)(留出20%上層空間)，以低能、恒定的轉(zhuǎn)速(25%～30%渦流)攪拌，速度達(dá)到穩(wěn)定后，加入20 g GM-2型溢油分散劑，避光攪拌18 h，靜置6 h后分離下層水相即為CEWAF儲(chǔ)存液。為保證WAF和CEWAF儲(chǔ)存液中組分的穩(wěn)定性，置于4 ℃內(nèi)避光密封保存。

1.4.2 暴露方法

根據(jù)OECD魚(yú)類(lèi)急性毒性試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)，選取半靜態(tài)暴露方法。暴露實(shí)驗(yàn)時(shí)，將WAF和CEWAF儲(chǔ)存液用標(biāo)準(zhǔn)稀釋水稀釋至20%、40%、60%、80%和100%這5個(gè)濃度；標(biāo)準(zhǔn)稀釋水是參照ISO 7346-2:1996標(biāo)準(zhǔn)配制的[16]，具體成分含量如表1。每個(gè)濃度組設(shè)3個(gè)重復(fù)。篩選受精且發(fā)育良好的魚(yú)卵(8-細(xì)胞期)進(jìn)行暴露實(shí)驗(yàn)，選用24孔細(xì)胞培養(yǎng)板作為暴露容器，每孔注入相應(yīng)濃度的工作液3.5 mL，每孔吸入1枚受精卵，并置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行孵化，光暗周期14 h∶10 h，溫度(27.5 ± 0.5) ℃，暴露至120 hpf (hour post-fertilization)。暴露期間，每孔內(nèi)工作液每天更新80%(2.8 mL)。為了確保試驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性，以上暴露實(shí)驗(yàn)連續(xù)重復(fù)3次。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)期間，不喂食。

1.4.3 致死率和形態(tài)學(xué)評(píng)估

胚胎暴露24、48、72、96和120 hpf時(shí)，在顯微鏡下觀察并記錄各組的致死率、孵化率和畸形率(包括卵黃水腫、心包水腫、尾部畸形和背部畸形等)。本研究采用的形態(tài)學(xué)得分系統(tǒng)(GMS)是在Hermsen等[10]制定的0～72 hpf形態(tài)學(xué)得分系統(tǒng)的基礎(chǔ)上加以修正的，將暴露時(shí)間延長(zhǎng)至120 hpf，觀察阿曼原油對(duì)斑馬魚(yú)胚胎—幼魚(yú)整個(gè)發(fā)育階段的影響。GMS系統(tǒng)包含12個(gè)亞致死形態(tài)學(xué)終點(diǎn)(如表2所示)，通過(guò)GMS得分高低評(píng)估油暴露對(duì)斑馬魚(yú)胚胎形態(tài)發(fā)育的毒性效應(yīng)。GMS得分越低，代表胚胎發(fā)育越慢；相反，得分越高，代表胚胎發(fā)育越快。

1.5 總石油烴(TPH)的測(cè)定

本研究是根據(jù)國(guó)標(biāo)GB173178.4—2007《海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范》應(yīng)用紫外分光光度法測(cè)定WAF和CEWAF中的總石油烴(total petroleum hydrocarbons, TPH)的濃度[17]。油標(biāo)準(zhǔn)使用溶液(200 μg·mL-1)使用時(shí)現(xiàn)配，以正己烷為參比，測(cè)定吸光值并繪制油標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。水樣經(jīng)硫酸酸化處理，加入正己烷，萃取2次。將2次萃取液合并于比色管中，定容。測(cè)定在225 nm波長(zhǎng)處的吸光值A(chǔ)，以正己烷為參比計(jì)算水樣中油濃度。為保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，CEWAF的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)用阿曼原油與GM-2混合制備的標(biāo)準(zhǔn)使用液(200 μg·mL-1)制定。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

通過(guò)IBM SPSS 21.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組數(shù)據(jù)通過(guò)單因素方差分析(analysis of variance, ANOVA)比較各暴露組與對(duì)照組之間的差異顯著性；數(shù)據(jù)差異顯著性水平由P值體現(xiàn)，P>0.05表明2組數(shù)據(jù)之間無(wú)顯著性差異；P≤0.05表明2組數(shù)據(jù)之間有顯著性差異，用*表示；P≤0.01表明2組數(shù)據(jù)之間有顯著差異，用**表示。

2 結(jié)果(Results)

2.1 阿曼原油WAF和CEWAF暴露120 hpf對(duì)斑馬魚(yú)胚胎—幼魚(yú)致死率的影響

不同稀釋比阿曼原油WAF和CEWAF暴露對(duì)斑馬魚(yú)胚胎—幼魚(yú)致死率隨時(shí)間變化情況如圖1所示。120 hpf時(shí)，GM-2溢油分散劑(圖1 B GM-2)暴露對(duì)斑馬魚(yú)胚胎—幼魚(yú)的致死率(5.2%±1.7%)略高于水(圖1 A Water)的致死率(1.0%±0.8%)，但無(wú)顯著差異(P>0.05)。與對(duì)照組(分別為Water和GM-2)比較，WAF(圖1 A)和CEWAF(圖1 B)各組的致死率均有不同程度的升高，并且隨著稀釋比的增加和暴露時(shí)間的增長(zhǎng)，致死率逐漸升高。WAF各組的致死率均未達(dá)到50%致死率，100% WAF的致死率為30.2%±2.8%；CEWAF暴露下(圖1 B)，與對(duì)照組(GM-2)比較，48～96 hpf致死率出現(xiàn)不同程度的顯著增加，96～120 hpf增加趨勢(shì)趨于平緩；40%、60%、80%和100% CEWAF組在120 hpf時(shí)致死率分別達(dá)到51.4%±3.3%、74.2%±7.3%、94.4±3.2%和98.7%±1.6%，均已超過(guò)半數(shù)致死率(50%)。

表1 標(biāo)準(zhǔn)稀釋水的成分Table 1 Composition of standard dilution water

表2 一般形態(tài)學(xué)得分系統(tǒng)Table 2 General morphology score (GMS) system

圖1 阿曼原油水溶組分(WAF)和化學(xué)增強(qiáng)型水溶組分(CEWAF)暴露0～120 hpf對(duì)斑馬魚(yú)胚胎—幼魚(yú)致死率Fig. 1 The lethality of zebrafish embryo-larva from 0 to 120 hpf after exposure to water-accommodated fractions of Oman crude oil (WAF) and chemically enhanced water-accommodated fractions (CEWAF)

圖2 不同稀釋比WAF和CEWAF暴露至120 hpf對(duì)斑馬魚(yú)胚胎—幼魚(yú)致死率的影響Fig. 2 The lethality of zebrafish embryo-larva at 120 hpf after exposure to WAF and CEWAF

根據(jù)急性暴露實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，使用SPSS對(duì)WAF和CEWAF的數(shù)據(jù)進(jìn)行劑量-效應(yīng)關(guān)系(dose-response relationship)分析，得出WAF和CEWAF的劑量效應(yīng)關(guān)系曲線(xiàn)如圖2所示。

為得到CEWAF的半數(shù)致死濃度LC50，CEWAF稀釋比/TPH濃度與斑馬魚(yú)胚胎致死率之間的劑量-效應(yīng)擬合方程如表2所示；CEWAF暴露120 hpf時(shí)對(duì)斑馬魚(yú)胚胎—幼魚(yú)的LC50為153.318 mg·L-1(38.9% CEWAF)。

2.2 阿曼原油WAF和CEWAF暴露120 hpf對(duì)斑馬魚(yú)胚胎孵化率的影響

不同稀釋比阿曼原油WAF和CEWAF暴露至120 hpf對(duì)斑馬魚(yú)胚胎孵化率影響隨時(shí)間變化情況如圖3所示。正常發(fā)育的胚胎在48～72 hpf時(shí)基本孵化完成(100%±0%，圖3 A Water)，GM-2組(120 hpf時(shí)，97.9%±2.4%，圖3 B GM-2)暴露的斑馬魚(yú)胚胎—幼魚(yú)的孵化率略低于對(duì)照組(Water)，但無(wú)顯著差異(P>0.05)。與對(duì)照組(分別為Water和GM-2)比較，WAF(圖3 A)和CEWAF(圖3 B)各組的孵化率均有不同程度的降低；并且隨著稀釋比的增加和暴露時(shí)間的增長(zhǎng)，孵化速度逐漸下降。120 hpf時(shí)，相比于對(duì)照組(Water)，20% WAF組的孵化率(59.5%±3.9%)顯著性降低(P≤0.05)，≥40% WAF各個(gè)組的孵化率均顯著降低(P≤0.01)，其中100% WAF的孵化率低至11.9%±4.4%；CEWAF各組的孵化率均低于對(duì)照組(GM-2)且有顯著性差異(P≤0.01)，其中60%和80% CEWAF的孵化率接近于0%(分別為5.2%±4.0%和3.1%±1.0%)，100% CEWAF組均未孵化。同時(shí)，CEWAF各稀釋組的孵化率均低于對(duì)應(yīng)的WAF稀釋組。

圖3 WAF和CEWAF暴露0～120 hpf對(duì)斑馬魚(yú)胚胎孵化率的影響Fig. 3 The hatching rate of zebrafish embryo from 0 to 120 hpf after exposure to WAF and CEWAF

劑量-效應(yīng)Dose-response關(guān)系方程RelationshipequationR2LC50CEWAF-致死率CEWAF-Lethality0.99438.9%CEWAFTPH-致死率TPH-Lethality0.993153.318mg·L-1

注：CEWAF表示阿曼原油化學(xué)增強(qiáng)型水溶組分，TPH表示水樣中的總石油烴。

Note: CEWAF stands for chemically enhanced water-accommodated fractions of Oman crude oil; TPH stands for total petroleum hydrocarbons of water sample.

2.3 阿曼原油WAF和CEWAF暴露120 hpf對(duì)斑馬魚(yú)胚胎的畸形率的影響

不同稀釋比阿曼原油WAF和CEWAF暴露至120 hpf時(shí)斑馬魚(yú)胚胎總畸形率的變化如表3所示。相比于對(duì)照組，各個(gè)暴露組均出現(xiàn)不同程度的畸形現(xiàn)象，這表明阿曼原油WAF和CEWAF暴露會(huì)對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育及組織器官分化產(chǎn)生影響。60%、80%和100% WAF暴露組畸形率顯著高于對(duì)照組(Water)(P≤0.05)，其他各組無(wú)顯著性差異；40% CEWAF的畸形率顯著高于對(duì)照組(GM-2)(P≤0.05)，60%、80%和100% WAF畸形率顯著高于對(duì)照組(GM-2)(P≤0.01)。GM-2組畸形率高于對(duì)照組(Water)但無(wú)顯著性差異(P>0.05)；同時(shí)，CEWAF各稀釋組的畸形率均高于對(duì)應(yīng)的WAF稀釋組。

同時(shí)，觀察發(fā)現(xiàn)致畸現(xiàn)象主要表現(xiàn)為心包水腫、卵黃水腫、身體彎曲和尾部彎曲這4個(gè)方面。由圖4 A可知，相比于對(duì)照組(Water)，僅100% WAF的心包水腫率和卵黃水腫率顯著升高(P≤0.05)；80%和100% WAF背部彎曲顯著升高(P≤0.01)；60%和80% WAF組尾部彎曲顯著升高(P≤0.05)，100% WAF組尾部彎曲顯著升高(P≤0.01)。而CEWAF(圖4 B)暴露造成的心包水腫、卵黃水腫、身體彎曲和尾部彎曲等均要高于對(duì)應(yīng)的WAF(圖4 A)。相比于對(duì)照組(GM-2)，60%、80%和100% CEWAF心包水腫顯著升高(P≤0.01)；60% CEWAF組卵黃水腫顯著升高(P≤0.05)，80%和100% CEWAF卵黃水腫顯著升高(P≤0.01)；40% CEWAF背部彎曲顯著升高(P≤0.05)，60%、80%和100% CEWAF背部彎曲顯著升高(P≤0.01)；60%、80%和100% CEWAF尾部彎曲顯著升高(P≤0.01)。

圖4 不同稀釋比WAF和CEWAF暴露至120 hpf對(duì)斑馬魚(yú)胚胎4個(gè)畸形終點(diǎn)的影響Fig. 4 The malformation ratios of zebrafish embryo at 120 hpf after exposure to WAF and CEWAF

組別Group心包水腫/%Pericardialedema/%卵黃水腫/%Yolkedema/%背部彎曲/%Dorsalmalformation/%尾部彎曲/%Tailmalformation/%總畸形率/%Malformationratios/%Water0000020%WAF1.5±1.302.8±2.21.4±1.22.8±2.540%WAF4.2±0.3020.9±2.015.0±5.523.6±2.960%WAF6.4±3.21.5±1.121.1±2.929.1±2.0*32.0±1.2*80%WAF26.5±5.05.6±2.846.9±4.1**33.4±1.6*56.5±3.6**100%WAF54.3±2.4**33.3±1.8*70.4±1.3**60.9±1.4**66.8±4.2**GM-21.5±1.00001.5±1.020%CEWAF11.5±3.0011.4±5.85.0±2.918.1±4.940%CEWAF13.8±5.111.8±4.826.1±2.3*58.3±11.532.0±6.4*60%CEWAF58.1±1.0**39.8±3.9*53.7±3.5**58.3±4.7**63.9±10.4**80%CEWAF82.6±6.0**74.7±4.5**81.8±2.9**78.8±6.4**86.1±8.7**100%CEWAF96.3±3.7**83.7±2.7**100.0±6.6**92.1±4.0**97.2±4.8**

注：WAF和CEWAF分別表示阿曼原油水溶組分和化學(xué)增強(qiáng)型水溶組分；*P≤0.05、**P≤0.01，指2組數(shù)據(jù)有顯著性差異。

Note: WAF and CEWAF stand for water-accommodated fractions and chemically enhanced water-accommodated fractions of Oman crude oil;*P≤0.05,**P≤0.01, significant difference between two group.

2.4 阿曼原油WAF和CEWAF暴露120 hpf對(duì)斑馬魚(yú)胚胎—幼魚(yú)發(fā)育GMS的影響

不同稀釋比阿曼原油WAF和CEWAF暴露至120 hpf時(shí)對(duì)斑馬魚(yú)胚胎—幼魚(yú)發(fā)育GMS的影響情況如圖5 A所示。由圖可知，隨著稀釋比的增加，WAF和CEWAF暴露均會(huì)造成GMS的降低；且CEWAF暴露的GMS比WAF暴露下降幅度更大。相比于對(duì)照組(Water)，60% WAF組GMS顯著低于對(duì)照組(Water)(P≤0.05)，80%和100% WAF組GMS更低且有顯著性差異(P≤0.01)，其他各組無(wú)顯著性差異。GM-2組GMS略低于Water組但無(wú)顯著性差異(P>0.05)；20% CEWAF組的GMS低于對(duì)照組(GM-2)但無(wú)顯著性差異(P>0.05)；40% CEWAF組GMS顯著低于對(duì)照組(GM-2)(P≤0.05)；而≥60% CEWAF組低于對(duì)照組(GM-2)且有顯著性差異(P≤0.01)。

同時(shí)，將GMS系統(tǒng)中的12個(gè)亞致死形態(tài)學(xué)終點(diǎn)得分進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后繪制成熱圖(heat-map)分析(如圖5 B所示，紅色為0，綠色為1)。由圖可知，GM-2各個(gè)形態(tài)學(xué)終點(diǎn)數(shù)值均略低于Water組，WAF和CEWAF暴露至120 hpf對(duì)斑馬魚(yú)幼魚(yú)的孵化、魚(yú)鰾形成、心跳、血液循環(huán)和行動(dòng)的影響最為顯著。

圖5 不同稀釋比WAF和CEWAF暴露至120 hpf對(duì)斑馬魚(yú)胚胎—幼魚(yú)發(fā)育GMS得分的影響Fig. 5 The GMS of zebrafish embryo-larva at 120 hpf after exposure to WAF and CEWAF

圖6 TPH測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(A)和TPH濃度結(jié)果(B)Fig. 6 The standard curve of TPH concentration (A) and the actual TPH concentration of WAF and CEWAF (B)

2.5 TPH結(jié)果

對(duì)阿曼原油WAF和CEWAF中TPH的測(cè)定結(jié)果如圖6所示。圖6 A是WAF和CEWAF水樣的吸光值與TPH濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(范圍0～25 mg·L-1)。測(cè)得WAF和CEWAF水樣中的TPH濃度值如圖6 B所示，100% WAF水樣中TPH濃度為(5.233±0.213) mg·L-1，加入GM-2溢油分散劑后CEWAF的TPH濃度顯著增加，20% CEWAF的TPH濃度為(48.214±7.738) mg·L-1，100% CEWAF中TPH的濃度高達(dá)(292.989±11.905) mg·L-1。

3 討論(Discussion)

近年來(lái)，渤海灣蓬萊19-3油田漏油事故、大連中石油原油泄漏事故和大連新港輸油管爆炸等大規(guī)模溢油事故的發(fā)生，造成大量原油進(jìn)入水體中，對(duì)周邊水生生態(tài)環(huán)境和水生生物產(chǎn)生嚴(yán)重危害。溢油分散劑因其能夠快速清理溢油減小對(duì)水生生態(tài)環(huán)境的影響，被逐步應(yīng)用于處理溢油事故應(yīng)急預(yù)案中[6]。然而，隨著溢油分散劑廣泛使用而所引發(fā)的一系列新的環(huán)境問(wèn)題也日益顯現(xiàn)，溢油分散劑處理溢油對(duì)水生生物的毒性及其相關(guān)機(jī)理正亟待研究。

本文應(yīng)用斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育形態(tài)學(xué)得分系統(tǒng)(GMS)研究阿曼原油(WAF)和經(jīng)GM-2化學(xué)濃縮型溢油分散劑處理的阿曼原油(CEWAF)暴露對(duì)斑馬魚(yú)胚胎—幼魚(yú)的形態(tài)學(xué)發(fā)育影響。Perrichon等[18]在研究不同油種暴露對(duì)斑馬魚(yú)胚胎早期發(fā)育的影響時(shí)指出，油類(lèi)暴露能夠顯著延遲胚胎孵化，導(dǎo)致部分發(fā)育停滯或畸形，高濃度時(shí)會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的急性死亡。而本試驗(yàn)結(jié)果中，WAF和CEWAF暴露均會(huì)在不同程度上延遲斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育和器官形成，更會(huì)顯著地延遲胚胎孵化甚至造成胚胎不孵化；同時(shí)，阿曼原油還具有較強(qiáng)的致畸性，主要表現(xiàn)為心包水腫、背部彎曲和尾部彎曲等；而通過(guò)GMS系統(tǒng)，本試驗(yàn)定量評(píng)估了油類(lèi)暴露對(duì)形態(tài)發(fā)育的影響，其影響主要表現(xiàn)在魚(yú)鰾缺失、心率異常、血液循環(huán)停滯和行動(dòng)(胸鰭擺動(dòng)、尾部擺動(dòng)和游動(dòng)等)遲緩。試驗(yàn)結(jié)果顯示油暴露能夠顯著地造成胚胎心包水腫、心率異常，這與Perrichon等[18]和Adeyemo等[19]的研究結(jié)果相近；油類(lèi)污染能夠顯著持久性地?fù)p害魚(yú)類(lèi)胚胎的心臟功能[18,20]，最直接體現(xiàn)是心跳異常和血液循環(huán)衰竭甚至停滯，引起魚(yú)體供養(yǎng)不足，進(jìn)而導(dǎo)致軀體和器官的延遲發(fā)育。

本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)阿曼原油暴露能夠誘使斑馬魚(yú)魚(yú)鰾缺失；魚(yú)鰾作為大多數(shù)硬骨魚(yú)類(lèi)的重要功能器官，具有調(diào)節(jié)浮力保持身體平衡等生理功能[21-22]；近年來(lái)有關(guān)化學(xué)污染物(如消毒劑、聯(lián)苯類(lèi)、除草劑等)暴露能夠使硬骨魚(yú)類(lèi)的魚(yú)鰾出現(xiàn)發(fā)育異常甚至缺失等毒性效應(yīng)的報(bào)道越來(lái)越多[22-24]。魚(yú)鰾的缺失會(huì)導(dǎo)致其無(wú)法正常發(fā)揮生理學(xué)功能，最直接是對(duì)行動(dòng)方面的影響，進(jìn)而使得幼魚(yú)游動(dòng)能力下降甚至喪失游動(dòng)能力；在本試驗(yàn)中也觀察到油暴露能夠使得斑馬魚(yú)幼魚(yú)行動(dòng)變遲緩或無(wú)游動(dòng)行為。因此，魚(yú)鰾的未充氣或缺失可作為評(píng)價(jià)水體中油類(lèi)污染引起大多數(shù)硬骨魚(yú)類(lèi)形態(tài)學(xué)發(fā)育毒性的重要指標(biāo)之一。而斑馬魚(yú)一般形態(tài)學(xué)得分系統(tǒng)(GMS)可用于溢油應(yīng)急措施中使用GM-2濃縮型溢油分散劑對(duì)斑馬魚(yú)造成的長(zhǎng)期效應(yīng)的早期指示。

相較于WAF和GM-2，CEWAF暴露出現(xiàn)更嚴(yán)重的致死毒性；暴露至120 hpf時(shí)CEWAF對(duì)斑馬魚(yú)胚胎半數(shù)致死濃度LC50為153.318 mg·L-1(38.9% CEWAF)。本實(shí)驗(yàn)中GM-2單獨(dú)暴露時(shí)因其致死率、孵化率、致畸率和GMS得分均與空白對(duì)照接近，無(wú)顯著差異，證明了其本身對(duì)斑馬魚(yú)胚胎是無(wú)毒或低毒的(或毒性不足以產(chǎn)生顯著不利影響)。加入GM-2溢油分散劑加速了阿曼原油進(jìn)入水體，增加了水體中總石油烴(TPH)的濃度，增大了斑馬魚(yú)胚胎對(duì)阿曼原油的生物利用度，進(jìn)而產(chǎn)生更高形態(tài)發(fā)育毒性效應(yīng)[6,9,25]。同時(shí)，本研究為進(jìn)一步研究魚(yú)類(lèi)暴露于原油污染水體的生物敏感性和影響性提供基礎(chǔ)。為更深入地評(píng)估油類(lèi)暴露對(duì)魚(yú)類(lèi)早期生命階段和其生命周期發(fā)育的不利影響，下一步的研究應(yīng)集中于生理學(xué)、行為學(xué)的功能變化及誘導(dǎo)這些變化的分子機(jī)制。

[1] Page G W, Carter H R, Ford R G. Numbers of seabirds killed or debilitated in the 1986 Apex Houston oil spill in central California [J]. Studies in Avian Biology, 1990, 14:164-174

[2] Henkel J R, Sigel B J, Taylor C M. Large-scale impacts of the Deepwater Horizon oil spill: Can local disturbance affect distant ecosystems through migratory shorebirds? [J]. BioScience, 2012, 62(7): 676-685

[3] Neuparth T, Moreira S M, Santos M M, et al. Review of oil and HNS accidental spills in Europe: Identifying major environmental monitoring gaps and drawing priorities [J]. Marine Pollution Bulletin, 2012, 64(6): 1085-1095

[4] Murphy S M, Day R H, Wiens J A, et al. Effects of the Exxon Valdez oil spill on birds: Comparisons of pre- and post-spill surveys in Prince William Sound, Alaska [J]. Condor, 1997, 99(2): 299-313

[5] Anink P J, Hunt D R, Roberts D E, et al. Oil spill in Botany Bay: Short term effects and long term implications [J]. Wetlands Australia Journal, 2010, 5(1): 32-41

[6] Prince R C. Oil spill dispersants: Boon or bane? [J]. Environmental Science & Technology, 2015, 49(11): 6376-6384

[7] Jomaa B, Hermsen S A, Kessels M Y, et al. Developmental toxicity of thyroid-active compounds in a zebrafish embryotoxicity test [J]. Altex, 2014, 31(3): 303-317

[8] Russel M, Holcomb J, Berkner A. 30-years of oiled wildlife responses statistics [C]. Hamburg, Germany: 7th International Effects of Oil and Wildlife Conference, 2003

[9] Judson R S, Martin M T, Reif D M, et al. Analysis of eight oil spill dispersants using rapid, in vitro tests for endocrine and other biological activity [J]. Environmental Science & Technology, 2010, 44(15): 5979-5985

[10] Hermsen S A B, Brandhof E J V D, Ven L T M V, et al. Relative embryotoxicity of two classes of chemicals in a modified zebrafish embryotoxicity test and comparison with their in vivo potencies [J]. Toxicology in Vitro, 2011, 25(3): 745-753

[11] Mauch T J, Schoenwolf G C. Developmental Biology. Sixth Edition. By Scott F. Gilbert [J]. American Journal of Medical Genetics, 2001, 99(2): 170-171

[12] Kimmel C B, Ballard W W, Kimmel S R, et al. Stages of embryonic development of the zebrafish [J]. Developmental Dynamics, 1995, 203(3): 253-310

[13] Delvecchio C, Tiefenbach J, Krause H M. The zebrafish: A powerful platform for in vivo, HTS drug discovery [J]. Assay & Drug Development Technologies, 2011, 9(4):354-361

[14] Organization for Economic Co-operation and Development. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals 236—Fish Embryo Acute Toxicity (FET) Test [R]. Paris: OECD, 2013

[15] Singer M M, Aurand D, Bragin G E, et al. Standardization of the preparation and quantitation of water-accommodated fractions of petroleum for toxicity testing [J]. Marine Pollution Bulletin, 2000, 40(11): 1007-1016

[16] International Organization for Standard. Water quality. Determination of the acute lethal toxicity of substances to a freshwater fish (Brachydanio rerio Hamilton-Buchanan (Teleostei, Cyprinidae)). Pt. 1: Static method.-Pt. 2: Semi-static method.-Pt. 3: Flow-through method. 2nd.ed. [R]. Geneva: ISO, 1996

[17] 國(guó)家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局. GB 17378.7—1998, 海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范. 第4部分, 海水分析[S]. 北京: 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2007: 44-45

General Administration of Quality Supervision,Inspection and Quarantine of the People's Republic of China. GB 17378.7-1998, The specification for marine monitoring. Part 4: Seawater analysis [S] Beijing: Standards Press of China, 2007: 44-45 (in Chinese)

[18] Perrichon P, Le M K, Akcha F, et al. Toxicity assessment of water-accommodated fractions from two different oils using a zebrafish (Danio rerio) embryo-larval bioassay with a multilevel approach [J]. Science of the Total Environment, 2016, 568: 952-966

[19] Adeyemo O K, Kroll K J, Denslow N D. Developmental abnormalities and differential expression of genes induced in oil and dispersant exposed Menidia beryllina embryos [J]. Aquatic Toxicology, 2015, 168: 60-71

[20] González-Doncel M, González L, Fernández-Torija C, et al. Toxic effects of an oil spill on fish early life stages may not be exclusively associated to PAHs: Studies with Prestige oil and medaka (Oryzias latipes) [J]. Aquatic Toxicology, 2008, 87(4): 280-288

[21] Yamashita M. Apoptosis in zebrafish development [J]. Comparative Biochemistry & Physiology Part B Biochemistry & Molecular Biology, 2003, 136(4): 731-742

[22] 韓建, 何秋霞, 韓利文, 等. 化學(xué)污染物對(duì)魚(yú)鰾的毒理學(xué)研究進(jìn)展[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào), 2016, 11(6): 37-43

Han J, He Q X, Han L W, et al. Review on toxicology of chemical pollutants on fish swimbladder [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(6): 37-43 (in Chinese)

[23] Sanabria C, Diamant A, Zilberg D. Effects of commonly used disinfectants and temperature on swim bladder non-inflation in freshwater angelfish, Pterophyllum scalare (Lichtenstein) [J]. Aquaculture, 2009, 292(3-4): 158-165

[24] J?nsson M E, Kubota A, Timmelaragy A R, et al. Ahr2-dependence of PCB126 effects on the swim bladder in relation to expression of CYP1 and cox-2 genes in developing zebrafish [J]. Toxicology & Applied Pharmacology, 2012, 265(2): 166-174

[25] Gardiner W W, Word J Q, Word J D, et al. The acute toxicity of chemically and physically dispersed crude oil to key arctic species under arctic conditions during the open water season [J]. Environmental Toxicology & Chemistry, 2013, 32(10): 2284-2300