常用殺菌劑對啶蟲脒中華蜜蜂毒性潛在增效作用研究

韓文素，任承才，高景林，齊幫亞，王釋婕，趙珊，鐘義海，趙冬香,*

1. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護研究所，?？?571101 2. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，保定 071000 3. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜂業(yè)技術(shù)研究中心，海口 571101 4. 海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院，海口 570228

蜜蜂是自然界最主要的授粉昆蟲，蜜蜂授粉每年給中國的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)貢獻3 042.20億元，相當于全國農(nóng)業(yè)總產(chǎn)值的12.30%，全國農(nóng)林牧漁總產(chǎn)值的6.18%[1]。中華蜜蜂(Apis cerana cerana)是我國主要授粉昆蟲之一，在維持我國農(nóng)業(yè)經(jīng)濟發(fā)展和生態(tài)平衡方面發(fā)揮著重要作用[2]。近年來，全球范圍內(nèi)蜜蜂數(shù)量的驟減引起了業(yè)界的廣泛關(guān)注。中華蜜蜂在我國的分布區(qū)域和種群數(shù)量也顯著減少，致使一些植物授粉總量減少，生物多樣性降低[3]。

蜜蜂農(nóng)藥中毒的發(fā)生，是當前野生蜂和人工飼養(yǎng)蜜蜂種群面臨的嚴峻問題。由于全球氣候變暖，農(nóng)業(yè)集約化種植，農(nóng)作物病蟲害發(fā)生日趨嚴重，從而化學(xué)農(nóng)藥的施用更加頻繁。農(nóng)戶常常在作物不同生長期噴施不同藥劑，或為了節(jié)省時間、勞力將多種藥劑混在一起施用[4]。在此環(huán)境條件下，蜜蜂可能先后或同時暴露在多種農(nóng)藥的威脅中。殺菌劑是蜜蜂和其他傳粉昆蟲最常接觸的一類化合物，因殺菌劑通常施用在蜜源植物的盛花期，而這類作物對采集蜂具有極高的吸引力[5]。因此采集蜂有可能將殺菌劑污染的花粉、花蜜帶回蜂巢，危害幼蟲的存活[6-7]。一些殺菌劑在環(huán)境中相當穩(wěn)定，在蜂房花粉和蜂蠟中常常檢測到高殘留的殺菌劑[8]。

新煙堿類殺蟲劑具有內(nèi)吸性、高選擇性，是近年來發(fā)展最快、使用最為廣泛的一類殺蟲劑。其施藥方式多樣，可用于噴霧、種子處理、撒施、溝施、穴施和投放。但研究表明，大多數(shù)新煙堿類殺蟲劑對蜜蜂高毒，納克級甚至更低水平即會對蜜蜂產(chǎn)生影響[9-12]，除急性死亡外，還可導(dǎo)致亞致死效應(yīng)，如引起蜜蜂運動性能紊亂，干擾蜜蜂神經(jīng)系統(tǒng)，影響生長發(fā)育和繁殖，損害記憶和學(xué)習(xí)能力以及采集和歸巢能力等[9, 12-15]。由于具有內(nèi)吸性，新煙堿類殺蟲劑可被植株轉(zhuǎn)運到植物的花粉、花蜜和吐水液中[16-17]。當作物上噴灑殺菌劑時，蜜蜂也會暴露于新煙堿和殺菌劑的混合物中。

啶蟲脒屬氯化新煙堿類化合物，對蜜蜂毒性為中毒[18-19]，被廣泛應(yīng)用于果園、菜地、棉田等經(jīng)濟作物。由于啶蟲脒的相對“友好”(對蜜蜂急性毒性較低)，導(dǎo)致了其更加寬泛的使用標準，如允許在作物花期使用等[20]。Tong等[21]在對54份花粉樣品的檢測中檢測到8份含有啶蟲脒殘留，最高劑量為63.60 ng·g-1，點滴10 μg·bee-1的氟菌唑、丙環(huán)唑能分別提高啶蟲脒對意大利蜜蜂的毒性至244倍和105倍[22]，這意味著花粉、花蜜中殘留極低的氯化新煙堿類藥劑，若再噴灑殺菌劑，極有可能對蜜蜂產(chǎn)生毒性影響。研究證實，麥角甾醇合成抑制劑(ergosterol biosynthesis inhibitor, EBI)類殺菌劑能夠提高部分新煙堿類殺蟲劑對蜜蜂的毒性[22-23]。Thompson認為，接觸田間實際暴露劑量的戊唑醇與噻蟲嗪混劑、氟硅唑與噻蟲嗪混劑分別使噻蟲嗪對意大利蜜蜂的毒性增效2.6倍和2.3倍；攝入田間實際暴露劑量的戊唑醇和噻蟲胺混劑，使噻蟲胺對意大利蜜蜂的毒性增效1.9倍[24]。

在作物授粉生產(chǎn)實踐中，常常有蜜蜂中毒事件的發(fā)生，而啶蟲脒和各種殺菌劑往往在作物花期也會使用，基于此，本文在實際調(diào)查的基礎(chǔ)上，研究了幾種常用殺菌劑的實際暴露量對啶蟲脒的中華蜜蜂毒性潛在增效作用，為更好地了解農(nóng)藥對授粉蜜蜂的影響，進一步指導(dǎo)花期合理使用農(nóng)藥奠定必要基礎(chǔ)。

1 材料與方法 (Materials and methods)

1.1 試驗材料

供試昆蟲：健康成年的中華蜜蜂蜂群，來源于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護研究所試驗蜂場(N19°32'，E109°32')。供試蜜蜂在試驗當天清晨收集，要求為健康、大小一致的個體。

供試藥劑：98.2%啶蟲脒原藥、97%咪鮮胺原藥、95.1%氟硅唑原藥、97%吡唑醚菌酯原藥、96.2%腈菌唑原藥、96%苯醚甲環(huán)唑原藥、95%三唑酮原藥、96%嘧菌酯原藥、95.6%己唑醇原藥、95%丙環(huán)唑原藥、97.1%戊唑醇原藥，均由海南博士威農(nóng)用化學(xué)有限公司提供。

供試試劑：75%乙醇、丙酮均為化學(xué)純，購自廣州化學(xué)試劑廠，蔗糖購自海南椰威糖業(yè)有限公司。

所需儀器設(shè)備：試驗蜂籠(13 cm × 6 cm × 10 cm的長方體鋼盒，正面為玻璃板，頂部有飼喂口，底部有通風(fēng)口)，TLE204E電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)，BILON-XH-D渦旋混勻器(上海比朗儀器制造有限公司)，自制人工氣候室(面積3.8 m2)。

試驗條件：溫度(27 ± 1) ℃、相對濕度50%～70%、黑暗條件。

1.2 試驗方法

據(jù)Koch和Wei?er[25]報道，法色草田間噴灑20 g tracer·ha-1熒光素鈉，測得蜜蜂體內(nèi)最大殘留量為35.77 ng·bee-1。因此本試驗根據(jù)每種殺菌劑的田間最大推薦劑量，按照上述文獻計算出每種殺菌劑每只蜜蜂的實際暴露劑量(表1)。然后參照《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則》第10部分：農(nóng)藥對蜜蜂急性毒性試驗(GB/T 31270.10—2014)[26]，采用接觸法和攝入法測定啶蟲脒、殺菌劑+啶蟲脒對蜜蜂的接觸毒性和經(jīng)口毒性，比較殺菌劑存在情況下啶蟲脒對中華蜜蜂的LD50與啶蟲脒單獨對中華蜜蜂的LD50，以確定增效比。

表1 試驗殺菌劑及每只蜜蜂實際接觸劑量Table 1 The test fungicides and the realistic exposure dose per bee

1.2.1 急性接觸毒性

分別測定啶蟲脒、殺菌劑+啶蟲脒對中華蜜蜂的急性接觸毒性?？疾鞖⒕鷦︵はx脒協(xié)同增效的急性接觸毒性時，為了使殺菌劑充分進入蜜蜂體內(nèi)，最大限度地抑制殺蟲劑代謝[22]，點滴啶蟲脒前先點滴殺菌劑。過程如下：

在預(yù)實驗濃度的基礎(chǔ)上，分別用丙酮將啶蟲脒配制成5～7個系列濃度藥液(級差小于2.2)，將供試殺菌劑配制成所用濃度。實驗前，將配制好的藥液充分渦旋混勻。將度過適應(yīng)期的蜜蜂用冰箱低溫麻醉(約2 min)后，迅速用移液器點滴1 μL所試殺菌劑在蜜蜂的中胸背板處，對照點滴1 μL丙酮，蜂身晾干后轉(zhuǎn)入塑料杯。待蜜蜂完全蘇醒后，再次低溫麻醉，分別點滴1 μL各濃度啶蟲脒藥液，對照再次點滴1 μL丙酮。待藥液晾干后轉(zhuǎn)入試驗籠中，用脫脂棉浸50%蔗糖溶液飼喂。只考察啶蟲脒的急性接觸毒性時，僅點滴1 μL各濃度啶蟲脒藥液。每個處理3次重復(fù)，每個重復(fù)10只蜜蜂。

1.2.2 急性經(jīng)口毒性

分別測定啶蟲脒、殺菌劑+啶蟲脒對中華蜜蜂的急性經(jīng)口毒性。在預(yù)實驗濃度基礎(chǔ)上，分別用50%的蔗糖水溶液將啶蟲脒溶解并配制成5～7個系列濃度藥液(級差小于2.2)，將供試殺菌劑配制成一定濃度。實驗前，分別將殺菌劑藥液與不同濃度啶蟲脒藥液混合成所需濃度，并充分渦旋混勻。將度過適應(yīng)期的蜜蜂用冰箱低溫麻醉(約2 min)后，放入試驗籠中饑餓2 h，然后飼喂200 μL不同濃度藥液。只考察啶蟲脒的急性經(jīng)口毒性時，僅飼喂200 μL不同濃度啶蟲脒藥液。一旦藥液消耗完(通常需要3～4 h，最多延長至6 h)，將飼喂器取出，換用不含藥劑的蔗糖水溶液進行飼喂(不限量)，并對每組藥液的消耗量進行測定。同時設(shè)空白對照(50%蔗糖水溶液)，每個處理設(shè)3次重復(fù)，每個重復(fù)10只蜜蜂。

1.2.3 蜜蜂中毒癥狀及死亡數(shù)考察

于試驗開始后24 h和48 h，分別觀察和記錄蜜蜂死亡數(shù)、中毒癥狀。用毛筆輕觸中毒蜜蜂，蜜蜂不能運動即視為死亡。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)試驗期間死亡數(shù)及死亡時間，采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，得到LD50和95%置信限。計算殺菌劑+啶蟲脒與單獨使用啶蟲脒之間的毒性關(guān)系(即毒性倍數(shù)：殺菌劑的協(xié)同增效毒性倍數(shù)=啶蟲脒的LD50值/殺菌劑+啶蟲脒的LD50值)。

1.2.5 毒性等級劃分標準

參照我國《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則》第10部分[26]，將農(nóng)藥對蜜蜂的急性毒性共分為4個等級：(1) LD50≤ 0.001 μg a.i.bee-1，為劇毒；(2) 0.001 μg a.i.bee-1﹤LD50≤ 2.0 μg a.i.bee-1，為高毒；(3) 2.0 μg a.i.bee-1﹤LD50≤11.0 μg a.i.bee-1，為中毒；(4) LD50﹥11.0 μg a.i.bee-1，為低毒。

2 結(jié)果與分析(Results and analysis)

2.1 啶蟲脒對中華蜜蜂的毒力

啶蟲脒單獨對中華蜜蜂的24 h、48 h接觸毒性分別為4.499和2.484 μgbee-1(表2)；啶蟲脒單獨對中華蜜蜂的24 h、48 h經(jīng)口毒性分別為3.208和1.418 μgbee-1(表3)。按照農(nóng)藥對蜜蜂的毒性分級標準，啶蟲脒對中華蜜蜂的接觸毒性為中毒，48 h后的攝入毒性為高毒。

2.2 殺菌劑對接觸毒性的增效作用

從表2可以看出，以田間實際暴露的殺菌劑劑量預(yù)處理中華蜜蜂，各殺菌劑對啶蟲脒的毒性均有不同程度的增加。其中咪鮮胺使啶蟲脒的24 h毒性提高14.02倍，48 h后提高8.01倍；丙環(huán)唑使啶蟲脒的24 h毒性提高10.74倍，48 h后提高10.14倍；戊唑醇使啶蟲脒的24 h毒性提高7.92倍，48 h后提高7.09倍；腈菌唑使啶蟲脒的24 h毒性提高8.50倍，48 h后提高4.80倍。毒性增加最小的為氟硅唑，24 h提高2.67倍，48 h后提高1.49倍。48 h后啶蟲脒對中華蜜蜂的接觸毒性LD50均﹤2.0 μg a.i.bee-1，根據(jù)農(nóng)藥對蜜蜂的急性毒性分級標準，在接觸殺菌劑的條件下，啶蟲脒的毒性演變?yōu)楦叨尽８鶕?jù)48 h的毒性增加倍數(shù)，殺菌劑增效的潛力依次為：丙環(huán)唑 > 咪鮮胺 > 戊唑醇 > 腈菌唑 > 己唑醇 > 吡唑醚菌酯 > 苯醚甲環(huán)唑 > 嘧菌酯 > 三唑酮 > 氟硅唑。

2.3 殺菌劑對經(jīng)口毒性的增效作用

從表3可以看出，中華蜜蜂攝入實際暴露劑量的殺菌劑和啶蟲脒混劑，啶蟲脒的毒性具有一定程度的增加。處理24 h后，丙環(huán)唑?qū)︵はx脒的協(xié)同增效水平最高，為3.62倍，其次為氟硅唑，毒性增加2.46倍，且LD50的置信區(qū)間無重疊。處理48 h后，氟硅唑使啶蟲脒的毒性提高到2.81倍，嘧菌酯使啶蟲脒的毒性提高2.58倍，且LD50的95%置信區(qū)間無重疊。增效最不明顯的為戊唑醇，其次為己唑醇，LD50的95%置信區(qū)間明顯重疊。

表2 啶蟲脒及啶蟲脒與殺菌劑聯(lián)合對中華蜜蜂的接觸毒性Table 2 Contact toxicities of acetamiprid and its fungicides combinations on Apis cerana cerana

表3 啶蟲脒及啶蟲脒與殺菌劑聯(lián)合對中華蜜蜂的經(jīng)口毒性Table 3 Oral toxicities of acetamiprid and its fungicides combinations on Apis cerana cerana

3 討論(Discussion)

新煙堿類殺蟲劑對蜜蜂存在較高的毒性和風(fēng)險性，歐盟委員會2013年初禁止吡蟲啉、噻蟲嗪和噻蟲胺在玉米、油菜、向日葵和棉花上使用[27]。啶蟲脒對西方蜜蜂的急性毒性較低(對意大利蜜蜂急性經(jīng)口毒性LD50為15～17 μgbee-1，急性接觸毒性LD50為8.1～39 μgbee-1)[20]，因此其使用標準比較寬泛。本文研究表明，啶蟲脒對中華蜜蜂的急性接觸毒性為2.484 μgbee-1(48 h)，為中毒；急性經(jīng)口毒性為1.418 μgbee-1(48 h)，為高毒。文獻研究表明，啶蟲脒對意大利蜜蜂的急性接觸毒性LD50為8.22 μgbee-1，急性經(jīng)口毒性LD50為6.34 μgbee-1[28]?？梢?，蜜蜂遺傳背景不同，對藥劑的敏感性不同，中華蜜蜂相對于意大利蜜蜂對藥劑更加敏感。

農(nóng)藥的混合物普遍存在于開花作物及其附近的野花上[29]，在蜂體及蜂產(chǎn)品檢測中也經(jīng)常發(fā)現(xiàn)各類殺蟲劑和殺菌劑[8,21]，而蜜蜂花粉和熊蜂花粉中發(fā)現(xiàn)最多的農(nóng)藥是殺菌劑[29]。雖然殺菌劑一般對蜜蜂低毒[30]，但近年研究發(fā)現(xiàn)，田間噴灑最大推薦劑量的商品制劑Pristine(12.8%吡唑醚菌酯和25.2%啶酰菌胺混劑)，會干擾雌性獨棲蜂壁蜂(Osmia lignaria)和切葉蜂(Megachile rotundata)的巢識別能力[31]。本課題組研究表明，亞致死劑量腈菌唑會影響中華蜜蜂的呼吸和P450酶活性(數(shù)據(jù)另文發(fā)表)。殺菌劑與殺蟲劑結(jié)合，會產(chǎn)生不同程度的協(xié)同效應(yīng)，例如，點滴10 μgbee-1的氟菌唑，能夠使噻蟲啉對意蜂的急性毒性提升1 141倍[22]；點滴3 μgbee-1咪鮮胺、丙環(huán)唑、腈苯唑、葉菌唑、腈菌唑使氟胺氰菊酯的毒性提高12～74倍[23]。

目前，農(nóng)藥對蜜蜂毒性影響的爭論關(guān)鍵點即為蜜蜂在田間可能的暴露劑量。由于很多實驗室和半田間研究使用了不切實際的高劑量農(nóng)藥，導(dǎo)致研究結(jié)果被摒棄[29]。因此本研究采用蜜蜂在田間可能的最大暴露殺菌劑劑量來測定不同殺菌劑對啶蟲脒的協(xié)同效應(yīng)，結(jié)果表明，先點滴殺菌劑后，所有供試殺菌劑均使啶蟲脒的毒性不同程度的增加；不同殺菌劑與啶蟲脒混用，丙環(huán)唑、咪鮮胺、戊唑醇、腈菌唑使啶蟲脒的毒性增加。丙環(huán)唑、戊唑醇、腈菌唑為三唑類脫甲基抑制劑，咪鮮胺為咪唑類脫甲基抑制劑，均屬于麥角甾醇生物合成抑制劑。這類殺菌劑通過抑制病菌麥角甾醇的生物合成，從而破壞細胞膜的功能，導(dǎo)致細胞死亡[32]，其增效機理為通過抑制細胞色素P450解毒活性從而提高殺蟲劑的毒性[23]。

本試驗結(jié)果表明，作物花期噴施啶蟲脒和殺菌劑(尤其是唑類殺菌劑丙環(huán)唑、咪鮮胺、戊唑醇、腈菌唑等)對中華蜜蜂采集蜂產(chǎn)生較高的毒性和風(fēng)險性。因此在生產(chǎn)實踐中用藥時應(yīng)避免這幾種殺菌劑與啶蟲脒混和噴施以及相隔很短時間前后施用。作物花粉花蜜中殘存的亞致死劑量新煙堿類殺蟲劑與殺菌劑混合是否影響采集蜂的生理、行為和授粉效率，有待進一步研究。

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